Summary

Quantification de Monocyte Transmigration et de la Formation de mousse cellulaire par des individus souffrant de maladies inflammatoires chroniques

Published: October 17, 2017
doi:

Summary

Les auteurs décrivent un protocole visant à mesurer la transmigration de monocytes dans l’ensemble des monocouches endothéliales humaines et leur maturation ultérieure en cellules spumeuses. Cela fournit une méthode polyvalente pour évaluer les propriétés athérogènes des monocytes isolés de personnes atteintes de différentes maladies et d’évaluer des facteurs dans le sang qui peut améliorer cette propension.

Abstract

Coronaropathie (CP) est des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. L’athérosclérose, une importante cause de CAD, est initiée par la transmigration des monocytes immunitaires innées vers les sites inflammatoires des lipides déposés appelées veines grasses, qui sont présents dans les parois artérielles du milieu aux grandes artères. La principale caractéristique de pathogène des lésions à ce stade précoce de l’athérosclérose est la maturation des monocytes qui migrent dans les artères pour former les cellules spumeuses ou macrophages chargés de lipides. De nombreux témoignages appuient l’hypothèse de risque d’athérosclérose est porté par des affections inflammatoires chroniques qui accompagnent les maladies comme l’arthrite rhumatoïde et le VIH, ainsi que vieillissement général, et que ce risque est prédite par les monocytes activation. Modèles murins fournissent une bonne plate-forme pour enquêter sur le rôle des monocytes dans l’athérogenèse in vivo, ils nécessitent une modification génétique du métabolisme du cholestérol naturel et altération drastique des diètes de souris normales et ont peu de pertinence pour l’étude des influences athérogènes des maladies comorbides humaine. Cela nous motivés pour développer un modèle humain in vitro permettant de mesurer le potentiel athérogène des monocytes isolés de personnes atteintes de maladies déterminées. Actuellement, les modèles humains in vitro limitent qu’ils évaluent la formation des cellules monocytes transmigration et de la mousse dans l’isolement. Nous décrivons ici un protocole dans lequel monocytes isolés du sang de patients transmigrer dans les cellules endothéliales humaines dans une matrice de collagène de type 1, et leur propension à se transforment en cellules spumeuses en présence ou en absence de lipides exogènes est mesurée. Le protocole a été validé pour l’utilisation des monocytes humains purifiée à partir d’individus infectés par le VIH et les personnes âgées de VIH non infecté. Ce modèle est polyvalent et permet la formation des cellules monocytes transmigration et de la mousse à évaluer à l’aide d’un microscope ou écoulement cytometry comme permettant l’évaluation des facteurs athérogènes présentes dans le sérum ou le plasma.

Introduction

Transmigration de monocytes est une étape cruciale dans le développement de la plaque athéromateuse qui peut conduire à des thromboses, accidents vasculaires cérébraux et infarctus du myocarde. Les plaques d’athérome se développent à partir des stries gras, généralement présents sur les sites de faible irrigation sanguine oscillatoire dans le milieu de grosses artères, où les lipides déposés contribue à l’activation endothéliale et localisé l’inflammation1. Monocytes sont recrutés aux cellules endothéliales en stries gras par l’intermédiaire de protéines chimiotactiques monocyte (tels que CCL2) et transmigrer dans l’ intima2. Suite de transmigration, monocytes peuvent former des macrophages athérogènes, chargées de lipides appelés cellules spumeuses suite à l’absorption de lipides, synthèse des lipides, régulation négative de l’efflux de cholestérol ou une combinaison de ces facteurs. Monocytes peuvent également accumuler des lipides dans la circulation et ont un phénotype « mousseux », éventuellement prédisposant cellules de mousse cellule formation3,4. Cellules spumeuses sont la caractéristique déterminante des traînées grasses et les plaques d’athérosclérose précoce et leur formation est influencée par les lipides et les médiateurs inflammatoires5. Alternativement, les monocytes ont la capacité d’inverser transmigrer de l’artère dans la circulation sanguine6, éliminant ainsi les lipides de l’intima et intérimaire à maintenir la santé de l’artère.

