Quantificação da informação codificada pelos níveis de expressão gênica durante modulação do tempo de vida sob ampla restrição alimentar em C. elegans.

1. preparação de culturas bacterianas e placas para cultura de Worm geral preparar 100 mL de lisogenia caldo (LB) meios de comunicação em um frasco de vidro de 250 mL e esterilizar em autoclave. Inocular a garrafa com uma única colônia da estirpe Escherichia coli OP50 e incubar a 37 ° C durante a noite e então armazenar cultura a 4 ° C até ser necessário. Preparar 5 L de crescimento nematoide estéril médio (NGM) ágar 15 alíquota mL 12 volumes e em placas de Petri plástico estéril de 6 cm. Permitir o agar para definir durante a noite e em seguida armazenar a 4 ° C até ser necessário. Semente NGM placas de pelo menos 3 dias antes de usar com 225 μL da cultura OP50 refrigerada. Armazenar as placas a 20 ° C até ser necessário. 2. Preparação de diluições para experiências e culturas bacterianas preparar dois lotes de 500 mL de LB mídia em um Erlenmeyer de 2 L e esterilizar em autoclave. Inocular cada balão com uma única colônia de OP50 e crescer a 37 ° C, agitando a 200 rpm para cerca de 14 h. Complementar as culturas com a antibiótica estreptomicina para uma concentração final de 50 μg/mL. Continuar a agitação por 30 min a 37 ° C, em seguida, colocar os frascos no gelo por 15 min. Transferência de 450 mL de cada cultura em frascos separados centrífuga estéril (idealmente capacidade garrafas de 500ml para evitar a divisão das culturas). Manter a cultura de sobra no gelo, como ele será usado para determinar a concentração das bactérias. Gire para baixo as garrafas a 4500 x g em um conjunto de centrífuga refrigerada a 4 ° C por 25 min. Discard sobrenadante e armazenar as garrafas no gelo Diluir 100 μL da cultura de sobra de cada frasco em 900 μL de estéril lb uso 1 mL de LB estéril para zero do espectrofotómetro e em seguida determinar o OD 600 de diluição 10 vezes de cada cultura. Se, por exemplo, o OD 600 de 10 vezes diluição da cultura durante a noite é 0,28 Então a cultura tinha uma real OD 600 de 2.8. Usar uma solução de trabalho de ações de bactérias de 1,12 x 10 10 OP50 células/mL, que equivale a uma OD 600 de 56. Portanto, usando o exemplo OD 600 de 2.8 de cima, resuspenda o pellet da cultura 450 mL em um 20 th do volume original, que neste caso é 22,50 mL. Resuspenda as bactérias com uma solução estéril de S basal suplementada com estreptomicina 50 μg/ml (SB + estreptococos). Resuspenda o pellet no volume apropriado de estéril SB + estreptococos. Fazer todas as subsequentes concentrações usadas em experimentos de diluições de série da unidade populacional de trabalho em SB + strep usar os fatores de diluição listados na tabela 1. 3. Configuração a expectativa de vida experiências Nota: vida útil ensaios são realizados em cultura de tecido de 6cm Tratado preenchida com 12 mL de ágar NGM suplementado com estreptomicina e carbenicilina (NSC), ambos em uma concentração final de 50 μg/mL. Estas placas de cultura de tecidos são adequadas para ensaios de vida útil sem nenhum ou muito baixa concentrações bacterianas, como as minhocas são significativamente menos propensas a furar a parede da placa e ressecando. O uso de dois antibióticos diferentes impede que a estirpe OP50 desenvolver resistência aos medicamentos, que é fundamental para controlar a concentração bacteriana na placa. Também, por inactivar bactérias com antibióticos, podemos minimizar os efeitos sobre worm expectativa de vida devido a infecção patogénica 16. Isso nos permite considerar apenas os componentes relacionados com os alimentos de concentração bacteriana nestas experiências. Muitos estudos de envelhecimento de c. elegans