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Behavior

Un réseau sans fil, Interface bidirectionnelle pour In Vivo d’enregistrement et la Stimulation de l’activité neuronale en comportement librement des Rats

Published: November 07, 2017
doi:
10.3791/56299
, , , , , , , ,
1Behavioral Neuroscience, Experimental and Biological Psychology,Philipps-Universität Marburg, 2Behavioral Neurosciences Institute (INeC), 3Thomas RECORDING GmbH, 4Department of Neurophysics,Philipps-Universität Marburg

Summary

Un réseau sans fil, système bidirectionnel pour les neurones enregistrements multicanaux et la stimulation en comportement librement des rats est introduit. Le système est léger et compact, ayant ainsi un impact minimal sur le répertoire comportemental du animal´s. En outre, ce système bidirectionnel fournit un outil sophistiqué afin d’évaluer les relations causales entre les modèles d’activation de cerveau et le comportement.

Abstract

In vivo électrophysiologie est une technique puissante pour étudier la relation entre activité cérébrale et le comportement à l’échelle de la milliseconde et micromètre. Cependant, les méthodes actuelles s’appuient principalement sur les enregistrements de câble captif ou utilisent uniquement les systèmes unidirectionnels, permettant l’enregistrement ou la stimulation de l’activité neuronale, mais pas au même moment ou même cible. Ici, un nouveau réseau sans fil, dispositif bidirectionnel pour enregistrement multivoie simultané et la stimulation de l’activité neuronale en comportement librement des rats est décrite. Le système fonctionne grâce à une seule étape de tête portative qui transmet les activités enregistrées et peut être ciblée en temps réel pour la stimulation du cerveau en utilisant un logiciel multicanal axée sur la télémétrie. Le stade principal est équipé d’un préamplificateur et une batterie rechargeable, ce qui permet des enregistrements à long terme stables ou stimulation pour jusqu’à 1 h. ce qui est important, le stade tête est compact, pèse 12 g (batterie incluse) et a donc un impact minimal sur l’animal´s Répertoire comportemental, rendre la méthode applicable à un large éventail de tâches comportementales. En outre, la méthode a l’avantage majeur que l’effet de la stimulation cérébrale sur l’activité neuronale et le comportement peut être mesuré simultanément, fournissant un outil pour évaluer les relations causales entre l’activation des modes spécifiques du cerveau et le comportement. Cette caractéristique rend la méthode particulièrement utile pour le domaine de la stimulation cérébrale profonde, permettant l’évaluation précise, suivi et ajustement des paramètres de stimulation au cours d’expériences comportementales à long terme. L’applicabilité du système a été validée à l’aide du colliculus inférieur comme un modèle de structure.

Introduction

Une question fondamentale en neurosciences est une activité comment électrique dans les circuits neurones définies génère certaines formes de comportement. In vivo électrophysiologie est une technique puissante pour répondre à cette question, en fournissant un outil pour enregistrer ou stimuler l’activité électrique du cerveau, tandis que les animaux est exécuter certaines tâches comportementales. Cependant, les systèmes actuels dépendent fréquemment câble captif enregistrements1,2, probablement restreindre la mobilité et à prévenir pleine expression du répertoire comportemental animal´s. Par ailleurs, principalement les systèmes unidirectionnels sont utilisés, permettant un enregistrement3,4,stimulation de5 ou6,7 de l’activité neuronale, mais ne pas au même moment ou même cible, ce qui en fait difficile de démêler les relations causales entre l’activation des modes spécifiques du cerveau et le comportement. Seulement quelques sans fil, systèmes bidirectionnels en vivo préparatifs sont actuellement disponibles. Cependant, elles sont généralement lourdes (40 à 50 g) et se composent de deux portables unités distinctes, c’est-à-dire une étape en tête et un sac à dos branché pour alimentation axée sur la batterie d’alimentation8,9,10, rendant moins flexible et augmentant le risque de déconnexion du câble par exemple pendant le toilettage de comportement. Aucun des systèmes sans fil susmentionnées offrent des unités de microélectrodes implantable pour capter un concept intégré complet de l’activité neuronale au cours de comportement éthologique valide complet haute reproductibilité des conditions expérimentales.

Ici, un nouveau réseau sans fil, dispositif bidirectionnel pour les enregistrements de in vivo et la stimulation de l’activité neuronale en comportement librement des rats est introduit. Le système de Wireless Thomas (TWS) opère à travers une seule amovible tête phase qui peut transmettre l’activité multicanal en utilisant jusqu’à quatre canaux d’enregistrement indépendant et peut être ciblée pour la stimulation électrique cérébrale en temps réel. En outre, une unité de microélectrodes implantable chroniquement compatible avec le SSC a été développée qui permet la stimulation neurale et enregistrement. Une interface utilisateur graphique du logiciel TWS, d’enregistrement et de la stimulation est également présentée. Cette étude décrit l’implémentation de validation et in vivo de l’ensemble du dispositif.

Afin de valider le système SSC le colliculus inférieur a été choisi comme une structure neurale cible car une réponse comportementale manifeste peut être provoquée par sa stimulation électrique. Il est bien connu que la stimulation électrique du colliculus inférieur provoque inconditionnées « peur-like » réponses comportementales chez les rats, comme vivacité d’esprit, des postures sur le côté, courbement du dos, gel et comportement de fuite (vol). Ce modèle de réponse imite des réactions de crainte évoquée par les problèmes environnementaux, comme un fait dommageable perçue, l’attaque ou la menace pour la survie de12,11,13. On a supposé que l’être capable de susciter un tel comportement clair et non équivoque fournirait un véritable défi à la SSC.

