Cuantificación de transmigración de monocitos y formación de la célula de la espuma de individuos con enfermedades inflamatorias crónicas
Summary
Se describe un protocolo para medir la transmigración por monocitos a través de monocapas endoteliales humanas y su posterior maduración en células espumosas. Esto proporciona un método versátil para evaluar las propiedades aterogénicas de monocitos aislados de personas con diferentes enfermedades y evaluar factores en sangre que puede aumentar esta propensión.
Abstract
Arteriopatía coronaria (CAD) es una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Ateroesclerosis, una de las principales causa de CAD, es iniciado por la transmigración de monocitos inmunes innatas a sitios inflamatorios de lípidos depositados llamados estrías grasas, que están presentes en las paredes arteriales de mediano a grandes arterias. La característica clave de patógena de lesiones en esta etapa temprana de la aterosclerosis es la maduración de monocitos que emigran a las arterias para formar células espumosas o macrófagos cargados de lípidos. Considerable evidencia apoya la hipótesis de que aumenta el riesgo de la aterosclerosis por condiciones inflamatorias crónicas que acompaña a enfermedades como la artritis reumatoide y VIH, como envejecimiento general, y que este riesgo es predicho por monocitos activación. Mientras que los modelos de ratón proporcionan una buena plataforma para investigar el papel de monocitos en aterogénesis en vivo, requieren la alteración genética del metabolismo del colesterol natural y alteración drástica de la dieta normal del ratón y tienen una limitada aptitud para el estudio de influencias aterogénicos de enfermedades concomitantes humana. Esto nos motivó a desarrollar un modelo humano en vitro para medir el potencial aterogénico de los monocitos aislados de individuos con enfermedades definidas. Actualmente, los modelos humanos en vitro limitan en que evalúan la formación de monocitos transmigración y la espuma de la célula en aislamiento. Aquí se describe un protocolo que monocitos aislados de sangre paciente transmigrada en células endoteliales humanas en una matriz de colágeno tipo 1, y se mide su propensión a madurar en células espumosas en la presencia o ausencia de lípidos exógenos. El protocolo ha sido validado para el uso de monocitos humanos purificados de individuos con infección por VIH y ancianos no infectado de VIH. Este modelo es versátil y permite la formación de monocitos transmigración y espuma de la célula evaluarse usando cualquiera microscopia o citometría de flujo, así como permitiendo la evaluación de los factores aterogénicos presentes en suero o plasma.
Introduction
Transmigración de monocitos es un paso crucial en el desarrollo de placas ateroscleróticas que pueden conducir a la trombosis, derrame cerebral e infarto de miocardio. Placas ateroscleróticas desarrollan de rayas grasas, generalmente presentes en los sitios de baja circulación oscilatoria en medio a grandes arterias, donde deposita lípidos contribuyen a la activación endotelial y localizan de inflamación1. Monocitos son reclutados a las células endoteliales en rayas grasas por proteínas quimiotáctica de monocitos (como CCL2) y transmigrada en la intima2. Después de la transmigración, monocitos pueden formar macrófagos aterogénicos, cargados de lípidos, llamados células de la espuma como consecuencia de la absorción de lípidos, síntesis de lípidos, abajo-regulación del eflujo de colesterol o una combinación de los factores mencionados. Monocitos pueden también acumular lípidos en la circulación y tienen un fenotipo ‘espumoso’, posiblemente predispone las células de la espuma de la célula formación3,4. Células de la espuma son la característica definitoria de estrías grasas y placas ateroscleróticas de la temprano-etapa y su formación está influida por lípidos y mediadores inflamatorios5. Alternativamente, monocitos tienen la capacidad de revertir transmigrada desde la arteria a la circulación sanguínea6, eliminando lípidos de la intima y actuar para mantener la salud de la arteria.
