Cuantificación de la información codificada por el Gene expresión niveles durante la vida útil modulación bajo amplia gama dieta restricción en C. elegans

1. preparación de culturas bacterianas y placas para General Worm cultura preparar 100 mL de medio de caldo (LB) Lisogenia en una botella de vidrio de 250 mL y esterilizar en autoclave. Inocular la botella con una sola Colonia de la cepa de Escherichia coli OP50, incubar a 37 ° C durante la noche y luego almacenar a 4 ° C hasta que se necesite la cultura. Preparar 5 L de crecimiento nematodo estéril mediano (NGM) agar 15 alícuota 12 mL volúmenes y en platos de Petri plástico estéril 6 cm. Permitir que el agar durante la noche y luego almacenar a 4 ° C hasta que sea necesario. Semilla de NGM placas de al menos 3 días antes 225 μL de la cultura OP50 refrigerada. Almacenar las placas a 20 ° C hasta que sea necesario. 2. Preparación de cultivos bacterianos y diluciones para los experimentos de preparar dos porciones de 500 mL de medio LB en un matraz de Erlenmeyer de 2 L y esterilizar en autoclave. Inocular cada frasco con una sola Colonia de OP50 y crecen a 37 ° C, agitación a 200 rpm por alrededor de 14 h. Complementar las culturas con la estreptomicina antibiótico a una concentración final de 50 μg/mL. Continuar agitando por 30 min a 37 ° C luego coloque los frascos en hielo por 15 minutos Transferencia de 450 mL de cada cultivo en botellas de centrífuga estéril separada (idealmente botellas de 500 mL capacidad para evitar rajaduras las culturas). Conservar la cultura sobra en el hielo, ya que se utilizará para determinar la concentración de las bacterias. Desactivación de las botellas a 4500 x g en un sistema de centrífuga refrigerada a 4 ° C por 25 min descartar sobrenadante y almacenar las botellas en el hielo. Diluir 100 μL de cultura sobra cada frasco en 900 μL de estéril lb uso 1 mL de LB estéril a cero el espectrofotómetro y luego determinar el OD 600 de la dilución de 10 veces de cada cultura. Si por ejemplo, el OD 600 de la dilución de 10 veces de la cultura durante la noche es 0.28 entonces la cultura tenía un real OD 600 2.8. Uso una solución de reserva de trabajo de las bacterias de 1.12 x 10 10 OP50 células/mL, que equivale a un OD 600 de 56. Por lo tanto, usando el ejemplo OD 600 de 2.8 desde arriba, Resuspender el precipitado de la cultura de 450 mL en un 20 th del volumen original, que en este caso es de 22,50 mL. Resuspender las bacterias con una solución basal estéril S suplementada con estreptomicina a 50 μg/mL (SB + strep). Resuspender el precipitado en el volumen adecuado de SB estéril + strep. Hacen todas las posteriores concentraciones utilizadas en experimentos de diluciones seriadas de la bolsa de trabajo en SB + estreptococos utilizando los factores de dilución figuran en la tabla 1. 3. Ajuste para arriba vida experimentos Nota: se realizan ensayos de vida útil en cultivo de tejidos de 6 cm tratado con 12 mL de agar NGM suplementado con estreptomicina y carbenicilina (NSC), ambos a una concentración final de 50 μg/mL. Estas placas de cultivo de tejidos son adecuadas para ensayos de vida útil sin ningún o muy baja concentración bacteriana, como los gusanos son significativamente menos propensos a pegarse a la pared de la placa y desecación. El uso de dos antibióticos diferentes evita que la cepa OP50 desarrollando resistencia a los fármacos, que es fundamental en el control de la concentración bacteriana en la placa. También, mediante la inactivación de las bacterias con los antibióticos, minimizar los efectos sobre la vida de gusano debido a la infección por patógenos 16. Esto nos permite considerar sólo los componentes relacionados con la alimentación de la concentración bacteriana en estos experimentos. Muchos estudios de envejecimiento C. elegans suplen placas NGM con el fluoro químicos-2 ′-desoxiuridina (FUdR) para representar los adultos estériles. Sin embargo, el uso de FUdR puede ser problemático ya que su uso puede causar varios problemas de confusión con longevidad ensayos 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Entchev et al., (2015) 12 eludido este problema por la exposición de las