Summary

Количественная оценка Моноцит трансмиграции и образование пены клетки от физических лиц с хронические воспалительные заболевания

Published: October 17, 2017
doi:

Summary

Мы описываем протокол измерения трансмиграции, моноциты через человека эндотелиальной монослои и их последующее созревания в пены клетки. Это предоставляет универсальный метод для оценки свойства атерогенные моноцитов, изолирован от людей с различными заболеваниями и для оценки факторов в крови, которые могут усилить эту склонность.

Abstract

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) является основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Атеросклероз, ведущей причиной CAD, инициируется трансмиграции врожденной иммунной моноциты воспалительных сайты хранение липидов, называемые жирные полосы, которые присутствуют в артериальной стен средних до крупных артерий. Ключевой особенностью патогенных поражений на этой ранней стадии атеросклероза является созревания моноцитов, которые мигрируют в артерии образуют пены клетки или липидов Ладена макрофагов. Значительные доказательства подтверждают гипотезу о том, что риск атеросклероза увеличивается на хронических воспалительных заболеваний, сопутствующих заболеваний, таких как ревматоидный артрит и ВИЧ, а также общего старения, и что этот риск предсказано Моноцит активации. В то время как мыши модели обеспечивают хорошую платформу для изучения роли моноцитов в атерогенеза в естественных условиях, они требуют генетического изменения метаболизма природных холестерина и радикальные изменения диеты нормальные мыши и имеют ограниченную пригодность для изучение атерогенные влияния человека коморбидных заболеваний. Это побудило нас разработать модель человека в пробирке для измерения атерогенный потенциал моноцитов, изолирован от людей с определенными заболеваниями. В настоящее время человека в vitro модели ограничения в том, что они оценивают Моноцит трансмиграции и пены клетки формирования в изоляции. Здесь мы описываем протокол, в котором моноцитов, изолированных от крови пациента высыпками через эндотелиальные клетки человека в матрицу коллаген типа 1, и их склонность к перерастет пены клетки в наличие или отсутствие экзогенных липидов измеряется. Протокол был утвержден для использования человеческого моноцитов, очищенного от лиц с ВИЧ-инфекцией и пожилых ВИЧ неинфицированных лиц. Эта модель универсальна и позволяет Моноцит трансмиграции и пены клетки формирования должны оцениваться с помощью либо микроскопии или проточной цитометрии, а также позволяет Оценка атерогенных факторов в сыворотке или плазме.

Introduction

Моноцит переселение представляет собой решающий шаг в развитии атеросклеротических бляшек, что может привести к тромбоз, инсульта и инфаркта миокарда. Атеросклеротические бляшки развиваются из жирных разводов, обычно присутствующих на участках низкой колебательной кровотока в среде крупных артерий, где осаждаются липидов способствует активации эндотелиальной и локализованные воспаление1. Моноциты набираются на эндотелиальных клеток в жирных полосы через Моноцит эозинофилов белков (например, CCL2) и высыпками интимы2. После переселения Моноциты образуют атерогенные, липидов Ладена макрофагов, называемые пены клетки вследствие поглощения липидов, синтез липидов, вниз регулирование измеряем холестерина или сочетание вышеуказанных факторов. Моноциты может также накапливают липиды в циркуляции и имеют «пенистый» фенотип, возможно предрасполагающие клетки для пены клетки формирования3,4. Пена клетки являются характерной чертой жирных разводов и ранней стадии атеросклеротических бляшек и их формирования находится под влиянием липидов и воспалительных медиаторов5. Кроме того, моноциты имеют возможность обратить вспять высыпками из артерии в кровоток6, тем самым удаляя липидов из интима и Исполняющий обязанности для поддержания здоровья артерии.