Determinar la propensión de los monocitos a transmigrada en endotelio arterial y las células de la espuma de la forma en la íntima, o a la inversa transmigrada y llevan lipídico de la placa, es un requisito clave para entender el papel de la activación de monocitos en el aumento de riesgo aterosclerótico. Modelos de ratón de CADs como ateroesclerosis son importantes en la aclaración en tiempo real en vivo información sobre el desarrollo de placa racha graso, aterosclerótica. Sin embargo, estos modelos requieren una alteración genética del colesterol natural proceso habilidades de estos animales generalmente juntados con drásticas alteraciones en la dieta (como el modelo de dieta de ApoE-/-tipo occidental)7,8, de tal modo, inducir la acumulación no fisiológico de lípidos que circulan niveles cuyo desarrollo de placa de la unidad. Estos modelos pueden haber limitado relevancia a crónica humana las condiciones inflamatorias tales como la infección por VIH que no están asociados con mayor circulación colesterol o lipoproteína de baja densidad (LDL) los niveles. Además, las diferencias en la biología de monocitos entre humanos y ratones que las pruebas de inmunológicas preguntas sobre la relevancia de las subpoblaciones de monocitos (como monocitos intermedias (CD14++CD16+))9 difícil. Esto es importante al estudiar los mecanismos de conducción enfermedad cardiovascular como monocitos intermedio cuentas independientemente predicen eventos cardiovasculares10,11. Mientras que pruebas existen para medir secuencialmente o monocito transmigración o espuma de la formación de la célula en aislamiento, ningún ensayo en vitro ha sido validado para la cuantificación de ambos aspectos de la aterogénesis temprana utilizando las mismas células de cohortes clínicas. Transwell modelos utilizan un sistema de dos cámaras Boyden modificado mediante el cual las células se cargan en la cámara superior y transmigrada a través de una barrera de plástico poroso o monocapa de células en una cámara baja que normalmente contiene los medios de comunicación con chemoattractant12 , 13. ampliamente utilizado para el análisis de transmigración de leucocitos, estos modelos no incorporan generalmente una capa de la íntima, dando lugar a células transmigrated migrar en solución y no permiten la medición de la célula de la espuma formación o transmigración inversa de las células del mismo. Por el contrario, los modelos de formación de la espuma de la célula no cuenta cualquier cambio transmigratory inducida en monocitos o los efectos de la activación endotelial que se sabe que contribuyen a la espuma de célula formación14. Además, estos sistemas inducen espuma formación celular de macrófagos adheridos a las placas de cultivo celular mediante la adición de saturar la concentración de lipoproteína de baja densidad OXIDADA exógeno (oxLDL)15,16, un inductor clave de formación de la espuma de la célula. LDL en estos modelos es oxidado a menudo por procesos no fisiológicamente relevantes como CuSO4 tratamiento17, por lo tanto, cuestionar la importancia fisiológica de los estudios usando estos modelos.