larvas L4 a ARNi de huevo-5 22 , 23, que inhibe la transición de ovocitos al embrión mediante el bloqueo de la formación de la cáscara del huevo de fertilizado oocitos de C. elegans, dando por resultado su muerte. Sembradas de cepas cultura el C. elegans que se analiza en planchas NGM 20 ° C. permitir que las placas a morir de hambre hacia fuera para asegurar que todos los animales son cultivados de una manera uniforme y que potencialmente representan efectos transgeneracionales de condiciones del desarrollo. Transferencia de hambre las larvas L1 nuevas placas sembradas de NGM cortando un pequeño trozo de agar (5 mm x 5 mm) de la placa hambrienta con un bisturí estéril y depositarla sobre una placa nueva, un proceso conocido como ' trozos ' por el comm de la investigación de C. elegans unidad 15. Crecen los gusanos hasta que lleguen a la etapa de L4. Cinco larvas L4 por tensión son luego transferidas a placas NGM semillas individuales y mantuvo a 20 ° C. Estos animales representan la generación P0. Uso L4 progenie de la generación de P0 para configurar la generación F1. Coloque individualmente las larvas L4 de F1 de la cepa de tipo salvaje N2 a 30 placas sembradas de NGM. Nota: Para las cepas mutantes, el número de platos necesarios depende de su tasa de crecimiento. Por ejemplo, daf-7(ok3125) los animales experimentan una detención transitoria dauer a 20 ° C. Así, esta variedad produce menos larvas L4 de una placa del tipo salvaje de N2 gusanos. Para compensar esta diferencia, configurar placas de daf-7(ok3125) hasta un día antes que N2 placas y en un número mayor, una buena relación de trabajo es de 3:1. Transferencia sincronizada progenie L4-etapa de los padres de la F1 a NGM placas suplementados con 1 mM IPTG y carbenicilina μg/mL 50 (placas de RNAi) que fueron sembradas con 225 μL de bacterias HT115 expresando dsRNA contra el gen del huevo-5 y mantenerse en 20 ° C por 24 h. Al menos 360 lombrices por tensión, a una densidad de 15 animales por placa, se necesitan por experimento. Después el huevo-5 tratamiento de ARNi, transferir los gusanos a NSC placas sembradas con 225 μL de la OP50 tratados con estreptomicina en una concentración de 2 x 10 9 células/mL (tabla 1) por 24 horas a 20 ° C. Para evitar daños a los gusanos durante esta y todas las transferencias posteriores, suavemente primicia animales de debajo del gusano usando un gusano muy fino suavemente curvado pick. Flotador de los animales del gusano pick sumergiendo en una gota de 10 μl de SB + estreptococos colocados en la superficie de la placa nueva. Al día siguiente, redistribuir los gusanos a las placas de NSC que representa cada uno de lo alimentos los niveles lISTEC en la tabla 1 como un conjunto de placas de NSC que no contienen bacterias. Todas las placas de NSC con 225 μL de la concentración relevante de bacterias de la semilla y las placas de NSC libre de bacterias con SB 225 μL + estreptococos la semilla. Mantener los gusanos con una densidad de 15 animales por placa, dando como resultado al menos cuatro placas por condición del alimento por cepa. Cambiar las placas a la temperatura experimental. Transferencia de gusanos a platos frescos de NSC sembradas con concentración de alimento apropiado según el horario que se indica en la tabla 2. Escoger animales de puntaje movimiento por insistencia suavemente con un alambre. Falta de respuesta se anotó como la muerte. Puntuación de animales para la muerte en cada transferencia punto y entonces todos los días después del último punto de transferencia. 4. Ajuste por proyección de imagen experimentos Nota: los pasos descritos en esta sección son suficientes para generar suficientes lombrices por cepa para la proyección de imagen una condición experimental alimentos a una temperatura determinada. Este protocolo puede escalarse para adaptarse a la cantidad de condiciones que será reflejada en cualquier día dado. Sin embargo, se debe tener cuidado en el diseño experimental para asegurarse de que el plazo es razonable y que los animales a través de diferentes cepas no tienen una diferencia de edad mayor de 12 horas en el día de la proyección de imagen. Se recomienda que