suplementam placas NGM com o químico fluoro-2 ′-desoxiuridina (FUdR) para processar os adultos estéreis. No entanto, o uso de FUdR pode ser problemático, pois seu uso pode causar vários problemas de confusão com longevidade ensaios 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Entchev et al (2015) 12 contornado esse problema pela exposição de larvas L4 de RNAi de ovo-5 22 ,, 23, que inibe a transição do oócito-para-embrião, bloqueando a formação da casca da ovo de fertilizados oócitos de c. elegans, resultando em sua morte. Estirpes de cultura da c. elegans que vão ser analisadas na semearam placas NGM a 20 ° C. permitir que as placas de fome para fora para garantir que todos os animais são cultivados de forma uniforme e potencialmente responsáveis por qualquer efeito transgeracional da condições do desenvolvimento. Transferência de larvas L1 de fome novas placas NGM semeadas cortando um pequeno pedaço de ágar (5 mm x 5 mm) da placa de fome usando um bisturi estéril e depositá-la em um prato novo, um processo conhecido como ' a fragmentação ' pelo comm de investigação de c. elegans unidade 15. Crescem os vermes até atingirem o estágio de L4. Cinco larvas L4 por tensão são então transferidas para pratos individuais de NGM semeados e mantidas a 20 ° C. Estes animais representam a geração P0. Uso L4 progênie da geração P0 para configurar a geração F1. Coloque individualmente larvas L4 de F1 da estirpe selvagem tipo N2 para 30 placas NGM semeadas. Nota: Para estirpes mutantes, o número de placas necessárias varia de acordo com sua taxa de crescimento. Por exemplo, daf-7(ok3125) os animais passam por uma detenção dauer transitória a 20 ° C. Assim, esta cepa produz menos L4 larvas de vermes de uma placa de tipo selvagem de N2. Para compensar esta diferença, configurar placas de daf-7(ok3125) um dia mais cedo do que N2 placas e em maior número, uma boa relação de trabalho é de 3:1. Transferência sincronizada de progênie L4-palco dos pais para placas NGM suplementados com 1 mM IPTG e 50 carbenicilina µ g/mL (placas de RNAi) que foram semeados com 225 µ l de bactérias HT115, expressando dsRNA como alvo o gene 5-ovo e manteve na F1 20 ° C por 24 h. Pelo menos 360 vermes por estirpe, mantidos em uma densidade de 15 animais por prato, são necessários por experimento. Após o ovo-5 tratamento de RNAi, transferir os vermes para placas NSC semeadas com 225 µ l do OP50 tratados com estreptomicina na concentração de 2 x 10 9 células/mL (tabela 1) para um adicional de 24 horas a 20 ° C. Para evitar danos físicos para os vermes durante esta e todas as transferências subsequentes, suavemente colher animais de debaixo do worm usando um verme muito fino delicadamente curvado escolher. Flutuador os animais fora o worm escolher por imersão em uma gota de 10 µ l de SB + estreptococos colocado na superfície da placa nova. No dia seguinte, redistribuir os vermes para placas NSC, representando cada um da comida níveis listed na tabela 1, bem como um conjunto de placas NSC que não contêm nenhuma bactéria. Todas as placas NSC com 225 µ l da concentração de bactérias relevante da semente e propagar as placas NSC com 225 µ l SB + estreptococos, livre de bactérias. Manter os vermes em uma densidade de 15 animais por placa, resultando em pelo menos quatro placas por condição de comida por estirpe. Deslocar as placas à temperatura desejada experimental. Transferência minhocas frescas placas NSC semearam com concentração de alimentação adequada, de acordo com o cronograma descrito na tabela 2. Animais de Pontuação para o movimento por cutucando suavemente com um fio de escolher. Falha em responder é marcada como a morte. Marcar os animais para morte em cada transferência de ponto e então diariamente após o último ponto de transferência. 