Определение склонности моноцитов к высыпками через артериальной эндотелия и формы пены клеток интимы, или вспять высыпками и нести липидов из доски, является ключевым требованием для понимания роли Моноцит активации в повышении атеросклеротические риска. В выяснения реального времени в естественных условиях информацию о жирных полоска/атеросклеротической бляшки развития важны мыши модели САПР как атеросклероз. Однако эти модели требуют генетического изменения природных холестерина, обработки способности этих животных, обычно в сочетании с радикальные изменения в диете (например, модель диета ароЕ / Западной типа)7,8, тем самым, склонение-физиологические накопления оборотных липидов уровней развития зубного налета диск. Эти модели могут быть лишь ограниченные отношение к хронической человека воспалительных например ВИЧ-инфекции, не связанные с увеличение циркулирующих холестерина и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) уровнях. Кроме того, различия в биологии Моноцит людей и мышей сделать тестирование иммунологического вопросы относительно актуальности субпопуляций моноцитов (таких как промежуточные моноцитов (CD14++окрашенных CD16 ++))9 трудно. Это имеет важное значение при изучении механизмов вождения сердечно-сосудистых заболеваний, как промежуточные Моноцит рассчитывает самостоятельно прогнозировать сердечно-сосудистых событий10,11. Хотя анализов существуют последовательно измерить либо формирование клеток Моноцит переселения или пены в изоляции, не в vitro пробирного протестирована для количественной оценки обоих аспектов раннего атерогенеза, используя те же клетки от клинических когорты. Transwell модели используют модифицированную систему двухпалатного Бойден которой клетки загружаются в верхней камере и высыпками через пористые Пластиковый барьер или монослоя клеток в нижней палате, которая обычно содержит носитель с хемотаксического12 , 13. Хотя широко используется для анализа лейкоцита трансмиграции, эти модели обычно не включают слой, представляющий интима, что приводит к переселенных клетки мигрируют в раствор и не позволяют для измерения ячейки пены формирование или обратного переселения тех же ячейках. И наоборот модели формирования клеток пены не учитывают transmigratory индуцированных изменений моноциты или эффекты эндотелиальной активации, который известен вносить пены клетки формирования14. Кроме того, эти системы вызывают пены формирования клеток от макрофагов придерживаться пластины культуры клеток путем добавления насыщения концентраций экзогенного окисленного липопротеинов низкой плотности (oxLDL)15,16, ключевых индуктор формирования клеток пены. ЛПНП, используемые в этих моделях часто окисляется, не физиологически соответствующих процессов, таких как CuSO4 лечения17, таким образом, допрос Физиологическая важность исследований с использованием этих моделей.

Здесь мы описываем assay который измеряет Моноцит трансмиграции и образование пены клетки же клеток, которая не требуют добавления внешних oxLDL, таким образом лучше моделирования роли моноцитов в формировании клеток пены. Эта модель была первоначально разработана профессор Уильям Muller (Северо-Западный университет, Чикаго)18и уточнены в нашей лаборатории для оценки ex vivo атерогенности моноцитов, изолированные под не Активация условия от лица с базовой воспалительных заболеваний, сопутствующих заболеваний, таких как ВИЧ инфекции19 , а также старения20, которые связаны с повышенным риском развития атеросклероза. Эта модель также предоставляет платформу для ответа на основные биологические вопросы относительно склонность различных Моноцит подмножеств формы пены клетки20, влияние эндотелиальной активации цитокинов, таких как ФНО на образование пены клетки14 и мигрирующих свойств моноцитов, такие как глубина и скорость переселения в гели19. Кроме того Моноцит трансмиграции и пены клетки формирования могут быть количественно с помощью стандартных микроскопии, живут клеток, поток цитометрии и изображений проточной цитометрии, таким образом, предоставляя универсальный метод для оценки роли моноцитов в атерогенеза.