los reporteros transcripcionales se va a examinar son solo copia transgénicos, como esto asemeja más a la regulación natural del gen. El protocolo descrito a continuación y resumidas en la tabla 3, proporciona también un método optimizado para la obtención de poblaciones de edad sincrónico grande emparejado de cepas, que se pueden utilizar para otros flujos de trabajo experimentales. Animales en experimentos realizados en placas de cultivo de tejidos de 10 cm tratada para permitir una mayor densidad de gusanos la proyección de imagen de la cultura (∼ 100 animales por placa) de ensayos de la vida. Llenan 30 mL de placas de agar NGM y semilla con alícuotas de 5 225 μL de refrigerados OP50 cultura en una cruz-como la formación de las placas de 10 cm. 5. Inicial cultura de reportero cepas cultura el C. elegans cepas que se analizaron en semillas planchas NGM 20 ° C. permitir que las placas a morir de hambre hacia fuera para asegurar que todos los animales son cultivados de una manera uniforme y que potencialmente son responsables de cualquier efectos transgeneracionales de las condiciones del desarrollo de. Pedazo la L1 hambrienta larvas sembradas planchas NGM y crecen hasta llegar a la etapa de L4. Transferencia de tres larvas L4 por tensión a dos placas NGM sembradas a 20 ° C. Estos animales representan la generación P0. Utilice la progenie de L4 de la generación de P0 para configurar la generación F1. Coloque las larvas L4 de F1 de la cepa de tipo salvaje reportero a 4 placas sembradas de NGM. Cepas mutantes, el número de platos necesarios depende de su tasa de crecimiento. Usando el ejemplo anterior de daf-7(ok3125), cepas de reportero en este fondo requiere tres veces el número de la placas y necesita configurar dos días antes de las cepas tipo salvaje de reportera, para tener en cuenta las diferencias en la tasa de crecimiento. 6. Recolección de huevo y sincronización de reportero cepas Nota: algunos genes de interés en la comunidad de investigación de envejecimiento C. elegans como resultado defectos puesta de huevos cuando mutó y crecimiento que hace más difícil generar grandes poblaciones sincrónicas de animales de diferentes genotipos. Por ejemplo, la mutación de daf-7(ok3125) causa un grave defecto de puesta de huevos en comparación con el tipo tensión de N2. Por lo tanto, para obtener suficiente número de síncronos larvas L4 de diferentes cepas para experimentos cuantitativos de imagen requiere de una metodología más robusta que manualmente recogiendo gusanos. Por esta razón, las cepas transcripcional reportero fueron sometidas a un hipoclorito de sodio (NaClO) y tratamiento de solución de hidróxido de sodio (NaOH) de adultos grávidos para romper abierto los animales liberan sus huevos, un proceso que se conoce comúnmente como ' del blanqueo ' por el C. elegans investigación comunidad 15. Cuenta de las diferencias en crecimiento las tasas entre cepas y calcular cuando las placas de cada cepa deben ser cosechadas y blanqueadas. Un ejemplo de cuando se blanquean cepas de tipo salvaje y daf-7(ok3125) reportero ver tabla 3. En serie Lave los gusanos de una cepa determinada de las placas, en el día apropiado, usando 15 mL de SB y recoger en un tubo de 15 mL estéril. Permite que los animales naturalmente sedimento y ajuste el volumen de líquido a 7 mL. Añadir 2 mL de NaClO de 5% y 1 mL de 5 M NaOH en el tubo que contiene a los adultos grávidos. Muévalo suavemente la mezcla a temperatura ambiente durante no más de 3 minutos. El NaClO se mata a las bacterias y gusanos, mientras que el NaOH provoca los gusanos para romperse aparte de soltar los huevos fertilizados que contienen al líquido. La quitina de cáscara de huevo alrededor de los embriones les protege de los efectos del tratamiento, siempre y cuando el tiempo de exposición es relativamente corto. Después de la incubación de 3-min, vortex tubo de ~ 30 s para facilitar la ruptura de los cadáveres del gusano. Después de la rotación de incubación de 3-min la mezcla a 1.000 x g durante 1 min para que sedimenten los huevos. Aspirar más lejos del sobrenadante con una pipeta de vidrio estéril conectada a un frasco de vacío, dejando ~0.5 