4. Configuração acima da imagem latente experiências Nota: as etapas descritas nesta seção são suficientes para gerar suficiente vermes por estirpe de imagem a uma condição de comida experimental a uma dada temperatura. Este protocolo pode ser dimensionado para caber o número de condições que vai ser fotografada em qualquer dia. No entanto, deve-se ter cuidado no projeto experimental para garantir que o prazo é razoável e que animais através de diferentes estirpes não têm uma diferença de idade superior a 12 horas no dia da imagem latente. É altamente recomendável que os repórteres transcriptional sendo fotografados são transgenics de cópia única, como isto será mais se assemelham o nativo regulamento do gene. O protocolo descrito abaixo e resumidos na tabela 3, também fornece um método simplificado para obtenção de populações de grande idade síncrono correspondida de tensões, que podem ser usadas para outros fluxos de trabalho experimentais. Cultura de animais em experimentos em placas de cultura de tecidos Tratado de 10 cm para permitir uma maior densidade de minhocas por imagens (∼ 100 animais por placa) do que a expectativa de vida ensaios. Preencher as placas de 10 cm com 30 mL de placas de ágar NGM e sementes com alíquotas de 5 225 µ l de refrigerados OP50 cultura em uma cruz, como formação. 5. Inicial cultura de repórter cepas cultura da c. elegans cepas que vão ser analisadas na semearam placas NGM a 20 ° C. permitir que as placas de fome para fora para garantir que todos os animais são cultivados de forma uniforme e potencialmente responsáveis por qualquer transgeracional efeitos das condições do desenvolvimento. Bolão o L1 esfomeado larvas para semearam placas NGM e crescem até atingirem o estágio de L4. Transferir três larvas L4 por estirpe para duas placas NGM semeadas a 20 ° C. Estes animais representam a geração P0. Usar a progenitura de L4 da geração P0 para configurar a geração F1. Coloque as larvas L4 de F1 da estirpe selvagem tipo repórter para 4 placas NGM semeadas. Para cepas mutantes, o número de placas necessárias varia de acordo com sua taxa de crescimento. Usando o exemplo anterior de daf-7(ok3125), cepas de repórter neste plano requer três vezes as chapas de matrícula e precisa ser definidas até dois dias antes das estirpes de tipo selvagem repórter, para explicar as diferenças na taxa de crescimento. 6. Recolha de ovos e sincronização de repórter cepas Nota: alguns genes de interesse da comunidade de pesquisa de c. elegans envelhecimento resultam em crescimento e defeitos de postura quando uma mutação, que torna mais difícil para gere grandes populações síncronas de animais de diferentes genótipos. Por exemplo, a mutação daf-7(ok3125) provoca um defeito de postura severo em comparação com o selvagem-tipo N2 estirpe. Portanto, para obter suficientes números de larvas de L4 síncronos de diferentes estirpes para experimentos quantitativos de imagem requer uma metodologia mais robusta do que manualmente pegar vermes. Por esta razão, cepas transcriptional repórter foram submetidas a um hipoclorito de sódio (NaClO) / tratamento de solução de hidróxido de sódio (NaOH) de gravid adultos para quebrar abrir os animais e libertar seus ovos, um processo conhecido como ' branqueamento ' pelo c. elegans pesquisa Comunidade 15. Conta as diferenças em crescimento taxas entre estirpes e calcular quando as placas de cada estirpe devem ser colhidas e descoradas. Para obter um exemplo de quando as estirpes de tipo selvagem e daf-7(ok3125) repórter são branqueadas ver quadro 3. , Serialmente, lave os vermes de uma determinada pressão sobre as placas, no dia apropriado, usando 15 