التحديد الكمي للتهجير الوحيدات وتشكيل خلية الرغاوي من الأفراد ذوي الأمراض المزمنة التحريضية
Summary
يصف لنا وضع بروتوكول لقياس الهجرة الداخلية وحيدات عبر مونولاييرس بطانية البشرية وعلى نضج اللاحقة إلى خلايا الرغاوي. وهذا يوفر طريقة مرنة لتقييم خصائص atherogenic وحيدات معزولة عن الناس مع ظروف المرض المختلفة وتقييم العوامل في الدم التي قد تعزز هذا الميل.
Abstract
مرض الشريان التاجي (CAD) سبب الرئيسي للاعتلال والوفيات في جميع أنحاء العالم. تصلب الشرايين، رائدة يسبب كندي، تبدأ بالتهجير وحيدات المناعة الفطرية لمواقع تحريضية المودعة دهن يسمى الشرائط الدهنية، التي موجودة في جدران الشرايين المتوسطة للشرايين الكبيرة. الميزة الرئيسية المسببة للأمراض للآفات في هذه المرحلة المبكرة من تصلب الشرايين هو نضوج وحيدات التي تهاجر إلى الشرايين لتشكيل خلايا الرغاوي أو الضامة محملة بالدهن. أدلة كثيرة تدعم الفرضية القائلة بأن يزداد خطر تصلب الشرايين بالظروف الملتهبة المزمنة المصاحبة لأمراض مثل التهاب المفاصل، وفيروس نقص المناعة البشرية، فضلا عن الشيخوخة عامة، وأن هذا الخطر المتوقع الوحيدات التنشيط. بينما نماذج الماوس يوفر منبرا جيدا التحقيق في دور وحيدات في أثيروجينيسيس في فيفو، أنها تتطلب التعديلات الوراثية استقلاب الكولسترول الطبيعية وتغيير جذري من الماوس العادي الوجبات الغذائية، وحدت من صلاحية دراسة التأثيرات atherogenic الأمراض البشرية المرضية. وهذا دفعتنا إلى وضع نموذج بشرية في المختبر لقياس إمكانات atherogenic وحيدات المعزولة من الأفراد المصابين بمرض محدد الدول. حاليا، تعمل على الحد من النماذج البشرية في المختبر في ذلك أنهم تقييم تشكيل خلية التهجير والرغوة الوحيدات في عزلة. هنا يمكننا وصف بروتوكول الذي ترانسميجراتي وحيدات معزولة من دم المريض عبر الخلايا البطانية البشرية في مصفوفة الكولاجين من نوع 1، وميلها إلى أن تنضج إلى خلايا الرغاوي في وجود أو عدم وجود الدهن الخارجية يقاس. تم التحقق من البروتوكول لاستخدام الإنسان وحيدات تنقيته من الأفراد المصابين بعدوى فيروس نقص المناعة البشرية والمسنين فيروس نقص المناعة البشرية وقاية الأفراد. هذا النموذج هو تنوعاً ويسمح الوحيدات التهجير والرغوة تشكيل خلية تقييم استخدام أما مجهرية أو التدفق الخلوي، فضلا عن السماح لتقييم العوامل atherogenic الموجودة في المصل أو البلازما.
Introduction
التهجير الوحيدات هو خطوة حاسمة في تطوير لوحة تصلب الشرايين قد تؤدي إلى تجلط الدم والسكتة الدماغية واحتشاء عضلة القلب. تطوير لويحات تصلب الشرايين من الشرائط الدهنية، عموما موجودة في مواقع تدفق الدم المنخفض متذبذبة في المتوسطة للشرايين الكبيرة، حيث يساهم في تفعيل غشائي الدهن المودعة والمترجمة التهاب1. وحيدات ويجند إلى خلايا بطانية في الشرائط الدهنية عن طريق البروتينات chemotactic الوحيدات (مثل CCL2)، وترانسميجراتي في البطانية2. وبعد التهجير، قد تشكل وحيدات الضامة atherogenic، محملة بالدهن تسمى خلايا الرغاوي نتيجة لامتصاص الدهون، والدهون التوليف، أسفل-تنظيم افلوكس نسبة الكولسترول في الدم أو مزيج من العوامل المذكورة أعلاه. أيضا قد وحيدات تتراكم الدهون في الدورة الدموية وقد ‘مزبد’ النمط الظاهري، ربما مؤهبة الخلايا للرغوة خلية تشكيل3،4. خلايا الرغاوي هي السمة المميزة للشرائط الدهنية ولويحات تصلب الشرايين في مرحلة مبكرة وتشكيلاتها ويتأثر بالدهن ووسطاء التهابات5. وبدلاً من ذلك، وحيدات لديها القدرة على عكس ترانسميجراتي من الشريان في مجرى الدم6، وبالتالي إزالة الدهن من البطانية والنيابة للحفاظ على صحة الشريان.