mL en cada tubo, para no molestar los huevos. Resuspender el precipitado con 9,5 mL de SB y luego repetir el paso de centrifugación y resuspensión pasos adicionales dos veces para que los huevos han sido lavados con SB un total de tres veces. Después de la final lavado, pellets los huevos a través de centrifugación y luego deseche todo pero 0,5 mL del sobrenadante. Resuspender los huevos en el restante 0,5 mL de SB y luego alícuota 100 μL en tres placas NGM 10 cm cabeza de serie. Distribuir 100 μl igualmente sobre todo cinco césped bacteriano en cada plato. Para las cepas de tipo salvaje, huevos no deben ser depositados en densidades mayores de 200 por caja. Mantener las placas a 20 ° C por 48 h y para obtener una población altamente homogénea de larvas L4. Para cepas con fenotipos de retraso en el crecimiento, es recomendable depositar tantos huevos como disponible y aumentar el tiempo de incubación. Por ejemplo, mantener daf-7(ok3125)-que contiene cepas de reportero a 20 ° C ~ 64 h permitir que los huevos eclosionan y alcanzan la etapa L4. 7. Tratamiento de las cepas de reportero con huevo-5 ARNi en serie lavar los gusanos de las tres placas con 15 mL de SB y recoger el líquido en un tubo de 15 ml estéril. Que las larvas L4 natural de sedimentos y luego aspirar todo pero ~0.5 mL del líquido. En el tipo salvajecepas de reportero e este paso elimina cualquier larvas menores de L4. En fondos mutantes, este paso ayuda a la eliminación de cualquier arrestadas larvas como dauers en el caso de daf-7(ok3125). Resuspender los gusanos con 9 mL de SB. Otra vez, controlar la velocidad de sedimentación de las larvas L4 y luego aspirar todo pero ~0.5 mL del sobrenadante una vez que la mayoría de las larvas L4 ha peleteado. Repita este proceso una vez más. Luego aspirar todo pero ~0.5 mL del líquido una vez que se ha establecido la mayoría de las larvas L4 de. Añadir 10 μl de basal estéril S suplementado con 0,1% Pluronic F-127 (SB + Plu) al líquido que contienen las larvas L4. Esto actúa como un surfactante y evita que las larvas se adhiera a la superficie interior de las puntas de pipeta plástico. Resuspender suavemente las larvas con una punta de pipeta P200 baja retención y luego alícuota 150 μL sobre tres placas de ARNi de 10 cm que se siembran con 5 x 225 μL de bacterias de ARNi de huevo-5. Asegurar que los gusanos se distribuyen igualmente por todo césped bacteriano cinco. Una vez en el agar ha absorbido el líquido, retire cualquier larvas L4 no de las placas que no fueron eliminadas por el procedimiento de lavado por recolección manual. Luego almacenar las placas a 20 ° C por 24 h. 8. Iniciación de la amplio-gama DR Nota: después de las 24 h huevo-5 tratamiento de ARNi, las larvas L4 que originalmente fueron depositadas en las placas se habrá convertido en adultos 1 – viejos. Pick off cualquier larvas jóvenes que escaparon el paso previo de extracción manual apagado en esta etapa, dejando sólo los adultos 1 día – la vieja en las placas de. Para cada cepa, lave los adultos 1 día de edad de las tres placas con 15 mL de estéril SB + estreptococos en un tubo de 15 mL. Que los gusanos naturalmente sedimento y luego aspirar todo pero 0,5 mL del sobrenadante. Suspender las lombrices con 9,5 mL de SB + estreptococos y repita los pasos de sedimentación y lavado de. Después de la final de lavado, permite los gusanos al sedimento y luego aspirar todo pero 0,5 mL del sobrenadante. Añadir 10 μl SB + Plu y resuspender suavemente las larvas usando una punta de pipeta P200 y luego alícuota de 100 μL en una placa de NSC sembrada con bacterias 5 x 225 μL en una concentración 2 x 10 9 células/mL. Distribuir 100 μl uniformemente a través de todos cinco césped bacteriano. Bajo el microscopio, estimar el número de animales presentes en la placa: el objetivo es tener entre 100-150 gusanos en la placa de. Determinar la cantidad de líquido necesaria para conseguir una densidad de gusano dentro de esta gama y luego alícuota sobre dos placas adicionales. Ajustar el número de gusanos en la primera placa también caen en este rango y luego almacenar las placas a 20 ° C por 24 h. Al día siguiente, recoger los adultos 