应用多电极阵列评价内分泌干扰物对脊椎动物神经网络功能发育的影响

下面给出的协议已经标准化, 以测试 BPA 暴露在 (早期) 胚胎发生期间的影响, 并可能被修改, 用于与 BPS, BPF, 或其他在小鸡胚胎神经元的 EDC。 该议定书遵循特拉华州立大学的体制政策和国家卫生研究院关于禽类胚胎的政策。《议定书》还确认了争端谅解书的材料和化学品安全准则。 1. 材料设置 将 BPA (m.w. 228.29) 溶于水中10% 乙醇 (v/v), 使1毫米的库存溶液 (0.23 毫克每毫升10% 乙醇)。在µM 介质中进行后续稀释 (0.1 µM、0.5 µM、1µM、5µM 和 10 neurobasal)。注意: BPA 是一种环境毒素, 在处理粉末时应注意。 在37摄氏度的商用台式鸡蛋孵化器孵化小鸡卵。为 E7 胚胎孵化7天的卵。 准备多边环境协定. 用70% 乙醇浸泡3到4小时, 然后在 BSLII 罩中用大约10毫升的不育蒸馏水冲洗三次, 以杀菌所需的多边环境协定。注: 多边环境协定包含 8 x 8 网格中的64个纳米孔铂电极。电极直径为30µm, 电极间距为200µm。不要使用变性乙醇杀菌, 因为这将导致对多边环境协定的腐蚀。 将多边环境协定放在一个无菌容器内, 盖上 (以保持无菌条件), 并移动到工作台顶部孵化器。烘烤至少6小时在55°c。这一步骤对正确的灭菌至关重要, 温度不应超过摄氏60摄氏度。保持不孕, 将含有多边环境协定的碟子移至 BSLII 罩内存放, 直至进一步使用。注: 我们使用烤箱安全玻璃烤盘与塑料盖子和表面消毒它与70% 乙醇和地方在 BSLII 敞篷为烘干。 整除了额外的蜂窝矩阵 ECM 解决方案。解冻的瓶子在4°c 隔夜和冻结100µL 整除数在-20 摄氏度。注: ECM 已被发运冻结。ECM 不应该被带到室温, 直到它在室温下聚合, 一旦聚合, 就不可能涂上涂层。没有生长因子的 ECM 更倾向于防止由于未知因素造成的额外影响。 消毒所有解剖器械 (#5 钳、弯钳、小剪刀、弹簧剪刀) 和自密封材料, 涂上70% 乙醇, 让它们在解剖罩中干燥。 2. 鸡胚神经元培养与网络活动 电镀当天, 从-20 °c 冰箱中取出一小瓶 ECM, 用70% 乙醇喷雾, 然后放在冰上。在 BSLII 罩内加入300µL 冷 neurobasal 培养基稀释至25%。 使用 P200 pipetteman 将100µL 25% ECM 添加到多边环境协定中心, 注意不要触摸电极, 并立即去除表面上的薄膜。在 CO2孵化器 (37 ° C 和 5% CO2) 中覆盖多边环境协定和位置, 直到准备好对神经元进行板。 对 E7 卵的外壳进行消毒 (胚胎日 7, 在37摄氏度孵化7天), 70% 乙醇。将胚胎斩首成一个 Sylgard 的底部解剖皿, 含有冷不育的汉克平衡盐溶液 (HBSS) 而不含钙。切开眼睛, 去掉眼球。使用 #5 细钳和弹簧剪刀在腹侧进行切口, 去除外层皮肤, 露出前脑和视神经顶盖。仔细剥离和去除脑膜膜。将前脑转移到另一个培养皿中, 用弹簧剪刀把它切成2毫米的小块。注: 脑膜膜切除后, 前脑不应有任何血管附着。如果有的话, 最好是在无菌解剖罩进行解剖, 虽然我们取得了相当好的结果, 当解剖是在罩外进行, 只要仪器和解剖区彻底消毒70% 乙醇. 使用无菌转移吸管, 将前脑片收集到15毫升离心管中, 并在让前脑片下沉到离心管底部后尽可能 HBSS。 添加1毫升0.05% 胰蛋白酶/EDTA (预热到37°c) 和孵化在37°c 15 分钟。 使用巴斯德吸管, 小心地去除胰蛋白酶, 不扰乱组织和添加1毫升 neurobasal 培养基。让组织的片断下沉到底部并且去除媒介。再重复一次这个洗涤。这一步是洗掉胰蛋白酶/EDTA。 加入2毫升的 neurobasal 培养基, 开始研制过程。研磨包括服用无菌的火抛光的巴斯德吸管, 并通过它轻轻地通过它几次, 直到没有更多的组织被看到。如果在反复传球后留下任何碎片, 只要让它们沉淀到底部即可。注: 避免起泡, 而研制过程-如果泡沫形成, 停止和消除的愿望。 用 neurobasal 培养基稀释重悬浮细胞 1:10, 用台盼蓝染料和 hemocytometer 计数活细胞。