تحديد ميل وحيدات إلى ترانسميجراتي عبر البطانة الشريانية وشكل رغوة الخلايا البطانية، أو لعكس ترانسميجراتي وتحمل الدهون خارج اللوحة، وهو مطلب أساسي لفهم دور التنشيط الوحيدات في زيادة خطر تصلب الشرايين. نماذج الماوس من الأوغاد مثل تصلب الشرايين هامة في توضيح المعلومات في الوقت الحقيقي في فيفو الانتصارات الدهنية/تصلب الشرايين البلاك التنمية. ومع ذلك، تتطلب هذه النماذج من تعديلات وراثية الكولسترول الطبيعية تجهيز قدرات هذه الحيوانات عادة ما تكون مقترنة بتغييرات جذرية في النظام الغذائي (مثل نموذج النظام الغذائي نوع الذين/الغربية)7،8، وبالتالي، حمل تراكم غير الفسيولوجية لتعميم المادة الدهنية المستويات الذي وضع اللوحة محرك الأقراص. قد تكون هذه النماذج محدودة تتصل بالظروف البشرية الالتهابات المزمنة مثل الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، التي لا ترتبط بزيادة تعميم مستويات low-density lipoprotein (LDL) أو الكوليسترول. وعلاوة على ذلك، جعل الاختلافات بين البشر والفئران في البيولوجيا الوحيدات اختبار المناعية أسئلة فيما يتعلق بمدى ملاءمة للفئات السكانية الفرعية وحيدات (مثل وحيدات الوسيطة (CD14++CD16+))9 صعبة. هذا مهم عند دراسة آليات القيادة الأمراض القلبية الوعائية كما التهم الوحيدات الوسيطة بشكل مستقل التنبؤ بأحداث القلب والأوعية الدموية10،11. على الرغم من وجود فحوصات لقياس التتابع أما الوحيدات التهجير أو الرغوة تشكيل الخلية في عزلة، تم التحقق من لا تحليل في المختبر للتحديد الكمي لكل جوانب atherogenesis المبكر باستخدام نفس الخلايا من الأفواج السريرية. نماذج ترانسويل الاستفادة من نظام مجلسين Boyden معدلة حيث يتم تحميلها إلى قاعة كبار الخلايا وترانسميجراتي عبر الحاجز البلاستيكية المسامية أو أحادي الطبقة خلية في مجلس النواب الذي عادة ما يحتوي على وسائط الإعلام مع تشيمواتراكتانت12 , 13-حين تستخدم على نطاق واسع لتحليل الكريات البيض التهجير، هذه النماذج لا تتضمن عموما طبقة تمثل البطانية، أسفر عن الخلايا ترانسميجراتيد هاجروا إلى الحل، ولا تسمح بقياس الخلية الرغوة تشكيل أو الهجرة العكسية من نفس الخلايا. على العكس من ذلك، نماذج لتشكيل خلية الرغاوي لا تراعي أي تغييرات ترانسميجراتوري الناجمة عن وحيدات أو آثار غشائي التنشيط التي من المعروف أن تسهم رغوة الخلية تشكيل14. وعلاوة على ذلك، حمل هذه النظم رغوة تشكيل خلية من الضامة التقيد بلوحات ثقافة الخلية بإضافة تشبع تركيزات خارجية المؤكسد low-density lipoprotein (أوكسلدل)15،16، ومحفِّز رئيسي تشكيل خلية الرغاوي. LDL المستخدمة في هذه النماذج هي غالباً ما تتأكسد بغير-فيزيولوجيا-العمليات ذات الصلة مثل CuSO4 العلاج17، ولذلك التشكيك في أهمية الفسيولوجية للدراسات باستخدام هذه النماذج.