2 días de edad y distribuir a placas de NSC nuevas sembradas con la concentración experimental de alimentos (tabla 1), reutilizando los métodos establecidos en los pasos 2 y 3. Una vez que el líquido es absorbido por el agar, cambiar las placas a la temperatura experimental de 24 h. Al día siguiente, recoger los adultos 3 días de edad y distribuir a placas de NSC frescas sembradas con la misma concentración experimental de la comida, reutilizando los métodos establecidos en los pasos 8.3 y 8.4. Una vez que el líquido es absorbido por el agar, retomar las placas la temperatura experimental para 48 h. Recoger a los adultos 5 días de edad y distribuir a placas de NSC frescas sembradas con la misma concentración experimental de la comida, reutilizando los métodos establecidos en los pasos 8.3 y 8.4. Una vez que el líquido es absorbido por el agar, retomar las placas la temperatura experimental de 24 h. 9. Microfluidos imagen de reportero cepas el día 6 de la edad adulta, la imagen animales usando un encargo microfluídicos plataforma 24 , 25. Físicamente recoger animales de las tres placas y suspender en un tubo criogénico de 5 mL conteniendo 4,5 mL de SB + strep. Una vez que los gusanos sedimento, aspirar todo pero ~0.5 mL del sobrenadante y resuspender los animales en 4 mL de SB + estreptococos. Este elimina las bacterias de exceso que de lo contrario pueden interferir con la proyección de imagen. Los gusanos se introducen en un dispositivo de microfluidos personalizado mediante presión por flujo 24 , 25. Dentro del dispositivo, gusanos individuales dirigidas hacia y atrapados dentro de un canal de cerrado por presión-conducido de la en-viruta válvulas 26 bajo el control de software a la medida. Una vez un gusano está atrapado de cabeza en el canal de proyección de imagen, recoger un fluorescente z-stack, con secciones de 50 en 2 pasos de μm, utilizando un microscopio de epifluorescencia estándar con un 40 X objetivo de aceite (NA 1.3) y una cámara. Recoger imágenes fluorescentes rojas y verdes para cada uno de los reporteros transcripcionales simultáneamente utilizando un separador de emisión y almacenados para su análisis. Adquisición de imágenes es automático mediante software a la medida. Proceso de la imagen automáticamente uso de secuencias de comandos MATLAB personalizado 27 (disponible en https://github.com/meizhan/SVMelegans). Z-pilas se carga en MATLAB y analizadas para identificar pares de neuronas y sus ubicaciones en el plano de proyección de imagen. Luego se calculan las proyecciones máximas y un algoritmo de umbral se utiliza para localizar las células fluorescentes individuales. Identificación de la célula entonces se calcula basada en distancias relativas y ubicaciones en el gusano ' cabeza. Para cuantificar la fluorescencia del reportero, extraiga el volumen tridimensional alrededor de cada localización celular de la z-pila. Integrar la intensidad en un número constante de los píxeles más brillantes, que encapsulan totalmente toda la célula en todos los casos. Para eliminar la interferencia de los cambios cepa específica o condición experimentales en la tripa auto-fluorescencia de cada animal, calcular la intensidad de fondo para los pares de la célula más cercana de la tripa (ADF y ASI) mediante la estimación del modo de la distribución de la intensidad en un volumen alrededor de la neurona. Restar este valor de intensidad del fondo de la fluorescencia integrada para obtener la salida final. 10. Datos de la Asamblea Nota: las intensidades de fluorescencia de neuronas todas analizadas por el software de procesamiento de imágenes se combinan en el archivo de datos de expresión filtrada (FED) que se utiliza para estimar los perfiles de distribución de genes expresión (plantilla R y secuencias de comandos de C++ están disponibles en https://github.com/giovannidiana/templates). Manualmente revise cada procesado de imagen para confirmar la correcta identificación de todas las células. Imágenes con la identificación errónea de la célula deben grabarse en un archivo de exclusión. En Diana et al., (2017) 13 el archivo de exclusión consiste en una tabla binaria con ' 0 ' para