在0.5 毫升离心管中混合50µL 的稀释细胞与50µL 的台盼蓝溶液。添加10µL 到 hemacytometer 后放置在盖玻片和计数明亮的透明细胞 (蓝色细胞死了, 不应该计数)。注意: 从单个 E7 光学顶盖的典型细胞数介于1和 5 x 10 7 细胞/mL 之间. 将 ECM 上的离解细胞涂在2200细胞/平方毫米的密度上。对于我们的多边环境协定系统, 这相当于每个多边环境协定的大约13万个单元。添加 neurobasal 介质以将多边环境协定中的体积增加到1毫升, 并在 CO2孵化器中过夜以实现单元格附件和突起扩展 (图 1)。注意: 对于不同区域和电极数的多边环境, 可以尝试不同的细胞密度–一般情况下, 较高的细胞密度会导致网络活动的增加, 但也会导致更短的生存文化。 第二天, 添加 BPA 到最后浓度的10µM 在 neurobasal 培养基从1毫米的股票在步骤1.1 所处理的多边协定。对控制多边环境协定, 在水 (v/v) 溶液中加入相同体积的10% 乙醇。 每隔一天用含有10µM BPA 的 neurobasal 培养基替换所用介质, 直到7天的体外(7DIV) 和此后的每一天, 随着网络活动的增加。注意: 随着网络活动的增加, 新陈代谢活动增加, 媒体的变化需要更加频繁。不要让中号变成橙色。 3. 记录神经元网络活动 在购置日, 在录制前将培养基与新鲜的 neurobasal 培养基交换, 并将多边环境协定返回 CO2孵化器, 至少2小时。通过单击温度图标 (补充图 3.1a-b), 启动录制软件并将多边环境协定的温度设置为37°c。注: 记录可以早在3天开始电镀, 只要文化还活着就可以继续。 通过右键单击 “缪斯” 图标 (在左侧窗口面板中的 “流” 下), 然后选择 “添加处理” 和 “尖峰检测器”, 然后在弹出窗口中单击 “确定”, 设置采集参数。”尖峰探测器 (6 x STD)” 将出现在文件名下面 (补充图 3.2a b)。 下一步右击尖峰探测器, 选择 “添加处理” 和 “突发检测器”, 并在弹出窗口中单击 “确定”。”爆裂探测器” (ISI) 将出现在缪斯图标的下面 (补充图 3.3a-b)。 下一步右击突发检测器, 选择 “添加处理” 和 “神经统计编译器”。在弹出窗口中, 确保选择了文件头、聚合井统计信息和同步。单击 “确定”。”统计编译器” 将出现在下面 (补充图 3.4a-b)。注意: 这将设置自适应阈值交叉 (6x STD 过滤器), 100 毫秒之间的穗间间隔, 最小峰值为 5, 平均发射率检测在十年代, 同步参数为20毫秒, 最小穗速率为每分钟0.083333 个峰值。 通过单击底部的时钟图标, 设置录制时间为5分钟 (30万毫秒) 的定时录制。这是通过将设置节中的信息更改为每5.1 分钟记录一次并记录5分钟来实现的。这将立即启动, 并将执行一次 (补充图 3.5)。 在移动多边环境协定之前, 确保多边环境协定的温度达到37摄氏度。从孵化器中移除多边环境协定, 将其放在记录单元上, 并锁定协定。通过单击 “文件播放” 窗口中 “计划录制” 部分或 “记录” 图标中的 “开始” 记录, 开始记录网络活动。通常情况下, 记录时间为5分钟 (30万毫秒) 是足够的, 虽然可以获得长达10分钟的更长的记录。 录音后, 将多边环境协定归还孵化器。注意: 必须注意保持不孕, 并尽量减少环境协定在孵化器之外的时间。 4. 数据分析 对原始数据的分析可以使用记录软件离线进行。单击 “文件” 下拉菜单并打开录制。选择要分析的原始数据文件。重放原始录制以捕获所需的峰值参数。 为了获得峰值的平均数, 使用尖峰检测模块和获取同步索引, 使用神经统计编译器模块。 像以前一样加载峰值检测器、爆裂探测器和统计编译模块 (第3节)。 从尖峰检测器、爆裂探测器和统计编译器模块窗口中的下拉菜单中, 分别选择 “尖峰列表”、”网络突发列表” 和 “高级度量”。 单击 “记录” 按钮开始录制将在定向文件夹中创建. csv 文件的数据文件。峰值参数 (峰值和同步索引的总数) 将记录在. csv 文件中。注意: 不建议在记录原始数据时进行实时分析, 因为这可能会消耗处理器时间和计算资源。