Protocol

tous les protocoles et les expériences ont été conformément aux directives européennes actuelles (2010/63/UE) et approuvé par les autorités régionales (Regierungspräsidium Gießen, MR 20/35 Nr.25/2015). 1. animaux maison adultes rats Wistar mâles (200-250 g) par groupes de 3-4 au moins une semaine avant la chirurgie afin de permettre l’acclimatation à des conditions de laboratoire standard. Deux jours après la chirurgie, des rats de maison par paires. Couvrir les cages unique avec couvercle acrylique haute. Éviter les couvercles conventionnels en grille métallique puisque les implants peuvent se coincer, augmentant le risque qu’ils deviennent endommagée et/ou instable pendant la durée du. 2. La chirurgie stéréotaxique avant de commencer l’intervention, organiser et préparer les équipements et matériaux suivants : obtenir du matériel chirurgical stérile composé de ciseaux stériles, émoussé-fin forceps, spatules, chirurgicales coupe-ongles, fraise dentaire et coton bourgeons. obtenir des médicaments et substances chimiques, y compris l’isoflurane, xylocaïne, chlorhydrate de tramadol, salve d’oeil dexpantenol, peroxyde d’hydrogène 3 %, povidone iode et 70 % éthanol. Obtenir du matériel de fixation y compris les vis en acier inoxydable, résine acrylique, colle UV et protecteur de la cap. Obtenir une unité de la microélectrode, consistant en (i) une seule électrode d’enregistrement (quartz verre isolé microélectrode platine tungstène, avec forme de la pointe conique, diamètre extérieur : 80 µm, pointe conique, impédance à 1 kHz : 500 kOhms) ou une tétrode (verre de quartz isolation platine/tungstène 4 cœurs avec des microélectrodes, diamètre extérieur : 100 µm, pointe conique, impédance à 1 kHz : 500-800 kOhm) ; (ii) une électrode de stimulation (fil de platine/iridium (90 % de platine, 10 % d’iridium), core diamètre 125µm, diamètre extérieur 150 µm, impédance < 10 kOhm) reliée à une plaque de contact et (iii) une électrode de référence de fil de platine (diamètre de l’arbre, 100 µm ; figure 1 a). Obtenir porte-électrodes collées avec de la colle soluble dans l’eau à l’unité de la microélectrode et testé pour une fonctionnalité au moins 2 h à l’avance ( Figure 1 b). Obtenir un système captif classique composé d’un préamplificateur différentiel, un amplificateur et un passe-bande filtre amplificateur pour enregistrements. Obtenir des éléments supplémentaires, tels que gants, chauffage pad, seringues et sérum physiologique. Obtenir les cages maison (L x l x h : 42 cm x 26 cm x 38 cm). Procédure Remarque : implantation d’électrode est effectuée pendant une chirurgie stéréotaxique conventionnelle sous anesthésie isoflurane. Faire en sorte que l’expérimentateur porte des gants, un masque chirurgical et blouse. Lancer anesthésie plaçant l’animal dans une chambre à induction (isoflurane 4 à 5 %, le débit d’oxygène 1 L/min, durée environ 5 min). Test de perte de réflexes (réflexes de queue et les orteils) avec une pince pour confirmer une anesthésie profonde. Placer la tête de l’animal dans un masque d’anesthésie fixé autour du bar de l’incisive supérieure du cadre stéréotaxique et ajuster l’anesthésie (isoflurane 2 à 3 %, débit d’oxygène 0,7 à 0,8 L/min). Difficulté et aligner horizontalement l’animal ' s la tête dans l’appareil stéréotaxique utilisant des barres d’oreilles et incisive supérieure barre Raser le champ opératoire à l’aide de tondeuses chirurgicales ou ciseaux et stériliser avec la povidone iodée. Placer l’animal sur un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie et de traiter les yeux avec dexpantenol salve d’oeil pour les empêcher de sécher. Injection de xylocaine (0,3 à 0,4 mL, par voie sous-cutanée, l.c.) dans le centre du champ chirurgical. Test pour la perte des réflexes encore. Faire une petite incision (1,5 cm) avec un scalpel au milieu du champ opératoire pour exposer le crâne. Séparer la peau doucement et retirer le tissu résiduel à l’aide de pinces, ciseaux et spatule. Nettoyer soigneusement le crâne à l’aide de peroxyde d’hydrogène-enduit cotons-tiges. Percer les 4-5 petits trous (4,7 mm) dans le crâne pour la fixation des vis en acier inoxydable. Le titulaire de la microélectrode unité/électrode au préamplificateur et fixez l’au micromanipulateur stéréotaxique ( Figure 1 b et 1C). Percer un trou (environ 7 mm) dans le crâne au-dessus de la zone cible en utilisant les coordonnées d’un atlas du cerveau selon l’animal utilisé. Dans la présente étude, les extrémités des électrodes qui vise le colliculus inférieur en utilisant les coordonnées suivantes, avec le bregma agissant comme la référence du poste : antérieur/postérieur, − 8,8 mm ; Medial/lateral, 1,5 mm ; et dorsale/ventrales, 3,5 mm 14. Absorber n’importe quel sang avec des cotons-tiges. Introduire verticalement l’unité microélectrode jusqu’à ce que la pointe de l’électrode atteint la zone cible. Placer le câble de terre le long des vis inox et sous la peau. Moniteur doper l’activité et soigneusement ajuster les électrodes avec micromanipulateur jusqu’à arriver à une zone de neurones actifs dans la structure cible et détecter l’activité neuronale avec un rapport signal-bruit adapté pour spike tri. Fixer l’unité microélectrode le crâne avec de la colle UV et couvrir la plaque de contact et les vis avec de la résine acrylique. Injecter de sérum physiologique (i.p. 1 mL) et le tramadol (25 mg/kg, s.c.) pour prévenir la déshydratation et assurer une analgésie post-opératoire, respectivement. Débranchez l’appareil de la microélectrode du porte-électrode à l’aide d’une brosse trempée dans l’eau. Stop anesthésie, retirez soigneusement rat du cadre stéréotaxique. Débranchez le préamplificateur de la microélectrode unité Se connecter à la protection de cap sur l’unité de la microélectrode implantée et débranchez-le uniquement pendant les procédures expérimentales. Garder les animaux en couples dans la maison-cage dès le deuxième jour après la chirurgie. Comportement animaux moniteur quotidiennes pour infection de la plaie possible, poids, état de santé et générales pour une période de 7 jours après la chirurgie. Après cette période de récupération, effectuer en vivo électrophysiologie et expériences comportementales. Remarque : L’intervention chirurgicale dure entre 60 à 90 min. Pendant la chirurgie, réflexes de coup de queue doivent être surveillées de façon continue et anesthésie ajusté, si nécessaire. 