Protocol

Примечание: все эксперименты с использованием человеческого биологические образцы были выполнены с одобрения этики от человека Комитет этики Альфред больницы, Мельбурн. Все эксперименты были проведены в шкафы биологической безопасности II класса, если не указано. " Prewarmed " относит?…

Representative Results

Количественная оценка трансмиграции Моноцит Моноциты добавляются к модели, как описано на рисунке 1, и шесть гели составляются для каждого условия. Моноциты 6 гели на доноров (т.е., 5.0 x 10 моноциты4 за ге…

Discussion

Протокол, описанные здесь предлагает универсальный и физиологически соответствующие метод оценки атерогенности моноциты из человеческих клинических когорт, объединив Моноцит трансмиграции и образование пены клетки. Эта модель предлагает преимущества над альтернативные методы фор?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы с благодарностью отметить работу профессор Уильям Мюллер и д-р Клэр Westhorpe за их ключевую роль в развитии более ранних итераций этой модели. Авторы также хотел бы поблагодарить AMREP потока цитометрии ядро для сортировки Моноцит подмножеств и Альфред больницы инфекционные заболевания группы клинических исследований медсестер для найма ВИЧ + людей для некоторых исследований. Авторы с благодарностью признать вклад в эту работу Виктория оперативной инфраструктуры программы поддержки полученных институтом Burnet. TAA поддерживается КМТИ университета вице-канцлера докторантура стипендий. Эта работа была поддержана NHMRC Грант проекта 1108792 присуждена AJ и AH. TK поддерживается NIH предоставляет низ K08AI08272, гранта NIH/NCATS # UL1TR000124.

Materials

Gel preparation reagents
NaOH Sigma-Aldrich 221465-500G 0.1 M NaOH diluted in H20
10X M199 Sigma-Aldrich M0650
AcCOOH Sigma-Aldrich 695092-100ML 20 mM Acetic acid diluted in H20
Cultrex Bovine Collagen I R&D Systems 3442-050-01 Type I Fibrous Collagen
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
M199 Life Technologies 11150-059 M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate.
Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine  and 100 U/mL penicillin/streptomycin 
M20 Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum.
Individual lipid species such as LDL can be added to M199.
HUVEC Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially.
Human coronary artery endothelial cells Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially.
EDTA BDH Merck 10093.5V Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) – 0.5 M, pH 8.0
EGTA Sigma-Aldrich E3889-500G Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) – 1 mM, pH 8.0
0.05% trypsin EDTA Gibco 25300-054 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X)
L-glutamine Gibco 25030-081 L-glutamine (200 mM)
Penicillin/streptomycin  Gibco 15140-122 Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin)
New born calf serum Gibco 16010-142 New born calf serum: New Zealand origin
Fibronectin Sigma-Aldrich F1056-1MG Fibronectin – 50 µg/mL aliquots prepared and stored
PBS (1X) Gibco 14200-075 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10X): Dilute to 1X with sterile H20
0.1% TNF Gibco PHC3015 Recombinant human TNF – Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots
Low-density lipoprotein Merck Millipore LP2-2MG Low-density lipoprotein (LDL)
Name Company Catalog Number Comments
Microscopy
1 or 2% formaldehyde Polysciences 4018 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20
50% and 78% methanol Ajax Finechem 318-2.5L GL 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20
Oil Red O stain Sigma-Aldrich O0625-25G Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol
Microscope slides Mikro-Glass S41104AMK Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm)
Cover slips Menzel-Gläser MENCS224015GP 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips
Double-sided tape 3M Scotch 4011 Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m)
Giemsa stain Merck Millipore 1.09204.0500 Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20)
Hole punch Hand-held single hole punch (6.35 mm punch)
Name Company Catalog Number Comments
Flow cytometry
Collagenase D Roche Diagnostics 11088858001 Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL 
35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes BD Biosciences 352235 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes
Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain Life Technologies L34959 Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain
FACS wash Prepare by mixing 1 X PBS, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum
Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
96 well plate Nunclon 167008 Delta surface flat-bottomed 96 well plate
10 cm Petri Dish TPP 93100 Sterile 10 cm Petri dish
1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 0030 125.150 Eppendorf tubes
Transfer pipette Samco Scientific 222-20S Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb)