Déterminer la propension des monocytes à transmigrer dans l’endothélium artériel et cellules de mousse de forme dans l’intima, ou faire marche arrière transmigrer et transporter les lipides hors de la plaque, sont une condition essentielle pour comprendre le rôle de l’activation des monocytes en augmentant risques athérosclérose. Des modèles de souris de CADs telles que l’athérosclérose sont importants à élucider en temps réel en vivo informations sur le développement de la plaque gras strie/athérosclérose. Cependant, ces modèles nécessitent une modification génétique du cholestérol naturel traitement des capacités de ces animaux généralement couplée avec des changements drastiques dans le régime alimentaire (par exemple, le modèle de régime ApoE-/-type occidental)7,8, ainsi, induisant l’accumulation des lipides en circulation non physiologiques niveaux qui stimulent le développement plaque. Ces modèles peuvent ont peu de pertinence aux conditions humaines inflammatoires chroniques tels que l’infection par le VIH qui ne sont pas associés à augmenté en circulation cholestérol ou niveaux de lipoprotéines de basse densité (LDL). En outre, les différences dans la biologie de monocyte entre les humains et les souris font les tests immunologiques questions concernant la pertinence des sous-populations des monocytes (telles que les monocytes intermédiaires (CD14++CD16+))9 difficile. Ceci est important lorsque l’on étudie les mécanismes conduisant les maladies cardiovasculaires comme intermédiaire monocyte comtes prédisent indépendamment des complications cardiovasculaires10,11. Parmi les essais pour mesurer de manière séquentielle ou l’autre formation des cellules monocytes transmigration ou de la mousse dans l’isolement, aucun essai in vitro n’a été validé pour quantifier les deux aspects de l’athérogénèse précoce en utilisant les mêmes cellules de cohortes cliniques. Transwell modèles utilisent un système à deux chambres Boyden modifié par lequel les cellules sont chargés dans la chambre supérieure et transmigrer au-delà d’une barrière en plastique poreux ou une monocouche de cellules dans une chambre inférieure qui contient généralement des médias avec chemoattractant12 , 13. bien que largement utilisée pour analyser la transmigration des leucocytes, ces modèles n’intègrent pas généralement une couche qui représente l’intima, résultant dans des cellules réincarnés migrer vers la solution et ne permettent pas la mesure de la cellule mousse formation ou transmigration inverse des mêmes cellules. À l’inverse, les modèles de formation de mousse cellulaire ne tiennent pas compte pour toute modification induite par la transmigratory de monocytes ou effets d’activation endothéliale qui est appelé à contribuer à mousse cellulaire formation14. En outre, ces systèmes induisent mousse la formation des cellules de macrophages respectés plaques de culture cellulaire par l’ajout de concentrations saturantes d’exogène, LDL oxydées (LDLOx)15,16, un inducteur de la clé de formation de mousse de cellules. LDL utilisé dans ces modèles est souvent oxydé par des procédés non physiologiquement-pertinents tels que CuSO4 traitement17, par conséquent, questionner l’importance physiologique des études à l’aide de ces modèles.

Nous décrivons ici une analyse qui quantifie la transmigration de monocytes et de la formation de cellules de mousse des cellules mêmes qui ne nécessite pas l’ajout de LDLOx exogène, donc meilleure modélisation du rôle des monocytes dans la formation de cellules de mousse. Ce modèle a été développé par le professeur William Muller (Northwestern University, Chicago)18et a été encore affiné dans notre laboratoire pour évaluer ex vivo l’athérogénicité des monocytes isolés sous non activation conditions émanant de particuliers sous-jacents des conditions inflammatoires accompagnant les maladies comme le VIH infection19 ainsi que le vieillissement20, qui sont associés à une augmentation du risque de l’athérosclérose. Ce modèle fournit également une plate-forme pour répondre à des questions biologiques fondamentales concernant la propension des sous-ensembles différents monocyte forme mousse cellules20, l’influence de l’activation endothéliale par les cytokines comme le TNF sur la formation de cellules de mousse14 et les propriétés migratoires des monocytes telles que la profondeur et la vitesse de la transmigration en gels19. En outre, formation des cellules monocytes transmigration et de la mousse peut être quantifiée à l’aide de la microscopie standard, vivre l’imagerie cellulaire, cytométrie en imagerie et cytométrie en flux, par conséquent, fournissant une méthode polyvalente afin d’évaluer le rôle des monocytes dans l’athérogenèse.