3. In Vivo Électrophysiologie équipement et la procédure Remarque : enregistrements électrophysiologiques et la stimulation sont effectuées à l’aide de la SSC. Obtenir une étape de tête avec un préamplificateur intégré et connecté à la batterie (canaux d’enregistrement quatre ; enregistrement plage d’entrée analogique : 0-12 mV crête à crête ; sortie de stimulation : ±625 µA ; L x l x h : 24 x 22 x 12 mm ; Poids : 6 g sans batterie, 12 g avec batterie ; batterie en cours d’exécution temps jusqu’à 1 h). Cette étape de tête est apte à être connecté directement à l’unité de la microélectrode implantée via un connecteur multipolaire miniature ( Figure 2). Obtenir une batterie (lithium ion batterie, 3,7-4,2 V DC, 230 mAh, 27 mm x 20 mm x 6 mm, temps de fonctionnement 1 h) monté sur le toit de la scène de tête ( Figure 2). Si nécessaire utiliser la batterie rechargeable de rechange avec une capacité de 450 mA pour le temps de fonctionnement environ 2,5 h. Veillez à ce qu’une lumière verte s’allume au stade de la tête alors que la batterie est branchée dessus. Obtenir un ARVA (émetteur-récepteur) connecté à un ordinateur via un port USB standard et permet un fonctionnement sans fil jusqu’à 5 m ( Figure 2E). Obtenir un ordinateur personnel avec le logiciel SSC pour la stimulation électrique et l’enregistrement de l’activité neuronale ( Figure 3 et Figure 4 ). Obtenir un préamplificateur captif et un système d’acquisition de données utilisé pendant l’intervention (voir point 2.1.5) pour les enregistrements et un générateur d’impulsion pour la stimulation, afin de comparer l’efficacité de la SSC en éveillé les rats une semaine après la chirurgie. Remarque : La stimulation électrique est fournie et extracellulaire activité de neurones individuels est consignée de la même unité de la microélectrode implantée en utilisant les deux systèmes. Les paramètres de stimulation (intensité du courant, pouls et fréquence) doivent être ajustées à chaque animal selon la région du cerveau ciblée. Dans la présente étude, un 150-250 µA, 2500 Hz courant a été utilisé pour stimuler le colliculus inférieur. Behavioral analyses Remarque : une fois qu’aucune barrière métallique n’est introduit entre le transmetteur et le stade tête animal, le SSC est applicable à un large éventail de tâches comportementales. Comme tests de comportements exemplaires, il a été utilisé dans le champ Ouvrir pour mesurage de l’activité générale du comportementale et sur l’élévation plus labyrinthe, un test standard pour évaluer le comportement de type anxiété dans rongeurs 15. Une caméra vidéo a été placée centralement au-dessus de plein champ et élevée plus le labyrinthe pour enregistrements comportements. Avant des tests comportementaux, gérer chaque animal sur trois jours consécutifs (5 min par jour). Avant chaque période de manutention connecter le stade tête avec la batterie à l’unité de la microélectrode implantée précédemment. N’effectuez aucun enregistrement ou stimulation pendant la manutention de. Plein champ Placer le rat au centre du champ ouvert (40 x 40 cm x 40 cm ; rouge clair ~ 30 Lux) et lui permettre d’explorer l’appareil pendant au moins 5 min sous enregistrement neuronal. Déterminer le seuil de l’évasion – intensité du courant minimal produisant en cours d’exécution ou en sautant. Dans la présente étude, offrir une stimulation de 2500 Hz haute fréquence (largeur d’impulsion : 100 µs ; intervalle de pulsation : 100 µs) pour le colliculus inférieur à intervalles de 1 min, augmentant l’intensité du courant de 20-50 µA étapes jusqu’à ce que les rats ont montré échappent comportement. Retourner le rat à sa cage maison, nettoyer le champ ouvert (solution d’acide acétique 0,1 %) et sécher it. Remarque : Afin de comparer l’efficacité de la stimulation de la TWS avec le traditionnel système captif la procédure décrite ci-dessus a été réalisée en utilisant les deux systèmes. Élevée plus labyrinthe Remarque : le labyrinthe en plus utilisé dans ces expériences a été fait d’acrylique gris et se composait de deux bras ouverts (50 cm long x 10 cm de large) et deux fermés bras (50 cm long x 10 cm de large, avec de hauts murs de 40 cm) que prolongée d’un pla Centre TForm élevée 50 cm au-dessus de l’ étage 16. Placer le rat dans le centre de la façade plus-labyrinthe vers un bras ouvert et lui permettre d’explorer librement l’appareil sous un enregistrement continu pendant 5 min. Enregistrer le nombre d’entrées dans, et le temps passé dans les bras ouverts et fermés sur une période de 5 min. Retourner le rat à sa cage maison, propre (solution d’acide acétique 0,1 %) et de sécher le labyrinthe avant chaque test. Perfusion et histologie anesthésier le rat avec xylazine/kétamine (150 mg/kg et 100 mg/kg, respectivement ; i.p.). Connecter l’unité de l’électrode implantée sur le câble de stimulation et d’appliquer une stimulation électrique (courant intensité 50 µA, largeur d’impulsion : 100 µs ; intervalle de pulsation : 100 µs) pendant 90 s afin de produire une petite lésion autour de la pointe de l’électrode. , Débranchez le câble de stimulation et perfuse l’animal par le ventricule gauche avec sérum physiologique puis 200 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans un tampon phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,3 (pour une description détaillée, voir référence 17 ). Enlever le cerveau et plongez-le pendant 4 h dans le fixateur frais à 4 ° C. S’assurer que la température de la chambre principale cryostat est à -20 ° C. Geler le cerveau sur la glace sèche et les couper en 50 µm coronale sériées à l’aide d’un cryostat. Tacher les sections avec cresylviolet afin de repérer les positions de la pointe de l’électrode, selon l’atlas de Paxinos et Watson 14.

