炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

3。結晶評価技術、x 線データ コレクション 結晶マウント (初期の水の 25% を交換したがって結晶化条件にグリセロール (最終濃度) の 25% (v/v) を追加することによって凍結のソリューションの準備混合物) 38. 泡を埋める液体窒素デュワーにユニ パックのサンプルのエンクロージャの一部の場所とデュワー。液体窒素の温度に冷却することを許可します。 カット、シーリング テープ結晶化プレートからの結晶が形成されるドロップの上削除します。 ターゲットのドロップの近くで coverslide に各種凍害保護液の 1 μ L の滴を配置します。 磁気杖 39 , 40 にマウントされている背骨の標準ベースのナイロンのクライオ ループを使用して各種凍害保護ソリューション ドロップ元のドロップから選択した結晶を転送します。 ユニ パック サンプル ホルダーの最初の空の位置にループを配置すること、液体窒素に凍結のドロップから結晶をすばやく転送します。 (シーリング テープ カット ステップ) から繰り返して、すべての必要な結晶が収穫され、ユニ パック サンプル ホルダーに格納します。 場所ユニ パック パックの杖を使用してユニ パックに基づいて、(液体窒素条件) ビームラインにパックを取る 。 注意: 低温! クライオ トングとパックを使用してユニをロードするデュワー読み込みツール-puck(s) ビームライン サンプル チェンジャー ロボットにデュワー。ユニ パック サンプル ホルダーがサンプル ループ ホルダーをサンプル ロボットの直立したまま基本の蓋からデタッチ デュワー従って液体窒素に公開およびサンプル チェンジャー ロボットにアクセスします。 結晶評価技術 注: どちらか実験室の x 線源を用いた回折品質やシンクロトロン放射光 (SR) x 線源で、収穫された結晶を選別しことができます。(MX) 高分子結晶構造解析ビームラインは、構造解析のための異常な回折を利用する調整可能なエネルギー源を提供します。次のセクションにダイヤモンド光ソース MX ビームラインの実験的機能に沿った作業指示書のシリーズを提案すると、しかし、これらのガイドラインは、世界中の他のシンクロトロンで MX ビームラインにも合わせることが。 最初のステップとしていずれかを確認または結晶における異常散乱を識別すると便利です。これは便利な結晶からの x 線蛍光スペクトルを測定することによって実現できます。まずビームラインの x 線エネルギーは高分子結晶の通常予想されるすべての要素を刺激するには十分に高く設定されているを確認 (14 keV 以上). ビームライン制御ソフトウェアを使用してサンプル チェンジャー ロボットによるマウントするサンプルを選択します; ループは x 線ビームで自動的に中央揃えし、結晶の中心をビームライン制御ソフトウェアを使用して手動で確認できます。 ビームライン制御ソフトウェアを使用して x 線蛍光スペクトルを記録する: ユーザーは、露出時間を選択し、測定が開始され (蛍光/蛍光スペクトル設定 → 実行すると、 図 2 a)。ビームライン制御ソフトウェアは、自動的に x 線の蛍光検出器を置き、蛍光検出器の読み取り可能な信号を取得する x 線フラックスの最小の事件を決定を配置します。得られたスペクトルが自然発生する装備の放出ピークで自動化された方法で分析され、生物学的要素。GDA (www.opengda.org) 当社、シンクロトロン ヨーロッパ 41 , 42 中ビームライン制御ソフトウェア グラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) の内でこれらのルーチンがあります。 適切な要素が指定されている場合は 異常回折実験のために悪用される可能性が、結晶からの異常な回折データのコレクションの最適な波長を決定する x 線吸収端エネルギー スキャンを実行: ビームライン上制御ソフトウェア、要素を選択し、スキャンを開始 (蛍光/蛍光スキャン設定、→ 原子名 → 実行すると、 図 2 b). 注: 単一の異常な回折実験異常散乱を最大限に吸収端のピークが使用されます。多波長異常回折実験に関する実験的考察は、以前詳細 43 きた。 クリスタル ユニット セルのパラメーター、対称性、および回折限界を決定する 振動法を用いた 45 ° 間隔で 3 つの x 線回折パターンの測定 (データ コレクション/スクリーニング → 現在、実行 図 2)。ビームライン制御ソフトウェアは、各種振動角と露光時間と x 線ビームの割合転送を設定する能力を持つユーザーを提供します。標準クリスタル スクリーニング振動角 0.5 度、0.5 s, と 5 %x 線ビーム伝送の露光時間が推奨されます。測定された回折像エドナ パイプラインによって自動解析し、完全なデータ セット 22 のコレクションのための戦略のセットを返します。 X 線データ収集 注: 標準的な発振モードまたは時間, x 線量と同じ吸収動作約すぐ記録するフリーデル仲間を可能にする逆梁モードでデータを収集するユーザーを選択できます異常の違いのより正確な測定を許可します。異常な差が期待されておよび/またはサンプルは、異常な回折実験を行う放射線に敏感な場合は特に、後者は役に立つ。最高のデータ収集方法を使用する上の考慮事項が総合的に見直し 22 , 23 , 44 , 45 をされています。, 46, 47. ビームライン制御ソフトウェアを使用してインポートを提供する戦略プログラムが推奨する、データ コレクションのパラメーター: ω の回転軸の i. 開始位置 ii。各回折像の角度を ω 軸回転の振動幅 iii。各回折像の露出時間 iv。(直接データ コレクション全体の総 ω 軸回転角度で定義しない) 完全なデータセットのイメージの数 とびと放射線被害を避けるために x 線ビームの減衰の割合 (動) 注: 当院でのデータ コレクションを実行すると、収集したデータの自動化された処理のためのソフトウェア パイプラインは、確立されている: (i) 回折データ (インデックス付き、統合・拡張) 削減 xia2 パイプラインによってユーザーの反射 mtz ファイルを生成します。段階的に廃止し、構造のソリューション/洗練された 48 の入力として。(ii) 重大な異常信号が検出された場合、データ解析時に実験による重原子構造を解決しようとして、最初急速自動構造ソリューション (fast_ep) を使用してパイプライン発生してしまう段階、段階的な電子密度マップを提供可能であれば。2 番目のより包括的な構造ソリューション パイプラインは自動的に解決し、登録を構築する試みを引き受ける独立系ソフトウェア スイート 49 , 50 , 51 , 52; を使用して再これが成功した場合、ユーザーは、初期のモデルと電子密度マップで行われます。これはユーザーが絞り込みを完了し、選択した結晶構造解析ソフトウェア スイートを使用してモデルを検証するための基礎を提供します。