Protocol

Remarque : toutes les expériences à l’aide d’échantillons biologiques humains ont été effectués avec l’approbation de l’éthique de la Commission d’éthique humaine Alfred Hospital, Melbourne. Toutes les expériences ont été effectuées dans les armoires de la sécurité biologique de classe II, sauf si précisé. " Prewarmed " se rapporte aux réactifs chauffés à 37 ° C dans un bain d’eau. 1. préparation de Type I fibreux collagène Gels : jour 1 …

Representative Results

Quantifier la transmigration de monocyte Monocytes sont ajoutés au modèle tel que décrit à la Figure 1, et 6 gels sont préparés pour chaque condition. Monocytes pour 6 gels par donneur (i.e.5.0 x 104 monocytes par gel 6 gels = 3.0 x 105 monocytes par donneur) sont remises en suspension pour un volume final de 600 µL de M199 médias contenant les…

Discussion

Le protocole décrit ici vous propose une méthode polyvalente et physiologiquement pertinente pour évaluer l’athérogénicité des monocytes de cohortes cliniques humaines, en combinant les transmigration de monocyte et formation de cellules de mousse. Ce modèle offre des avantages par rapport aux autres méthodes de formation de mousse cellulaire car il prend en compte l’effet de la transmigration de monocyte sur la formation de mousse cellulaire et permet la mesure de transmigration inverse6</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient les travaux du Prof. William Muller et Dr Clare Westhorpe pour leur rôle clé dans le développement d’itérations précédentes de ce modèle. Les auteurs tiens également à remercier le noyau AMREP Flow Cytometry pour le triage des monocytes sous-ensembles et la Alfred Infectious Disease unité hospitalière clinique infirmières pour le recrutement d’individus séropositifs pour certaines études de recherche. Les auteurs remercient la contribution à ce travail, de l’Infrastructure opérationnelle Victoria programme de soutien reçus par l’Institut Burnet. TAA est pris en charge par un RMIT University rectorale bourse postdoctorale. Ce travail a été soutenu par la subvention de projet NHMRC 1108792 attribué à AJ et AH. TK est pris en charge par NIH accorde NIH K08AI08272, Grant NIH/NCATS # UL1TR000124.

Materials

Gel preparation reagents
NaOH Sigma-Aldrich 221465-500G 0.1 M NaOH diluted in H20
10X M199 Sigma-Aldrich M0650
AcCOOH Sigma-Aldrich 695092-100ML 20 mM Acetic acid diluted in H20
Cultrex Bovine Collagen I R&D Systems 3442-050-01 Type I Fibrous Collagen
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
M199 Life Technologies 11150-059 M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate.
Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine  and 100 U/mL penicillin/streptomycin 
M20 Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum.
Individual lipid species such as LDL can be added to M199.
HUVEC Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially.
Human coronary artery endothelial cells Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially.
EDTA BDH Merck 10093.5V Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) – 0.5 M, pH 8.0
EGTA Sigma-Aldrich E3889-500G Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) – 1 mM, pH 8.0
0.05% trypsin EDTA Gibco 25300-054 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X)
L-glutamine Gibco 25030-081 L-glutamine (200 mM)
Penicillin/streptomycin  Gibco 15140-122 Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin)
New born calf serum Gibco 16010-142 New born calf serum: New Zealand origin
Fibronectin Sigma-Aldrich F1056-1MG Fibronectin – 50 µg/mL aliquots prepared and stored
PBS (1X) Gibco 14200-075 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10X): Dilute to 1X with sterile H20
0.1% TNF Gibco PHC3015 Recombinant human TNF – Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots
Low-density lipoprotein Merck Millipore LP2-2MG Low-density lipoprotein (LDL)
Name Company Catalog Number Comments
Microscopy
1 or 2% formaldehyde Polysciences 4018 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20
50% and 78% methanol Ajax Finechem 318-2.5L GL 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20
Oil Red O stain Sigma-Aldrich O0625-25G Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol
Microscope slides Mikro-Glass S41104AMK Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm)
Cover slips Menzel-Gläser MENCS224015GP 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips
Double-sided tape 3M Scotch 4011 Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m)
Giemsa stain Merck Millipore 1.09204.0500 Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20)
Hole punch Hand-held single hole punch (6.35 mm punch)
Name Company Catalog Number Comments
Flow cytometry
Collagenase D Roche Diagnostics 11088858001 Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL 
35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes BD Biosciences 352235 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes
Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain Life Technologies L34959 Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain
FACS wash Prepare by mixing 1 X PBS, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum
Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
96 well plate Nunclon 167008 Delta surface flat-bottomed 96 well plate
10 cm Petri Dish TPP 93100 Sterile 10 cm Petri dish
1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 0030 125.150 Eppendorf tubes
Transfer pipette Samco Scientific 222-20S Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb)

References

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Cite This Article
Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Maisa, A., Kelesidis, T., Jaworowski, A. Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions. J. Vis. Exp. (128), e56293, doi:10.3791/56293 (2017).

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