mL de SB e coletar em um tubo estéril 15 mL. Permitir que os animais de sedimentos naturalmente e em seguida, ajuste o volume de líquido a 7 mL. , Adicionar 2 mL de 5% NaClO e 1 mL de 5 M NaOH ao tubo contendo os gravid adultos. Agitar suavemente a mistura à temperatura ambiente para não mais de 3 min. O NaClO vai matar as bactérias e vermes, enquanto o NaOH faz com que os vermes separar liberando qualquer ovos fertilizados, eles contêm no líquido. A quitina da casca em torno os embriões protege-los contra os efeitos do tratamento, enquanto o tempo de exposição permanece relativamente curto. Após a incubação de 3-min, vórtice do tubo para ~ 30 s para facilitar ainda mais a separação das carcaças worm. Após o spin de incubação de 3-min a mistura a 1.000 x g por 1 min para os ovos de Pelotas. Aspire o a maioria fora do líquido sobrenadante com uma pipeta de vidro estéril conectada a um balão de vácuo, deixando ~0.5 mL em cada tubo, para não perturbar os ovos. Resuspenda o pellet com 9,5 mL de SB e em seguida, repita a etapa de centrifugação e ressuspensão passos adicionais duas vezes para que os ovos foram lavados com SB um total de três vezes. Depois de lavar a final, os ovos através de centrifugação de pelotas e depois descartar tudo, mas 0,5 mL do sobrenadante. Resuspenda os ovos no restante 0,5 mL de SB e então alíquota 100 µ l para três placas NGM semeado de 10 cm. Distribua a 100 µ l igualmente entre todos os cinco gramados bacterianos em cada prato. Para as estirpes de tipo selvagem, ovos não devem ser depositados em densidades maiores que 200 por placa. Placas de manter a 20 ° C por 48 h e obter uma população altamente homogênea de larvas L4. Para linhagens com fenótipos de atraso de crescimento, é aconselhável para depositar ovos como muitos como disponível e aumentar o tempo de incubação. Por exemplo, manter daf-7(ok3125)-contendo cepas de repórter a 20 ° C ~ 64 h permitir que os ovos eclodem e chegar à fase de L4. 7. Tratamento de cepas de repórter com ovo-5 RNAi serialmente lavar os vermes fora as três placas com 15 mL de SB e recolher o líquido em um tubo estéril 15 ml. Permitem que as larvas L4 de sedimentos naturalmente e em seguida aspirar tudo mas ~0.5 mL do líquido. No selvagem typcepas de repórter e, nesta etapa remove qualquer larvas mais jovens que L4. Em contextos mutantes, esta etapa auxilia a remoção de qualquer presas larvas como dauers no caso de daf-7(ok3125). Resuspenda os vermes com 9 mL de SB. Novamente, monitorar a taxa de sedimentação das larvas L4 e depois Aspire todos ~0.5 mL do sobrenadante, mas uma vez que a maioria das larvas L4 tem peletizado. Repita este processo mais uma vez. Então Aspire todos, mas ~0.5 mL do líquido, uma vez que a maioria das larvas L4 instalaram. Adicionar 10 µ l de estéril S basal suplementado com 0,1% Pluronic F-127 (SB + Plu) para o líquido contendo as larvas L4. Isto funciona como um surfactante e impede que as larvas de furar a superfície interior das pontas de pipetas plásticas. Ressuspender delicadamente as larvas usando uma ponta de pipeta de baixa retenção P200 e então alíquota 150 µ l em três placas de RNAi 10 cm que são semeados com 225 x 5 µ l de ovo-5 bactérias de RNAi. Certifique-se de que os vermes estão igualmente distribuídos em todos os cinco gramados bacterianos. Uma vez que o líquido tenha absorvido o ágar-ágar, retire qualquer não-L4 larvas as chapas que não foram eliminadas pelo procedimento de lavagem por escolhendo-las manualmente. Em seguida, armazenar as placas a 20 ° C por 24 h. 8. Iniciação de vasta gama DR Nota: após as 24h ovo-5 tratamento de RNAi, as larvas L4 que originalmente foram depositadas nas placas terá se tornado adultos 1 – velhos dias. Apanhar