単球輪廻と慢性炎症性疾患を持つ個人から泡沫細胞の形成の定量化
Summary
ひと内皮細胞膜間での単球によって輪廻と泡沫細胞にその後成熟を測定するプロトコルについて述べる。これは、別の病気の条件を持つ人々 から分離した単球の動脈硬化特性を評価するために、この傾向を高めるかもしれない血の要因を評価する汎用性の高い方法を提供します。
Abstract
冠動脈疾患 (CAD) は、罹患率と死亡率の世界の主要な原因です。アテローム性動脈硬化、主要な CAD の原因、太い動脈に動脈壁の中に含まれる脂肪質の縞と呼ばれる堆積した脂質の炎症性サイトに生得の免疫球輪廻によって開始されます。動脈硬化の初期段階での病変の重要な病原性機能は、泡沫細胞や脂質を含んだマクロファージを形成する動脈に移行する単球の成熟です。かなりの証拠は、リウマチ性関節炎、HIV と一般的な高齢化などの疾患に伴う慢性炎症性条件によってアテローム性動脈硬化のリスクが増加して単球によってこのリスクを予測する仮説をサポートしています活性化。マウス モデルは、粥状動脈硬化体内の単球の役割を調査するための良いプラットフォームを提供する、彼らは自然コレステロール代謝の遺伝的変化と通常のマウスの食事療法の抜本的な変更が必要し、の適合性が限られています。人間の併存症動脈硬化の影響の研究。これは定義されている病気の状態を持つ個人から分離した単球の atherogenic 潜在性を測定する人間の in vitroモデルを開発する動機。現在、人間の in vitroモデルは、単独で単球輪廻と発泡体細胞の形成を評価することを制限しています。ここでのプロトコルについて述べる患者血液から分離した単球は 1 型コラーゲン マトリックスにひと内皮細胞に執し、外因性の脂質の存在の有無で泡沫細胞に成熟する彼らの傾向を測定します。プロトコルは、HIV 感染症を持つ個人と高齢の HIV 感染者から精製したひと単球の使用のために検証されています。このモデルは汎用性とどちらか顕微鏡を用いて評価する単球輪廻と発泡セルを形成可能またはフローサイトメトリーと同様、動脈硬化の要因の評価を許可する血清・血漿中存在します。
Introduction
単球の輪廻転生は、血栓症、心筋梗塞や脳卒中につながる動脈硬化性プラークの開発の重要なステップです。大きな動脈、堆積した脂質が内皮細胞の活性化に貢献し、炎症1をローカライズする培地で低振動血流のサイトで一般に存在している脂肪すじから動脈硬化性プラークを開発します。単球単球走化性タンパク質 (CCL2) などを介して脂肪筋の血管内皮細胞に補充され、内膜2に生まれ変わる。次の輪廻転生、単球は動脈硬化、脂質を含んだマクロファージ泡沫細胞脂質摂取、脂質の合成、コレステロール排出のダウンレギュレーションをまたは上記の要因の組み合わせの結果と呼ばれるフォームがあります。単球がありますも循環の脂質を蓄積し、’泡’ の表現型、発泡セル形成3,4のセルをおそらく素因があります。泡沫細胞が脂肪質の縞と早期動脈硬化性プラークの定義の特徴とその形成は脂質および炎症性メディエーター5を受けます。単球が逆にする能力を持っている代わりに、動脈からの血流に6、それにより内膜動脈の健康を維持する作用から脂質を除去する輪廻転生。
単球の傾向を決定する動脈内皮に執し、フォーム泡沫細胞内膜、または逆に輪廻転生しプラークから脂質を運ぶ、増加における単球活性化の役割を理解するための重要な要件は、動脈硬化のリスク。動脈硬化など CADs のマウス ・ モデル、リアルタイム体内脂肪ストリーク/動脈硬化性プラークの開発についての解明に重要です。ただし、これらのモデルは、処理能力により、(アポ/欧米型食事モデル) などダイエット7,8, 抜本的な変化と相まって通常これらの動物の自然なコレステロールの遺伝的変化を必要とドライブ プラーク開発のレベル脂質を循環の非生理的集積を誘導します。これらのモデルは関連性慢性炎症性人間などの条件に HIV 感染を増加コレステロールまたは低密度リポタンパク質 (LDL) のレベルを循環させるのに関連付けられていない限られている可能性があります。さらに、人間とマウスの単球生物の違いは、単球のサブポピュレーションの関連性に関する免疫学的質問のテスト (中間単球など (CD14 ++CD16+))9難しい。これは、心血管疾患の中間単球数が心血管イベント10,11を独立して予測運転のメカニズムを勉強するときに重要です。順番にどちらか単球輪廻や発泡セルにおける分離を測定する試金が存在するは、臨床コホートから同じ細胞を用いた初期の動脈硬化の両方の側面を定量化するための in vitroアッセイは検証されてはないです。Transwell モデルは変更された Boyden 二院制システム細胞上部室に読み込まれ、多孔質プラスチック障壁または単層細胞走化性因子12メディアが通常含まれる下院に輪廻転生を利用します。,13白血球輪廻の分析に広く使用されているこれらのモデルのソリューションに移行する転生セルの結果、内膜を表すレイヤーを一般的には含めないようにと泡沫細胞の測定を許可しない。形成または同じセルの逆輪廻。逆に、泡沫細胞の形成のモデルは単球または泡の細胞形成14に貢献する知られている内皮細胞活性化の効果を輪廻による変更は考慮されません。さらに、これらのシステムは、泡を誘発する外因性の酸化低密度リポ蛋白質 (酸化 Ldl)15,16、キー インデューサの濃度が飽和状態の添加による細胞培養皿に付着したマクロファージから細胞の形成泡沫細胞の形成。これらのモデルで使用される LDL 酸化され、しばしば CuSO4治療17など非生理的-関連プロセスしたがって、これらのモデルを用いた研究の生理学的な重要性を問います。
ここ我々 こうして泡沫細胞の形成の単球の役割をより良いモデリング単球輪廻と同じセルの外因性の酸化 Ldl の添加を必要としない細胞の泡形成を定量化する試金を記述します。このモデルはもともと教授ウィリアム ・ ミュラー (ノースウェスタン大学、シカゴ)18, によって開発され、前のヴィヴォ非アクティブ化の下で分離された単球のクレンチアゼムを評価する私たちの研究室でさらに洗練されてきた条件個人から20を老化し同様、HIV 感染19などの疾患に伴う基礎の炎症性疾患、動脈硬化症のリスクの増加に関連付けられています。このモデルはまたフォーム発泡セル20、泡沫細胞の形成14 日時 TNF などのサイトカインによる内皮活性化の影響に異なる単球サブセットの性向に関する基本的な生物学的質問に答えるためのプラットフォームを提供しますと単球、深さなどの渡り鳥のプロパティとゲル19の輪廻の速度。さらに、単球の輪廻と泡の細胞の形成の標準的な顕微鏡を用いて定量化することができます、シス、フローサイトメトリー、フローサイトメトリーおよびイメージングの流れ、したがって、粥状動脈硬化の単球の役割を評価する汎用性の高い方法を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明したプロトコルでは、単球輪廻と泡沫細胞の形成の両方を組み合わせることによって人間の臨床コホートから単球のクレンチアゼムを評価するための汎用性と関連する生理学的方法を提供しています。このモデルは、単球輪廻泡沫細胞の形成の影響を考慮し、逆輪廻6に加えて固有の測定が可能泡沫細胞の形成の方法上の利点を提供しています外因性の要因の有無…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は感謝して、このモデルの以前のイテレーションの開発の重要な役割の教授ウィリアム ・ ミュラーと博士クレア Westhorpe の仕事を認めます。著者が単球の並べ替え AMREP フローサイトメトリー コアに感謝したいまたサブセットおよびアルフレッド病院伝染病ユニット臨床研究 HIV + いくつかの研究のため個人の募集看護師。著者より感謝バーネット研究所受けたビクトリア運用インフラストラクチャ サポート プログラムのこの作品に貢献します。TAA は、RMIT 大学副-一等書記官のポスドク研究員プログラムによってサポートされます。この作品は、NHMRC プロジェクト助成金 1108792 AJ と AH に授与によって支えられました。TK に支えられて NIH 助成金 NIH K08AI08272、NIH/NCATS グラント # UL1TR000124。
