Descreveremos um protocolo para medir transmigração por monócitos em monocamadas endoteliais humanas e sua maturação subsequente em células de espuma. Isso fornece um método versátil para avaliar as propriedades aterogênico de monócitos isoladas de pessoas com doenças diferentes condições e avaliar fatores no sangue que pode melhorar esta propensão.
Doença arterial coronariana (DAC) é das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Aterosclerose, dos principais causa de CAD, é iniciada pela transmigração de monócitos imunes inatas para sites inflamatórias de lipídio depositado chamado estrias gordurosas, que estão presentes nas paredes arteriais de médio para grandes artérias. A principal característica patogênica de lesões nesta fase inicial da aterosclerose é a maturação dos monócitos que migram em artérias para formar células de espuma ou macrófagos carregados de lipídios. Considerável evidência suporta a hipótese de que o risco de aterosclerose é aumentado por condições inflamatórias crônicas que acompanham doenças como artrite reumatoide e HIV, bem como o envelhecimento geral, e que esse risco é predito por monócitos ativação. Enquanto rato modelos fornecem uma boa plataforma para investigar o papel dos monócitos no atherogenesis na vivo, eles exigem alteração genética do metabolismo do colesterol natural e alteração drástica de dietas de rato normal e tem limitado a sua aptidão para o estudo das influências aterogênico doenças comórbidas humana. Isto motivou-na desenvolver um modelo humano em vitro para medir o potencial aterogênico de monócitos isoladas de indivíduos com doença definidos Estados. Atualmente, modelos humanos em vitro limitando em que avaliam a formação de células transmigração e espuma monócito em isolamento. Aqui descrevemos um protocolo em que monócitos isolados do paciente sangue transmigrar através de células endoteliais humanas em uma matriz de colágeno tipo 1, e sua propensão para amadurecer-se em células de espuma na presença ou ausência de lipídios exógenos é medido. O protocolo foi validado para o uso de monócitos humanos purificado de indivíduos com infecção pelo HIV e idosos indivíduos HIV infectado. Este modelo é versátil e permite monócito transmigração e espuma formação de célula a ser avaliada usando qualquer microscopia ou citometria de fluxo, bem como permitindo a avaliação de factores aterogênico presentes no soro ou plasma.
Transmigração de monócito é um passo crucial no desenvolvimento da placa de ateroma que pode levar à trombose, derrame e infarto do miocárdio. Ateroma desenvolve de listras gordas, geralmente presentes em locais de fluxo sanguíneo oscilatório baixo em meio às grandes artérias, onde depositada lipídica contribui para ativação endotelial e localizadas inflamação1. Os monócitos são recrutados para células endoteliais em listras gordas através de proteínas Quimiotáticos de monócitos (tais como CCL2) e transmigrar para o íntima2. Após a transmigração, monócitos podem formar macrófagos aterogênico, lipid-laden chamados espuma de células em consequência da absorção de lipídios, síntese de lipídios, para baixo-regulamento de efluxo de colesterol ou uma combinação dos fatores acima. Os monócitos também podem acumular lipídeos na circulação e têm um fenótipo ‘espumoso’, possivelmente predisponentes células de espuma celular formação3,4. Células de espuma são a característica definidora de listras gordas e estágios iniciais de ateroma e sua formação é influenciada pela lipídico e mediadores inflamatórios5. Alternativamente, os monócitos têm a capacidade de reverter transmigrar da artéria para a corrente sanguínea6, eliminando lipídico da íntima e agindo para manter a saúde das artérias.
Determinar a propensão dos monócitos para transmigrar através de endotélio arterial e forma as células de espuma em íntima, ou reverter transmigrar e transportar lipídios fora a placa, é um requisito-chave para compreender o papel da ativação de monócitos no aumento risco de aterosclerose. Modelos de mouse de CADs como aterosclerose são importantes na elucidação de informações em tempo real na vivo no desenvolvimento de placa aterosclerótica/raia gordurosos. No entanto, estes modelos requerem uma alteração genética do colesterol natural processamento habilidades destes animais geralmente associada a alterações drásticas na dieta (por exemplo, o modelo de dieta/ApoE-Western-tipo)7,8, desse modo, induzindo a acumulação não-fisiológica de lipídios em circulação os níveis que desenvolvimento de placa de carro. Estes modelos podem ter limitada relevância para inflamatórias humanas condições crônicas tais como a infecção pelo HIV que não estão associados com aumento níveis de lipoproteína de baixa densidade (LDL) ou colesterol de circulação. Além disso, as diferenças em biologia monócito entre humanos e ratos fazem os testes imunológicos perguntas sobre a relevância de subpopulações de monócitos (tais como intermediários monócitos (CD14 ++CD16+))9 é difícil. Isto é importante quando se estudar os mecanismos de condução doença cardiovascular como contagens de monócitos intermediário independente preveem eventos cardiovasculares10,11. Enquanto os ensaios existem para medir sequencialmente de qualquer formação monócito transmigração ou espuma de célula isoladamente, sem ensaio em vitro foi validado para quantificar os dois aspectos do atherogenesis início, usando as mesmas células de coortes clínicas. Transwell modelos utilizam um sistema de duas câmaras Boyden modificado pelo qual as células são carregados na câmara superior e transmigrar através de uma barreira de plástico porosa ou monocamada de células em uma câmara inferior que normalmente contém mídia com quimiotático12 , 13. enquanto amplamente utilizado para a análise de transmigração de leucócitos, estes modelos não incorpora geralmente uma camada representando a íntima, resultando em células transmigra migrando em solução e não permitem a medição de célula de espuma formação ou reversa transmigração das mesmas células. Por outro lado, modelos de formação de célula de espuma não representam qualquer alteração induzida por transmigratory monócitos ou efeitos de ativação endotelial, que é conhecido por contribuir para a formação de célula14de espuma. Além disso, estes sistemas induzem espuma formação de células de macrófagos aderiu às placas de cultura de células através da adição de saturar as concentrações de lipoproteína de baixa densidade oxidada exógenos (RJ)15,16, um indutor de chave de formação de célula de espuma. LDL usada nestes modelos é muitas vezes oxidado por processos não fisiologicamente-relevantes como CuSO4 tratamento17, portanto, questionando a importância fisiológica de estudos usando estes modelos.