Representative Results

Données techniques TWS Le système sans fil offre 4 canaux d’enregistrement indépendant et canal 1 stimulation. Activité extracellulaire a été reprises par l’électrode de base unique d’enregistrement et transmise à l’entrée du signal haute impédance du système sans fil. Le signal enregistré a été de (x200) pré amplifié par un préamplificateur d’entrée différentielle, couplage AC et passe-bande filtré (signal fixe de bande passante, 500 Hz… 5 kHz) d’enregistrer uniquement l’activité multi-unités, parce que dans la présente étude l’intérêt principal était d’activité record unitaire et potentiels de champ non locaux. Le principal-amplificateur à gain programmable intégré offre gain logiciel-réglable pour les quatre canaux d’enregistrement (x1, x2, x4, x8, x16, x32, x64). La chaîne complète du système sans fil offre des valeurs de gain global de x200, x400, x800, x1600, x 3200, x6400 et x12800. Après amplification et le filtrage, le signal analogique a été numérisé par un convertisseur numérique analogique, modulé sur une porteuse haute fréquence et transmis par un émetteur/récepteur de radio à l’aide de la bande ISM 2,4-2,5 GHz. Le même type d’émetteur-récepteur servait de l’autre côté de la voie de transmission. Cette deuxième émetteur/récepteur est connecté à un ordinateur via un port USB. La voie de transmission a été utilisée pour la transmission de données bidirectionnelle d’envoyer des signaux enregistrés extracellulaires de l’animal à l’ordinateur et vice versa les paramètres de contrôle pour l’amplification du signal et la stimulation de l’ordinateur à l’animal. À l’aide de la TWS, il était possible d’enregistrer l’activité cérébrale de logements multiples avec succès et de modifier le comportement de l’animal en stimulant le colliculus inférieur, tandis que le rat se déplaçait librement dans le champ Ouvrir. L’émetteur-récepteur a été placé jusqu’à 5 m de l’animal et était relié à l’ordinateur via un USB port (voir Figure 2). Une comparaison des qualités signal enregistré a donné avec le captif et le système sans fil est illustré dans la Figure 5. Le TWS enregistre l’activité logements multiples avec une qualité de signal similaire comme un système d’enregistrement filaire. Le micro-stimulateur est un véritable stimulateur sans fil qui met à jour les paramètres de stimulation en temps réel, c’est-à-dire le signal de stimulation, dont les paramètres sont définis avec le logiciel TWS est passé à l’électrode de stimulation branchée sur la scène tête dans certains millisecondes après avoir appuyé sur le bouton de stimulation. Il était donc possible de modifier les paramètres de stimulation sans prendre l’animal hors de la cage. Ce dispositif a l’avantage qu’on peut réduire au minimum le temps pour des expériences de stimulation. Un logiciel TWS a été spécialement conçu pour permettre le contrôle de toutes les fonctionnalités du système sans fil (par exemple, enregistrement et stimulation) via une interface graphique (Figure 3 et Figure 4). Micro-stimulation, un signal de stimulation a été utilisé qui a été développé à l’aide de l’interface graphique du logiciel TWS. Le stimulateur de la SSC a été utilisé dans un mode de stimulation équilibrée de courant constant de charge. Le modèle de stimulation est envoyé sans fil pour le stimulateur de courant constant intégré dans l’appareil sans fil tête stade. Courant de stimulation a été appliqué entre une microélectrode travail placée dans l’objectif d’intérêt (comme par exemple le colliculus inférieur dans la présente étude) et une contre-électrode lointain plus grande qui a servi de l’électrode de terre ou de référence de la SSC. Selon l’impédance électrode de stimulation et de la conformité de la tension du stimulateur de courant constant, il est possible d’utiliser une gamme actuelle de stimulation maximale de ±625 µA, bien qu’un seuil de courant beaucoup plus bas dans ces expériences n’est exigé. Ici, biphasique charge équilibrée à courant constant stimulation a été utilisée avec des courants de pointe jusqu’à 300 µA. En cas de stimulation biphasique, la première impulsion est utilisée pour provoquer l’effet physiologique et la deuxième impulsion renverse habituellement des processus électrochimiques qui se produisent au cours de la stimulation impulsion18. Le stade tête TWS fournit des schémas de stimulation en temps réel par l’intermédiaire de l’interface graphique du logiciel TWS (voir Figure 4). Le logiciel TWS est divisé en trois sections principales : (i) une fenêtre principale avec les contrôles d’enregistrement et de stimulation, une fenêtre générateur de stimulus (ii) avec toutes les options de configuration pour les paramètres de signal de stimulation et d’une fenêtre (iii) replayer pour relire la fichiers de données enregistrées. La fenêtre principale permet à l’utilisateur d’afficher les signaux enregistrés de jusqu’à 4 canaux d’enregistrement, réglez le gain pour tous les canaux et démarrer/arrêter l’enregistrement des signaux affichés. Les données de signal sont stockées dans un fichier sur le disque dur de l’ordinateur. Le chemin du fichier se trouve dans le menu de configuration. Outre les paramètres d’enregistrement, la fenêtre principale permet de démarrer et d’arrêter le processus de stimulation. Le courant de stimulation constant qui est passé par l’électrode de stimulation du cerveau animal s’affiche en temps réel sur l’écran de la fenêtre principale. Les paramètres du signal stimulation sont préréglés dans la fenêtre de paramètres de paramètre de stimulus. Il est possible de définir des trains d’impulsions de stimulation mono – ou biphasique et pour définir la stimulation couramment utilisée tous les paramètres de pulsation comme par exemple durée d’impulsion, amplitude de pulsation, temps entre les impulsions, etc. (pour