Materials
| Gel preparation reagents | |||
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465-500G | 0.1 M NaOH diluted in H20 |
| 10X M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
| AcCOOH | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | 20 mM Acetic acid diluted in H20 |
| Cultrex Bovine Collagen I | R&D Systems | 3442-050-01 | Type I Fibrous Collagen |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| M199 | Life Technologies | 11150-059 | M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine and 100 U/mL penicillin/streptomycin |
| M20 | Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199. |
||
| HUVEC | Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially. | ||
| Human coronary artery endothelial cells | Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially. | ||
| EDTA | BDH Merck | 10093.5V | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) – 0.5 M, pH 8.0 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889-500G | Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) – 1 mM, pH 8.0 |
| 0.05% trypsin EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | L-glutamine (200 mM) |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin) |
| New born calf serum | Gibco | 16010-142 | New born calf serum: New Zealand origin |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1056-1MG | Fibronectin – 50 µg/mL aliquots prepared and stored |
| PBS (1X) | Gibco | 14200-075 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10X): Dilute to 1X with sterile H20 |
| 0.1% TNF | Gibco | PHC3015 | Recombinant human TNF – Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots |
| Low-density lipoprotein | Merck Millipore | LP2-2MG | Low-density lipoprotein (LDL) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| 1 or 2% formaldehyde | Polysciences | 4018 | 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20 |
| 50% and 78% methanol | Ajax Finechem | 318-2.5L GL | 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20 |
| Oil Red O stain | Sigma-Aldrich | O0625-25G | Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol |
| Microscope slides | Mikro-Glass | S41104AMK | Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm) |
| Cover slips | Menzel-Gläser | MENCS224015GP | 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips |
| Double-sided tape | 3M Scotch | 4011 | Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m) |
| Giemsa stain | Merck Millipore | 1.09204.0500 | Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20) |
| Hole punch | Hand-held single hole punch (6.35 mm punch) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry | |||
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL |
| 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes | BD Biosciences | 352235 | 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes |
| Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain | Life Technologies | L34959 | Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain |
| FACS wash | Prepare by mixing 1 X PBS–, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96 well plate | Nunclon | 167008 | Delta surface flat-bottomed 96 well plate |
| 10 cm Petri Dish | TPP | 93100 | Sterile 10 cm Petri dish |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | Eppendorf tubes |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 222-20S | Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb) |
References
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