corregir y ' 1 ' para la identificación de celda incorrecta. El número de filas de la tabla es igual al número de gusanos con una columna para cada celda de imagen (es decir ASI, ADF y NSM). Generar el archivo de la reserva federal: ejecutar el bash script " gen_data + tiempo de " generar archivos específicos de célula combinando los valores de expresión obtenidos de cada gusano imagen filtrada utilizando el archivo de exclusión. Para cada carpeta generada por el software de procesamiento de imágenes, la secuencia de comandos de bash lee el archivo de anotaciones < folderprefix > _EXP.txt para extraer las condiciones experimentales y el archivo de exclusión < folderprefix > _X.csv para seleccionar solamente correctamente identificado las neuronas. Valores de expresión se pueden leer los archivos < folderprefix > _data_ < neurona > .csv. Concatenar todos los archivos en " FED_split.dat " y ordenar por el código de lote del experimento, gusano de etiqueta y la célula de identidad. Run " tipo " (programa C++, uso:. / ordenar FED_split.dat FED_merged.dat) para seleccionar las entradas con fluorescencia cero para cada celda y combinarlos en filas solo en FED_merged.dat. 11. Estimación de información codificada Nota: el siguiente procedimiento describe cómo cuantificar la información sobre las condiciones ambientales específicas codificadas por el conjunto de expresiones del gene. En Diana et al. (2017) examinaron a 13, la información sobre abundancia de alimento en el medio ambiente, sin embargo, el método sí mismo es aplicable a cualquier número discreto de Estados ambientales. El ingrediente esencial para cuantificar información teórica variables como entropías de información o la redundancia es la distribución de probabilidad conjunta de las respuestas neuronales en el sets estímulos ambientales considerados. Para realizar dicha estimación, es fundamental contar con una muestra suficiente de la respuesta a través de las poblaciones de gusanos. Se pueden estimar las distribuciones Gaussianas de muestras relativamente pequeñas; sin embargo, es importante tener una idea de la forma esperada de la distribución de expresión para cuantificar el tamaño de muestra apropiado para una estimación confiable de la densidad. Debido a la inevitable variabilidad a través de diferentes ensayos, es esencial para comprobar que los valores centrales de las distribuciones de diversas repeticiones del mismo experimento no son sistemáticamente cambiados o que ninguna de las características estadísticas de la distribución de la expresión no se alteran significativamente a través de ensayos. En el caso de la variabilidad del juicio a prueba es compatible con la variabilidad dentro de cada ensayo, es fundamental equilibrar el número de ensayos frente al número de gusanos dentro de los ensayos en un promedio de los factores ambientales y biológicas que afectan el juicio a prueba variabilidad. Undersampling esos factores fuertemente podría sesgar el análisis de información teórica. Secuencia de comandos como el R " code3D.R " proporciona una plantilla para generar densidades tridimensionales basadas en el archivo " FED_merged.dat ", modificar esta plantilla según el formato de encabezado específico de FED. La lista de " HeaderNames " representa los nombres de cada campo en el archivo de la FED mientras " RONames " es la lista de las lecturas. La secuencia de comandos utiliza el paquete de R ' ks ' 28 , 29 estimar distribuciones multivariantes dentro de una cuadrícula hypercubic con GS de cubos de cada dimensión subdividiendo el rango entre el mínimo y máximo valores en el conjunto de datos para cada lectura. Cuando la variable interna " grupo " se establece en 0, todos los datos son utilizados para la estimación de la densidad. Cuando la " grupo " label es entre 1 a 5 el conjunto de datos se divide en 5 conjuntos disjuntos, y se estiman las densidades de expresión desde el 80% de los datos resultantes de la exclusión de uno de los cinco conjuntos. Esta característica se utiliza posteriormente para estimar incertidumbres. Nota: El uso de code3D.R: Rscript code3D.R < GT > < comida > < GS > < outfolder > < etiqueta > < grupo > < frac > donde GT representa el genotipo, el alimento es la condición ambiental, outfolder es el preexistente carpeta donde se almacenarán las distribuciones, la etiqueta es un prefijo de nombre de archivo y frac es la fracción del conjunto de datos utilizado. Para cada condición ambiental generan las distribuciones multivariantes con rejilla diferentes tamaños GS (e.g. 20,30,40 contenedores). Para reducir la carga computacional, valores más pequeños de GS son preferibles cuando resoluciones más finas no cambian significativamente la valoración de la información. Distribución de la expresión génica se escriben en la carpeta < outfolder > especificado al ejecutar code3D.R como solos archivos de texto de la columna con la estructura de nombre de archivo < etiqueta > _ < GT > _ < alimentos > _GS < GS > _group < grupo de >. dat. Nota: los pasos anteriores proporcionan la estimación de las distribuciones de probabilidad condicional donde g denota el vector de toda lectura y f es la condición ambiental. Sin embargo, para calcular la información mutua entre genes y el medio ambiente 30 , 31. tenemos la distribución de la entrada que también determina el (input-) un promedio de expresión génica < IMG alt = "Ecuación 4" src="/files/ftp_upload/56292/56292eq4.jpg" / >. Cuando la distribución de entrada no es directamente, una cantidad significativa para caracterizar las características de codificación es la capacidad del canal, que puede ser obtenida maximizando la información mutua entre todas las distribuciones de entrada posible. Utilizando la distribución de la expresión génica, aplicar el algoritmo de 32 Arimoto Blahut para estimar la capacidad del sistema y la distribución de la entrada de medio ambiente que maximiza la información. Un ejemplo de implementación del algoritmo se puede encontrar en el programa de C++ " Ccap3D.cpp " para la expresión de genes tridimensional código analizado en Diana et al (2017) 13. Ejemplo: si se obtienen distribuciones de genotipo GT123 del 80% de los datos (grupo 3) con el tamaño de la cuadrícula igual 30 y almacenado en la carpeta ". /pdf/ " con un prefijo de etiqueta = " PDF ". Es el comando para calcular la información codificada en el fondo de GT123. / Ccap3D GT123 pdf PDF 30 3 Nota: la estimación de la información codificada por el sistema se ve afectada por múltiples fuentes de incertidumbre, incluyendo la elección de la estimación de la densidad algoritmo y muestra sesgo de tamaño. Se deben repetir usando métodos de estimación de densidad diferente para evaluar el tamaño del sesgo sistemático introducido por cada algoritmo pasos 11.1-11.2. Para estimar la incertidumbre debido al tamaño de la muestra, calcular información de pasos 11.1-11.2 con grupos de entre 1 a 5. La variabilidad a través de estos cinco muestreos independientes del 80% de los datos que reflejan el impacto del tamaño de muestra en la valoración de la información. Calcular información pasos 11.1-11.2 sobre aumento de fracción de los datos (como en el paso 5) para corregir por sesgo de tamaño de la muestra (jack-knife método) 33. 12. Cálculo de la redundancia, ruido y señal de correlación distribuciones entradas uso el óptimo obtienen en la estimación de la máxima información para calcular la información mutua entre la entrada y gene respuesta de expresión de cada neurona N. El archivo de origen C++ " GetMI1D.c " es un programa de muestra para obtener información mutua marginal de las distribuciones de probabilidad conjunta. Calcular redundancia tomando la suma de la información mutua para cada neurona obtenida anteriormente y luego restar la capacidad de canal. Calcular el " shuffle " término información 13 , 34. Un archivo de código fuente de plantillas C++ puede encontrarse en " GetShuffle.c ". Uso el " shuffle " plazo para calcular la correlación de la señal y el ruido. Para el signacorrelación de l tenemos y para la correlación del ruido que tenemos . Incertidumbres en redundancia, obtener ruido y correlación en cuanto a la información total (paso 11.3 de la sección anterior) de múltiples muestreos del 80% de los datos y tomar la desviación estándar de la señal.