هنا يصف لنا مقايسة التي يوضحها التهجير الوحيدات وتشكيل خلية الرغاوي من نفس الخلايا التي لا تتطلب إضافة أوكسلدل الخارجية، وبالتالي تحسين نمذجة دور وحيدات في تشكيل خلية الرغاوي. هذا النموذج قد وضعت أصلاً من قبل البروفيسور ويليام مولر (جامعة نورث وسترن، شيكاغو)18، وقد تم صقل في المختبر لتقييم السابقين فيفو أثيروجينيسيتي وحيدات معزولة تحت عدم تفعيل شروط من الأفراد مع الظروف الكامنة وراء الالتهابات المصاحبة للأمراض مثل الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية19 ، فضلا عن الشيخوخة20، التي ترتبط بزيادة خطر الإصابة بتصلب الشرايين. هذا النموذج أيضا منبرا للرد على الأسئلة البيولوجية الأساسية فيما يتعلق بالميل لمجموعات فرعية مختلفة الوحيدات إلى شكل رغوة خلايا20، تأثير غشائي التنشيط بواسطة السيتوكينات مثل تنف في تشكيل خلية الرغوة14 ، وخصائص الهجرة وحيدات مثل عمق وسرعة من التهجير في الهلام19. وعلاوة على ذلك، تشكيل خلية التهجير والرغوة الوحيدات يمكن قياسها كمياً باستخدام الفحص المجهري القياسية، يعيش تصوير الخلية، التدفق الخلوي وتصوير التدفق الخلوي، وبالتالي، توفر طريقة مرنة لتقييم دور وحيدات في أثيروجينيسيس.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويتيح البروتوكول الموصوفة هنا طريقة تنوعاً وفسيولوجيا ذات الصلة لتقييم أثيروجينيسيتي وحيدات من الأفواج السريرية البشرية، عن طريق الجمع بين التهجير الوحيدات وتشكيل خلية الرغاوي. هذا الطراز يوفر مزايا أكثر من الأساليب البديلة لتشكيل خلية رغوة كما أنه يأخذ في الاعتبار أثر التهجير الوحيدا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب الاعتراف بامتنان عمل البروفيسور ويليام مولر والدكتور كلير ويستهوربي لدورها الرئيسي في تنمية تكرارات السابقة من هذا الطراز. الكتاب أيضا يود أن يشكر الأساسية “أمريب التدفق الخلوي” لفرز الوحيدات مجموعات فرعية و “الفريد المستشفى المعدية مرض الوحدة” السريرية البحثية الممرضات لتجنيد أفراد فيروس نقص المناعة البشرية + لبعض الدراسات. الكتاب امتنان الاعتراف بمساهمة في هذا العمل “فيكتوريا الهياكل الأساسية لدعم البرنامج التشغيلي” تلقاه المعهد برنيت. ﻷعمالهم معتمد من قبل معهد ملبورن الملكي الجامعة نائب مدير الجامعة “زمالات ما بعد الدكتوراه”. وأيد هذا العمل منحة مشروع NHMRC 1108792 التي منحت لجعفر و AH. معتمد المعارف التقليدية التي تمنح K08AI08272 المعاهد الوطنية للصحة، “منح” المعاهد الوطنية للصحة/نكتس # UL1TR000124 من المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Gel preparation reagents | |||
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465-500G | 0.1 M NaOH diluted in H20 |
| 10X M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
| AcCOOH | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | 20 mM Acetic acid diluted in H20 |
| Cultrex Bovine Collagen I | R&D Systems | 3442-050-01 | Type I Fibrous Collagen |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| M199 | Life Technologies | 11150-059 | M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine and 100 U/mL penicillin/streptomycin |
| M20 | Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199. |
||
| HUVEC | Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially. | ||
| Human coronary artery endothelial cells | Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially. | ||
| EDTA | BDH Merck | 10093.5V | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) – 0.5 M, pH 8.0 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889-500G | Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) – 1 mM, pH 8.0 |
| 0.05% trypsin EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | L-glutamine (200 mM) |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin) |
| New born calf serum | Gibco | 16010-142 | New born calf serum: New Zealand origin |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1056-1MG | Fibronectin – 50 µg/mL aliquots prepared and stored |
| PBS (1X) | Gibco | 14200-075 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10X): Dilute to 1X with sterile H20 |
| 0.1% TNF | Gibco | PHC3015 | Recombinant human TNF – Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots |
| Low-density lipoprotein | Merck Millipore | LP2-2MG | Low-density lipoprotein (LDL) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| 1 or 2% formaldehyde | Polysciences | 4018 | 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20 |
| 50% and 78% methanol | Ajax Finechem | 318-2.5L GL | 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20 |
| Oil Red O stain | Sigma-Aldrich | O0625-25G | Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol |
| Microscope slides | Mikro-Glass | S41104AMK | Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm) |
| Cover slips | Menzel-Gläser | MENCS224015GP | 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips |
| Double-sided tape | 3M Scotch | 4011 | Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m) |
| Giemsa stain | Merck Millipore | 1.09204.0500 | Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20) |
| Hole punch | Hand-held single hole punch (6.35 mm punch) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry | |||
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL |
| 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes | BD Biosciences | 352235 | 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes |
| Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain | Life Technologies | L34959 | Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain |
| FACS wash | Prepare by mixing 1 X PBS–, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96 well plate | Nunclon | 167008 | Delta surface flat-bottomed 96 well plate |
| 10 cm Petri Dish | TPP | 93100 | Sterile 10 cm Petri dish |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | Eppendorf tubes |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 222-20S | Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb) |
References
- Napoli, C., et al. Fatty streak formation occurs in human fetal aortas and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 100 (11), 2680-2690 (1997).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7 (2), 77-86 (2010).