Aquí se describe un ensayo que cuantifica transmigración de monocitos y formación de la célula de la espuma de las células del mismo que no requiere la adición de oxLDL exógena, así modelar mejor el papel de monocitos en la formación de espuma de la célula. Este modelo fue desarrollado originalmente por el profesor William Muller (Northwestern University, Chicago)18y ha sido perfeccionado en nuestro laboratorio para evaluar ex vivo del atherogenicity de monocitos aislados bajo no activar condiciones de individuos con las condiciones inflamatorias subyacentes que acompaña a enfermedades como el VIH infección19 , así como envejecimiento de20, están asociados con un mayor riesgo de aterosclerosis. Este modelo también proporciona una plataforma para responder a cuestiones biológicas básicas con respecto a la propensión de subconjuntos diferentes de monocito a forma espuma células20, la influencia de la activación endotelial por citoquinas como el TNF en la formación de la célula de la espuma14 y las características migratorias de los monocitos como la profundidad y velocidad de transmigración en geles19. Además, formación de monocitos transmigración y la espuma de la célula puede ser cuantificada usando microscopia estándar, proyección de imagen de celular en vivo, flujo cytometry y la proyección de imagen de citometría de flujo, por lo tanto, proporciona un método versátil para evaluar la función de monocitos en la aterogénesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo aquí descrito ofrece un método versátil y fisiológicamente relevante para evaluar la atherogenicity de monocitos de cohortes clínicos humanos, combinando transmigración de monocitos y formación de espuma de la célula. Este modelo ofrece ventajas sobre otros métodos de formación de la espuma de la célula ya que toma en cuenta el efecto de la transmigración de monocitos en la formación de espuma de la célula y permite la medición de transmigración inversa6 además de los…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen con gratitud el trabajo del Prof. William Muller y el Dr. Clare Westhorpe por su papel clave en el desarrollo de iteraciones anteriores de este modelo. Los autores también desean agradecer el núcleo de AMREP citometría de flujo para la clasificación de monocito a subconjuntos y el Alfred Hospital infeccioso enfermedad clínica enfermeras para el reclutamiento de individuos VIH + para algunos estudios de investigación. Los autores reconocen con gratitud la contribución a este trabajo la Victoria operacional infraestructura del programa de apoyo recibido por el Instituto de Burnet. TAA es apoyado por Beca Postdoctoral un RMIT Universidad del rector. Este trabajo fue apoyado por la subvención del proyecto NHMRC 1108792 otorgado a AJ y AH. TK es apoyado por subvenciones de NIH NIH K08AI08272, subvención del NIH/NCATS # UL1TR000124.
Materials
| Gel preparation reagents | |||
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465-500G | 0.1 M NaOH diluted in H20 |
| 10X M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
| AcCOOH | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | 20 mM Acetic acid diluted in H20 |
| Cultrex Bovine Collagen I | R&D Systems | 3442-050-01 | Type I Fibrous Collagen |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| M199 | Life Technologies | 11150-059 | M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine and 100 U/mL penicillin/streptomycin |
| M20 | Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199. |
||
| HUVEC | Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially. | ||
| Human coronary artery endothelial cells | Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially. | ||
| EDTA | BDH Merck | 10093.5V | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) – 0.5 M, pH 8.0 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889-500G | Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) – 1 mM, pH 8.0 |
| 0.05% trypsin EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | L-glutamine (200 mM) |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin) |
| New born calf serum | Gibco | 16010-142 | New born calf serum: New Zealand origin |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1056-1MG | Fibronectin – 50 µg/mL aliquots prepared and stored |
| PBS (1X) | Gibco | 14200-075 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10X): Dilute to 1X with sterile H20 |
| 0.1% TNF | Gibco | PHC3015 | Recombinant human TNF – Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots |
| Low-density lipoprotein | Merck Millipore | LP2-2MG | Low-density lipoprotein (LDL) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| 1 or 2% formaldehyde | Polysciences | 4018 | 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20 |
| 50% and 78% methanol | Ajax Finechem | 318-2.5L GL | 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20 |
| Oil Red O stain | Sigma-Aldrich | O0625-25G | Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol |
| Microscope slides | Mikro-Glass | S41104AMK | Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm) |
| Cover slips | Menzel-Gläser | MENCS224015GP | 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips |
| Double-sided tape | 3M Scotch | 4011 | Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m) |
| Giemsa stain | Merck Millipore | 1.09204.0500 | Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20) |
| Hole punch | Hand-held single hole punch (6.35 mm punch) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry | |||
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL |
| 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes | BD Biosciences | 352235 | 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes |
| Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain | Life Technologies | L34959 | Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain |
| FACS wash | Prepare by mixing 1 X PBS–, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96 well plate | Nunclon | 167008 | Delta surface flat-bottomed 96 well plate |
| 10 cm Petri Dish | TPP | 93100 | Sterile 10 cm Petri dish |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | Eppendorf tubes |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 222-20S | Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb) |
References
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