Aqui descrevemos um ensaio que quantifica a transmigração de monócitos e formação de célula de espuma das mesmas células que não requer a adição de RJ exógeno, assim, melhor modelagem o papel dos monócitos na formação de células de espuma. Este modelo foi originalmente desenvolvido pelo Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)18e foi ainda mais refinado em nosso laboratório para avaliar ex vivo a caracterizações de monócitos isolados sob não-ativação condições de indivíduos com condições inflamatórias subjacentes que acompanham doenças como HIV infecção19 bem como envelhecimento20, que estão associados com um risco aumentado de aterosclerose. Este modelo também fornece uma plataforma para responder questões biológicas básicas sobre a propensão de subconjuntos diferentes monócito forma espuma células20, a influência da ativação endotelial por citocinas como TNF na formação de célula de espuma14 e as propriedades migratórias de monócitos, tais como a profundidade e a velocidade de transmigração em géis19. Além disso, formação de células de transmigração e espuma de monócito pode ser quantificada usando microscopia padrão, vive a imagem latente da pilha, citometria de fluxo imagem e citometria de fluxo, portanto, fornecendo um método versátil para avaliar o papel de monócitos em atherogenesis.
O protocolo descrito aqui oferece um método versátil e fisiologicamente relevante para avaliar as caracterizações de monócitos de coortes clínicos humanos, combinando ambos transmigração de monócitos e formação de célula de espuma. Este modelo oferece vantagens sobre métodos alternativos de formação de célula de espuma, pois leva em consideração o efeito da transmigração de monócitos na formação de célula de espuma e permite a medição da transmigração reversa6 além da …
The authors have nothing to disclose.
Os autores, com gratidão, reconhecer o trabalho do Prof William Muller e Dr. Clare Westhorpe para seu papel-chave no desenvolvimento de iterações anteriores deste modelo. Os autores também gostaria de agradecer o núcleo de citometria de fluxo AMREP para a classificação de monócitos subconjuntos e Alfred Hospital infecciosa doença unidade clínica enfermeiras para o recrutamento de indivíduos HIV + para alguns estudos de investigação. Os autores reconhecem com gratidão a contribuição para este trabalho o programa de apoio, Victoria, de operacional infra-estrutura recebido pelo Instituto de Burnet. TAA é suportado por um RMIT University Vice-Chanceler do Postdoctoral Fellowship. Este trabalho foi apoiado pela concessão de projeto NHMRC 1108792 atribuído a AJ e AH. TK é suportado pelo NIH concede NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # UL1TR000124.
Gel preparation reagents | |||
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465-500G | 0.1 M NaOH diluted in H20 |
10X M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
AcCOOH | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | 20 mM Acetic acid diluted in H20 |
Cultrex Bovine Collagen I | R&D Systems | 3442-050-01 | Type I Fibrous Collagen |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture | |||
M199 | Life Technologies | 11150-059 | M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine and 100 U/mL penicillin/streptomycin |
M20 | Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199. |
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HUVEC | Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially. | ||
Human coronary artery endothelial cells | Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially. | ||
EDTA | BDH Merck | 10093.5V | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) – 0.5 M, pH 8.0 |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889-500G | Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) – 1 mM, pH 8.0 |
0.05% trypsin EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X) |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | L-glutamine (200 mM) |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin) |
New born calf serum | Gibco | 16010-142 | New born calf serum: New Zealand origin |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1056-1MG | Fibronectin – 50 µg/mL aliquots prepared and stored |
PBS (1X) | Gibco | 14200-075 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10X): Dilute to 1X with sterile H20 |
0.1% TNF | Gibco | PHC3015 | Recombinant human TNF – Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots |
Low-density lipoprotein | Merck Millipore | LP2-2MG | Low-density lipoprotein (LDL) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscopy | |||
1 or 2% formaldehyde | Polysciences | 4018 | 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20 |
50% and 78% methanol | Ajax Finechem | 318-2.5L GL | 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20 |
Oil Red O stain | Sigma-Aldrich | O0625-25G | Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol |
Microscope slides | Mikro-Glass | S41104AMK | Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm) |
Cover slips | Menzel-Gläser | MENCS224015GP | 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips |
Double-sided tape | 3M Scotch | 4011 | Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m) |
Giemsa stain | Merck Millipore | 1.09204.0500 | Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20) |
Hole punch | Hand-held single hole punch (6.35 mm punch) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Flow cytometry | |||
Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL |
35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes | BD Biosciences | 352235 | 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes |
Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain | Life Technologies | L34959 | Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain |
FACS wash | Prepare by mixing 1 X PBS–, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Plasticware | |||
96 well plate | Nunclon | 167008 | Delta surface flat-bottomed 96 well plate |
10 cm Petri Dish | TPP | 93100 | Sterile 10 cm Petri dish |
1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | Eppendorf tubes |
Transfer pipette | Samco Scientific | 222-20S | Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb) |