- Xu, L., et al. Foamy Monocytes Form Early and Contribute to Nascent Atherosclerosis in Mice With Hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (8), 1787-1797 (2015).
- Jackson, W. D., Weinrich, T. W., Woollard, K. J. Very-low and low-density lipoproteins induce neutral lipid accumulation and impair migration in monocyte subsets. Scientific Reports. 6, 20038 (2016).
- Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Jaworowski, A. Inflammation-induced foam cell formation in chronic inflammatory disease. Immunol. Cell. Biol. 93 (8), 683-693 (2015).
- Llodrá, J., et al. Emigration of monocyte-derived cells from atherosclerotic lesions characterizes regressive, but not progressive, plaques. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (32), 11779-11784 (2004).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal Models of Atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).
- Meir, K. S., Leitersdorf, E. Atherosclerosis in the Apolipoprotein E-Deficient Mouse. A Decade of Progress. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (6), 1006-1014 (2004).
- Hilgendorf, I., Swirski, F. K. Making a difference: Monocyte Heterogeneity in Cardiovascular Disease. Curr. Atheroscler. Rep. 14 (5), 450-459 (2012).
- Rogacev, K. S., et al. Lower Apo A-I and Lower HDL-C Levels Are Associated With Higher Intermediate CD14++CD16+ Monocyte Counts That Predict Cardiovascular Events in Chronic Kidney Disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34 (9), 2120-2127 (2014).
- Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ Monocytes Independently Predict Cardiovascular Events: A Cohort Study of 951 Patients Referred for Elective Coronary Angiography. J. Am. Coll. Cardiol. 60 (16), 1512-1520 (2012).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).
- Boyden, S. The Chemotactic Effect Of Mixtures Of Antibody And Antigen On Polymorphonuclear Leucocytes. J. Exp. Med. 115 (3), 453-466 (1962).
- Westhorpe, C. L. V., et al. Endothelial cell activation promotes foam cell formation by monocytes following transendothelial migration in an in vitro model. Exp. Mol. Pathol. 93, 220-226 (2012).
- Quinn, M. T., Parthasarathy, S., Fong, L. G., Steinberg, D. Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (9), 2995-2998 (1987).
- Henriksen, T., Mahoney, E. M., Steinberg, D. Enhanced macrophage degradation of biologically modified low density lipoprotein. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 3 (2), 149-159 (1983).
- Parthasarathy, S., Raghavamenon, A., Garelnabi, M. O., Santanam, N. Oxidized Low-Density Lipoprotein. Methods Mol. Biol. 610, 403-417 (2010).
- Muller, W. A., Weigl, S. A. Monocyte-selective transendothelial migration: dissection of the binding and transmigration phases by an in vitro assay. J. Exp. Med. 176 (3), 819-828 (1992).
- Maisa, A., et al. Monocytes from HIV-infected individuals show impaired cholesterol efflux and increased foam cell formation after transendothelial migration. AIDS. 29 (12), 1445-1457 (2015).
- Angelovich, T. A., et al. Ex vivo foam cell formation is enhanced in monocytes from older individuals by both extrinsic and intrinsic mechanisms. Exp. Gerontol. 80, 17-26 (2016).
- Westhorpe, C. L. V., et al. Effects of HIV-1 infection in vitro on transendothelial migration by monocytes and monocyte-derived macrophages. J. Leukoc. Biol. 85 (6), 1027-1035 (2009).
- Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. J. Cell Biol. 98 (3), 1033-1041 (1984).
- Müller, A. M., et al. Expression of the Endothelial Markers PECAM-1, vWf, and CD34 in Vivo and in Vitro. Exp. Mol. Pathol. 72 (3), 221-229 (2002).
- Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2017).
- Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
- Gacka, M., et al. Proinflammatory and atherogenic activity of monocytes in Type 2 diabetes. J. Diabetes Complications. 24 (1), 1-8 (2010).
- Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease. Eur. Heart J. 32 (1), 84-92 (2011).