References

  1. Napoli, C., et al. Fatty streak formation occurs in human fetal aortas and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 100 (11), 2680-2690 (1997).
  2. Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7 (2), 77-86 (2010).
  3. Xu, L., et al. Foamy Monocytes Form Early and Contribute to Nascent Atherosclerosis in Mice With Hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (8), 1787-1797 (2015).
  4. Jackson, W. D., Weinrich, T. W., Woollard, K. J. Very-low and low-density lipoproteins induce neutral lipid accumulation and impair migration in monocyte subsets. Scientific Reports. 6, 20038 (2016).
  5. Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Jaworowski, A. Inflammation-induced foam cell formation in chronic inflammatory disease. Immunol. Cell. Biol. 93 (8), 683-693 (2015).
  6. Llodrá, J., et al. Emigration of monocyte-derived cells from atherosclerotic lesions characterizes regressive, but not progressive, plaques. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (32), 11779-11784 (2004).
  7. Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal Models of Atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).
  8. Meir, K. S., Leitersdorf, E. Atherosclerosis in the Apolipoprotein E-Deficient Mouse. A Decade of Progress. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (6), 1006-1014 (2004).
  9. Hilgendorf, I., Swirski, F. K. Making a difference: Monocyte Heterogeneity in Cardiovascular Disease. Curr. Atheroscler. Rep. 14 (5), 450-459 (2012).
  10. Rogacev, K. S., et al. Lower Apo A-I and Lower HDL-C Levels Are Associated With Higher Intermediate CD14++CD16+ Monocyte Counts That Predict Cardiovascular Events in Chronic Kidney Disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34 (9), 2120-2127 (2014).
  11. Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ Monocytes Independently Predict Cardiovascular Events: A Cohort Study of 951 Patients Referred for Elective Coronary Angiography. J. Am. Coll. Cardiol. 60 (16), 1512-1520 (2012).
  12. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).
  13. Boyden, S. The Chemotactic Effect Of Mixtures Of Antibody And Antigen On Polymorphonuclear Leucocytes. J. Exp. Med. 115 (3), 453-466 (1962).
  14. Westhorpe, C. L. V., et al. Endothelial cell activation promotes foam cell formation by monocytes following transendothelial migration in an in vitro model. Exp. Mol. Pathol. 93, 220-226 (2012).
  15. Quinn, M. T., Parthasarathy, S., Fong, L. G., Steinberg, D. Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (9), 2995-2998 (1987).
  16. Henriksen, T., Mahoney, E. M., Steinberg, D. Enhanced macrophage degradation of biologically modified low density lipoprotein. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 3 (2), 149-159 (1983).
  17. Parthasarathy, S., Raghavamenon, A., Garelnabi, M. O., Santanam, N. Oxidized Low-Density Lipoprotein. Methods Mol. Biol. 610, 403-417 (2010).
  18. Muller, W. A., Weigl, S. A. Monocyte-selective transendothelial migration: dissection of the binding and transmigration phases by an in vitro assay. J. Exp. Med. 176 (3), 819-828 (1992).
  19. Maisa, A., et al. Monocytes from HIV-infected individuals show impaired cholesterol efflux and increased foam cell formation after transendothelial migration. AIDS. 29 (12), 1445-1457 (2015).
  20. Angelovich, T. A., et al. Ex vivo foam cell formation is enhanced in monocytes from older individuals by both extrinsic and intrinsic mechanisms. Exp. Gerontol. 80, 17-26 (2016).
  21. Westhorpe, C. L. V., et al. Effects of HIV-1 infection in vitro on transendothelial migration by monocytes and monocyte-derived macrophages. J. Leukoc. Biol. 85 (6), 1027-1035 (2009).
  22. Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. J. Cell Biol. 98 (3), 1033-1041 (1984).
  23. Müller, A. M., et al. Expression of the Endothelial Markers PECAM-1, vWf, and CD34 in Vivo and in Vitro. Exp. Mol. Pathol. 72 (3), 221-229 (2002).
  24. Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2017).
  25. Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
  26. Gacka, M., et al. Proinflammatory and atherogenic activity of monocytes in Type 2 diabetes. J. Diabetes Complications. 24 (1), 1-8 (2010).
  27. Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease. Eur. Heart J. 32 (1), 84-92 (2011).

Play Video

Cite This Article
Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Maisa, A., Kelesidis, T., Jaworowski, A. Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions. J. Vis. Exp. (128), e56293, doi:10.3791/56293 (2017).

View Video