détails, voir Figure 4). La fonction d’impulsions de stimulation qui résulte des valeurs des paramètres présélectionnés est montrée dans un affichage graphique dans la fenêtre générateur de stimulation. Le logiciel SSC a été conçu selon les aspects de la facilité d’utilisation. La facilité d’utilisation du logiciel est un facteur essentiel pour garantir le bon déroulement de l’expérience de stimulation/enregistrement sans fil et un environnement de travail sûr et confortable. Il contribue également à améliorer la reproductibilité de l’expérience. Logement unique enregistrement de donnees et stimulation électrique Activité multi-unit extracellulaire successivement figurait dans le colliculus inférieur de la même électrode implanté à l’aide de la SSC et un système d’enregistrement des classiques. La figure 5 illustre représentante données brutes enregistrées à l’aide de deux systèmes, alors que l’animal se déplaçait librement dans un champ. Une comparaison directe des signaux suggère des signaux similaires de spike et les niveaux de bruit (Figure 5 a et 5 b). Une démonstration de la forme de l’épi est représentée en A « et B ». Étant donné que les rats n’a pas tenté de supprimer la scène tête TWS après l’intervention et Pendant les jours suivants, on a supposé qu’il n’a pas significativement entravé leurs mouvements et ne cause pas de gêne. Ainsi, en utilisant la TWS, un problème courant dans des enregistrements de rats a été évitée par exemple l’enlèvement et à mâcher des connecteurs et des câbles. En effet, les rats avec le stade tête TWS ont pu explorer plein champ et plus labyrinthe (sEE Movie 1) passages normales exposantes, élevage et comportements de toilettage. En outre, les paramètres de stimulation utilisés avec le SSC ou système captif conventionnel évoqué le même résultat comportemental, ici échapper de comportement. A partir de 100 µA, l’amplitude du courant stimulation augmenta étape par étape jusqu’à ce que le seuil de l’évasion – intensité minimale actuelle production en cours d’exécution ou de sauter – a été atteint et le comportement de fuite a été obtenu. Les seuils d’évacuation individuelle des 4 rats étaient semblables lorsque vous utilisez les deux systèmes (Figure 5). Figure 1 : Microélectrode TWS unité (1) enregistrement simple électrode/tétrode, électrode de stimulation (2), panneaux de raccordement de fibres (3) électrode, câbles de connexion (4) souple, fil de terre (5), Conseil (6) connecteur, connecteur (7) mâle ou femelle pour système de TWS (A) ; TWS microélectrode appareil branché dans le préamplificateur (8) et le support (9) ; (B) prêt à être attachées à un cadre stéréotaxique (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Vue de dessus de la scène tête TWS monté module (A) sans alimentation accumulateur. Total des dimensions : hauteur 12,5 m, profondeur 24 mm (19,3 mm + 4,7 mm), largeur 22,1 mm, poids : 5.96 vue de dessous des g. (B) montrant l’unité connecteur de l’électrode ; alimentation d’énergie de l’accumulateur, hauteur 9 mm, profondeur 26 mm, largeur 20 mm, poids 6 g (C) ; une vue d’ensemble des composants TWS utilisés pour ce test : (1) tête de scène unité avec accumulateur monté sur le crâne d’animal´s, (2) unité connectée à l’ordinateur port USB, logiciel TWS (3) (D) ; photo d’un rat librement déplacer et montrant la scène tête TWS relié à l’unité microélectrode implantée précédemment (E) et logiciel TWS montrant les signaux enregistrés exemplaires (F). Le stade tête TWS fournit des schémas de stimulation en temps réel via une interface graphique du logiciel TWS. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : TWS logiciel interface graphique, écran d’enregistrement. Les performances d’enregistrement de la SSC avec une électrode bipolaire enregistrement, implantée dans le colliculus inférieur, sont représenté sur l’écran. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : interface graphique logiciel TWS. écran de stimulation (A) et les spécifications de paramètres de stimulation (B). Paramètres de signal de stimulation (C) comme largeur d’impulsion (PxW), amplitude d’impulsion (PxA), inter retard d’impulsion (IPD), temps entre deux impulsions (TBP), impulsion par train (PPT) et le temps entre les trains (OTC) sont réglables via l’interface utilisateur graphique de TWS logiciel. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Comparaison qualitative entre un signal multi-unités enregistré extracellulaire avec le SSC (A) et une configuration d’enregistrement filaire (B). Les deux enregistrements ont été extraites de la même unité de microélectrodes TWS (impédance 0.5MOhm) implantée dans le colliculus inférieur. La distance axiale entre les deux contacts d’électrodes d’enregistrement était environ 400 µm. La bande passante d’enregistrement du système filaire et la SSC étaient identique (500 Hz… 5 kHz), signaux ont été échantillonnées avec 40 (par câble système) et 32 kHz (SSC). Les deux systèmes enregistrement activité logements multiples avec une qualité de signal analogue. Il n’y a aucune différence claire de taux entre la SSC et enregistrements filaires de combustion. Forme d’onde de potentiel d’action du neurone de deux enregistrements sont indiquées en A « et B ». Les paramètres de stimulation similaire étaient nécessaires pour les 4 rats atteindre le seuil d’évacuation à l’aide d’un système captif (TS) ou TWS (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Film 1 : Un rat exemplaire présentant un comportement exploratoire normal pendant le test plus de labyrinthe. La SSC permet à l’animal d’entrer les bras ouverts et fermés sans fil s’emmêle vers le haut dans l’appareil d’essai, mais il est petit et assez léger pour qu’elle ne perturbe que très peu dans la tâche elle-même. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Discussion

Ici, un système sans fil accessible en enregistrement et stimulation des études électrophysiologiques et comportementales en se déplaçant librement les animaux a été présenté. La SSC a été validé lors d’essais de comportements utilisant le colliculus inférieur comme un modèle de structure. L’approche de la SSC a plusieurs avantages par rapport à celles qui existent déjà. Tout d’abord, le système utilise une seule TWS tête-scène mobile équipée d’un préamplificateur et une batterie rechargeable, ce qui permet des enregistrements à long terme stables pendant 1 h avec la même batterie et activités sans fil à distance pour jusqu’à 5 m. en second lieu, le stade tête TWS est léger et compact, pesant 12 g, y compris la batterie et a été développé afin d’empêcher le rat de retrait de la phase de tête et de mâcher les fils. Il a été bien toléré par les animaux depuis aucun impact sur le répertoire comportemental animal´s avec et sans la TWS scène tête a été observée, ce qui rend le système applicable à un large éventail de tâches comportementales. Troisièmement, le système transmet en temps réel. Quatrièmement, par enregistrement bidirectionnel simultané et stimulation de l’activité neuronale, le système fournit un outil sophistiqué afin d’évaluer les relations causales entre l’activation des modes spécifiques du cerveau et comportement, surmontant ainsi les lacunes des systèmes unidirectionnels. Cette caractéristique rend la méthode particulièrement utile pour le domaine de la stimulation cérébrale profonde, nécessitant généralement une évaluation précise, suivi et ajustement des paramètres de stimulation au cours d’expériences comportementales à long terme. Enfin, une unité de la microélectrode chroniquement implantable a été développée avec enregistrement intégré, la stimulation et l’électrode de référence qui peut être facilement implanté au cours d’une chirurgie stéréotaxique classique. De ce point de vue, le SSC est un système sans fil intégré qui augmente la reproductibilité des expériences de stimulation et d’enregistrement. La qualité de l’enregistrement de la SSC s’est avérée être similaire à la qualité d’enregistrement fournie avec un système d’enregistrement par câble disponible dans le commerce (voir Figure 5).

Il est notoire que la stimulation électrique du colliculus inférieur chez le rat provoque claire évasion comportement caractérisé en exécutant ou en sautant, qui imite les réactions de peur stimulés par les défis environnementaux11,12, 13. Ce comportement a été induit dans la présente étude en stimulant le colliculus inférieur à l’aide de la TWS ou le traditionnel système captif. Afin de tester l’efficacité de la stimulation de la TWS, les seuils d’échappement – intensité minimale actuelle production en cours d’exécution ou en sautant – ont été comparées en utilisant les deux systèmes. Les rats avec le stade tête TWS sont capables de courir vite, sauter et grimper hors du champ ouvert, c’est-à-dire afficher un comportement typique d’évasion, avec une plus grande liberté de mouvement. Ce qui est important, les seuils d’échappement étaient semblables par rapport au système traditionnel de captif. Ensemble, un paradigme plutôt difficile a servi à tester la résistance de la TWS, dont il a maîtrisé de manière tracas.

La SSC est également adapté pour les expériences de stimulation électrique chronique depuis l’unité de la microélectrode implantée permet l’utilisation chronique. La SSC permet d’ajuster les paramètres actuels de stimulation très précisément de manière à détecter avec précision la fréquence et la quantité de courant de stimulation qui est efficace pour susciter une réaction comportementale. En outre, le même animal est stimulé avec le seuil actuel de même 3 jours plus tard et la même réponse comportementale souhaitée a été obtenue. Ceci suggère que le tissu autour de l’électrode de stimulation n’était pas endommagé par le courant de stimulation qui exige habituellement des amplitudes de courant de stimulation accrue avec des stimulations répétées pour obtenir la même réponse comportementale.

En outre, il est possible de réduire le temps expérimental considérablement car le TWS micro-stimulateur met à jour les paramètres de stimulation en temps réel lorsque l’expérimentateur les changements dans l’interface utilisateur graphique. Autres stimulateurs électriques19 utilisé pour recherche préclinique besoin d’être reprogrammée pour mise à jour du paramètre de stimulus. Dans ces cas, le dispositif est programmé en attachant l’animal via un câble à une unité de programmation. Ce n’est pas requis lorsque vous utilisez le SSC.

Enfin, la batterie est fixée au dessus de la scène tête TWS et reliés électriquement à la scène tête via un connecteur à aimant deux broches pour l’échange facile de la batterie. L’avantage est que, pendant l’expérience, il est possible de changer la batterie sans déconnecter la scène tête TWS de l’unité de l’électrode implantée, qui est beaucoup plus confortable pour l’animal. Au cours de la présente étude, nous avons utilisé une batterie dont durée de fonctionnement est seulement de 1 h. Dans le cas où l’expérience prend plue de 1 h, il est recommandé d’avoir une batterie supplémentaire disponible. La SSC peut être connecté à batteries rechargeables de remplacement avec une capacité de (i) 230 mA pour la durée de fonctionnement de 1 h ou (ii) 450 mA pour le temps de fonctionnement environ 2,5 h. Les deux types de piles peuvent être entièrement rechargées en 15 min.

En résumé, la présente étude décrit le fonctionnement de TWS conçu pour la stimulation neurale et enregistrement à partir d’agir librement des petits animaux. Un ensemble complètement intégré d’unité de microélectrodes implantable, scène tête, récepteur et le logiciel est présenté ainsi. La qualité de l’enregistrement sans fil et de la stimulation est similaire à ce que de l’attaché d’enregistrement système avec l’avantage d’être plus confortable, léger et sans danger à l’animal. Par conséquent, TWS peut servir à remplacer le système captif, car elle ne restreint pas la mobilité de l’animal et fournit une méthode flexible pour contrôler la stimulation et l’enregistrement neuronaux dans des circonstances où les autres approches serait difficile, voire impossible. TWS peut donc s’avérer un outil important pour enquêter sur l’activité comment électrique dans les circuits neurones définies génère certaines formes de comportement, une question fondamentale en neurosciences.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche de la Fédération allemande des Associations de recherche industrielle (AiF ; numéro de licence : KF2780403JL3).

Materials

Thomas Wireless System (TWS) version 2.0 Thomas RECORDING GmbH AN001165 The Thomas Wireless System (TWS) version 2.0 is a portable multichannel telemetry system with laptop computer, a preinstalled Microsoft Windows operating system and TWS control software. The TWS includes: low noise 4 channel pre– and programmable main amplifier with fixed bandwidth, single channel constant–current stimulator for application of biphasic current pulses, software programmable micro stimulator, implantable connector system and a basic head stage unit for mounting to an animal. The system is delivered with a transceiver with USB port connection for laptops or desktop personal computers, the control software running under Microsoft operating system Windows. The TWS system can be used for extracellular neural stimulation and recording in freely behaving small animals (e.g. rats, guinea pigs). This system can be adapted to be used in larger animals (e.g. primates) as well.
Software for Thomas Wireless System (TWS) Thomas RECORDING GmbH inlcuded in AN001165 The software for the Thomas wireless system is running under Microsoft Windows operating system and provides the graphical user interface (GUI) for the Thomas Wireless System (TWS). The TWS GUI offers complete control of the TWS functions 4 channel recording and 1 channel stimulation.
Implantable tetrode for recording (4 channels) and stimulation (single channel) Thomas RECORDING GmbH AN001132 Implantable tetrode for recording (4 channels) and stimulation (single channel) for use with Thomas Wireless Systems (TWS).
Recording tetrode specifications: tetrode fiber material: quartz glass insulated platinum tungsten fiber, tetrode fiber outer diameter: 100µm, tip shape D, impedance 0.5-0.8MOHm; Reference electrode: tip shape: D; Impedance: 300-500kOhm; Material: quartzglass insulated platinum/tungsten; Stimulation electrode specification: fiber material: platinum/iridium, diameter: 125µm, lacquer insulated, tip shape : D, impedance: < 10kOhm, dimensions of the electrode can be specified by the end user
Implantable microelectrode for recording (single channel) and stimulation (single channel) Thomas RECORDING GmbH AN001118 Implantable microelectrode for recording (single channel) and stimulation (single channel) for use with Thomas Wireless Systems (TWS).
Recording electrode specifications: electrode fiber material: quartz glass insulated platinum tungsten fiber, electrode fiber outer diameter: 80µm/250µm (please specify), tip shape D, impedance 0.5-0.8MOHm; Reference electrode: tip shape: D; Impedance. 300-500kOhm; Material: quartzglass insulated platinum/tungsten; Stimulation electrode specification: fiber material: platinum/iridium, diameter: 125µm, lacquer insulated, tip shape : D, impedance: < 10kOhm
Holder for electrode implantation Thomas RECORDING GmbH AN000838 Special bent metal rod for microelectrode implantation for standard electrode holders. The rod is used to hold an implantable electrode. The implantable electrode is fixed to the rod with special Thomas RECORDING water soluable glue (AN001080). (Electrode holder is not included)
Replacement accumulator power supply for the Thomas Wireless System (3,7V/230mAh) Thomas RECORDING GmbH AN001208 Replacement rechargeable battery (accumulator) for Thomas Wireless System with a capacity of 230mA for approximately 1h operation time. (size: 27mm x 20mm x 6mm, weight app. 6g)
Replacement accumulator power supply for the Thomas Wireless System (3,7V/450mAh) Thomas RECORDING GmbH AN001209 Replacement rechargeable battery (accumulator) for Thomas Wireless System with a capacity of 450mA for more than 1h operation time. (size: 48mm x 30mm x 4mm, weight app. 11g)
Accumulator charger for Thomas Wireless System (TWS) rechargable accumulator Thomas RECORDING GmbH AN001207 Mains powered charger for the Thomas Wirless System (TWS) rechargable accumulators (AN001209 and AN001209)
Water soluble glue Thomas RECORDING GmbH AN001080 Thomas RECORDING water soluble electrode glue is a specially selected product for use with implantable microelectrodes in neuroscientific research. Its unique properties ensure a rigid connection between electrode and mounting device although it is easily removable with warm water. The Thomas RECORDING water soluble electrode glue can be used out-of-the-box, without any time consuming preparation. Thomas RECORDING water soluble electrode glue is not harmful to humans, animals or the environment. Quantity: 1 box of 10 gramms
Miniature differential preamplifier Thomas RECORDING GmbH AN000329 The Miniature Differential Pre-Amplifier, Model MDPA-2 is a 2-channel, differential input preamplifier that is designed for low noise recordings from excitable tissue. It is intended for extracellular recording in conjunction with the implantation of implantable microelectrodes for freely moving animal appliactions with the Thomas Wireless System (TWS). The 2-Channel Miniature Differential Preamplifier (MDPA-2) is connected to the implantable microelectrodes for providing the initial tenfold amplification stage. Ideally Thomas RECORDING quartz glass insulated platinum/tungsten electrodes are used to yield optimal recording results with high signal amplitudes and low noise levels. The MDPA-2 has additional common ground and reference electrode inputs.
Connection cable Thomas RECORDING GmbH AN000330 Connection cable to connect the Thomas Miniature differential preamplifier (MDPA-2) to a main amplifier and an accumulator power supply.
Rechargeable power supply for the miniature preamplifier Thomas RECORDING GmbH AN000328 Rechargeable accumulator power supply for the Miniature differential preamplifier (MDPA-2).
Accumulator charger (US) Thomas RECORDING GmbH AN000167 Accumulator charger for the power supply AN000328 (US mains power outlet conenctor)
Accumulator charger (EU) Thomas RECORDING GmbH AN000168 Accumulator charger for the power supply AN000328 (EU mains power outlet connector)
Differential preamplifier/main amplifier/bandpass filter Thomas RECORDING GmbH AN000677 TREC AC Main Amplifier (LabAmp-03) is a single-channel, differential main amplifier for neurophysiological applications (e.g. extracellular recording with microelectrodes). This Instrument is designed to work with the miniature Differential Pre-Amplifier, Model MDPA-2. The single channel of the LabAmp-03 contains a high-gain, low-noise differential amplifier stage followed by low frequency and high-frequency filters. The amplifier has two different filter amplifiers, a single unit activity (SUA) filter –amplifier and a local field potential (LFP) filter amplifier, both are connected parallel in the signal path. Record Mode offers two levels of signal gain (x10, x100) in a first stage and 4 additional levels (x5, x10, x25 and x50) in a final amplifier stage. Each amplifier has different bandpass characteristics for single unit activity (SUA) 500Hz…20kHz and local field potentials (LFP) 0,1Hz…140Hz. An audio monitor and a window discriminator is integrated in the device. The LabAmp-03 has an integrated audio monitor with loudspeaker. This unit provides audio reproduction of electrophysiological signals. The unit combines an audio amplifier in a compact, rugged package. This is especially suited to monitoring neural firing and muscle contractions. The audio monitor input is internally connected to the SUA-Filter amplifier output. The LabAmp-03 is delivered with external power supply for a mains power operation voltage range of 100-240V AC/50-60Hz.
USB Oscilloscope Thomas RECORDING GmbH AN001096 USB PC Oszilloskop, 2 Kanal. This 2-channel PC oscilloscope is perfect suitable for mobile use on a laptop and permanent installation in control cabinets, industrial equipment and many other applications where a small, lightweight and powerful oscilloscope is required. This oscilloscope is connected to the signal output of the main amplifier is for display of recorded extracellular activity during the implanation of the implantable microelectrodes for the Thomas Wireless System (TWS). The user can acquire the measurement data over the several data-interfaces directly on the PC with includes PC software.
Stimulus generator Multichannel Systems STG3008-FA Stimulus Generator for Current (STG) and Voltage Driven Stimulation fulfill three functions: current driven stimulation, voltage driven stimulation, controlling and timing. The STG is available with 2, 4 or 8 independet output channels. Featuring integrated isolation units for each output channel, the STG is able to provide any arbitrary waveform.
Cap protector for the electrode Thomas RECORDING GmbH AN001193 Protective cap for implantable electrode unit for the Thomas Wireless System
Surgical equipment Scissors, blunt-end forceps, spatulas, surgical clippers, dental drill, and cotton buds
Drugs and chemicals Isoflurane, xylocaine, tramadol hydrochloride (Tramadol-CT, AbZ-Pharma GmbH, Ulm, Germany), dexpantenol eye salve (Bepanthen, Bayer AG, Leverkusen, Germany), 3% hydrogen peroxide, povidone-Iodine (Betaisodona, Mundipharma GmbH, Limburg, Germany) and 70% ethanol;
Fixation material including Stainless steel screws (BN650 M1.2×5; 4.7 mm ), acrylic resin (Paladur, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Germany), ultraviolet glue (Cyberbond U3300, Cyberbond Europe GmbH, Germany) and cap protector (Thomas Recording GmbH, Giessen, Germany);
Additional material Gloves, heating pad, syringes, and physiological saline.
Small Animal Stereotaxic Instrument (SASI) Thomas RECORDING GmbH AN000287 The model should be chosen according to the animal (rat, guinea pig, monkeys, etc) used in the study
Video camera EverFocus EverFocus, model: EQ150
Open field Made of transparent or gray acrylic, having round shape measuring 40x40x40cm
Elevated plus maze Made of gray acrylic and consisted of two open arms (50 cm long x 10 cm wide) and two closed arms (50 cm long x 10 cm wide, with 40 cm high walls) that extended from a central platform elevated 50 cm above the floor.
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References

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Melo-Thomas, L., Engelhardt, K., Thomas, U., Hoehl, D., Thomas, S., Wöhr, M., Werner, B., Bremmer, F., Schwarting, R. K. A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats. J. Vis. Exp. (129), e56299, doi:10.3791/56299 (2017).
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