qualquer larvas jovens que escaparam a etapa prévia remoção manual fora nesta fase, deixando somente os adultos 1 – velhos dias nas placas. Para cada estirpe, lave os adultos 1 dias de idade das três placas com 15 mL de estéril SB + estreptococos em um tubo de 15 mL. Permitem que os vermes de sedimentos naturalmente e em seguida aspirar todos menos 0,5 mL do sobrenadante. Resuspenda as minhocas com 9,5 mL de SB + estreptococos e repita as etapas de sedimentação e lavar. Depois de lavagem final, permitem que os vermes de sedimentos e depois Aspire todos menos 0,5 mL do sobrenadante. Adicionar 10 µ l SB + Plu e ressuspender delicadamente as larvas usando uma ponta de pipeta P200 e então alíquota µ l 100 em uma placa de NSC inoculada com bactérias 5 x 225 µ l em uma concentração de 2 x 10 9 células/mL. Distribuir a 100 µ l uniformemente em todos os cinco gramados bacterianos. Sob um microscópio, estimar o número de animais presentes na placa: o objetivo é ter entre 100-150 vermes no prato. Determinar o volume de líquido necessário para atingir uma densidade de verme dentro deste intervalo e, em seguida, a alíquota em duas placas adicionais. Ajustar o número de vermes no primeiro prato também se enquadram nesta faixa e em seguida armazenar as placas a 20 ° C por 24 h. No dia seguinte, coletar os adultos 2 dias de idade e distribuir para novas placas NSC semeadas com a concentração desejada de experimental de alimentos (tabela 1), reutilizando os métodos indicados nas etapas 2 e 3. Uma vez que o líquido é absorvido o ágar-ágar, deslocar as placas à temperatura desejada experimental por 24 h. No dia seguinte, coletar os adultos 3 dias de idade e distribuir às placas de NSC frescas semeadas com a mesma concentração experimental de comida, reutilizando os métodos indicados nas etapas 8.3 e 8.4. Uma vez que o líquido é absorvido o ágar-ágar, retornar as placas à temperatura experimental por 48 h. Coletar os adultos 5 dias de idade e distribuir às placas de NSC frescas semeadas com a mesma concentração experimental de comida, reutilizando os métodos indicados nas etapas 8.3 e 8.4. Uma vez que o líquido é absorvido o ágar-ágar, retornar as placas à temperatura experimental por 24 h. 9. Microfluidic Imaging da repórter cepas no dia 6 de idade adulta, imagem animais usando um personalizado microfluidic plataforma 24 , 25. Fisicamente, abater animais das três placas e suspender em um tubo criogênico de 5 mL contendo 4,5 mL de SB + estreptococos. Uma vez os vermes sedimento, aspirar tudo mas ~0.5 mL do sobrenadante e ressuspender os animais em 4 mL de SB + estreptococos. Esta lavagem remove bactérias em excesso que caso contrário podem interferir com a imagem. Os vermes são introduzidos em um dispositivo microfluidic personalizado via pressão conduzido fluxo 24 , 25. Dentro do dispositivo, worms individuais são dirigidas para e presos dentro de um canal de imagens bloqueado por controlado por pressão em-microplaqueta válvulas 26 sob o controle de software personalizado. Uma vez uma minhoca é prendida cabeça no canal de imagens, recolher uma pilha-z fluorescente, com 50 seções em 2 etapas de µm, usando um microscópio de epifluorescência padrão com um 40 X objetivo de óleo (NA 1.3) e uma câmera. Recolha imagens fluorescentes vermelhas e verdes para cada um dos repórteres transcriptional simultaneamente usando um divisor de emissão e armazenadas para análise. Aquisição de imagens é automatizada usando software personalizado. Processo a imagem automaticamente usando personalizado MATLAB scripts 27 (disponível em https://github.com/meizhan/SVMelegans). Os Z-pilhas são carregadas no MATLAB e analisados para identificar pares de neurônio e suas localizações dentro do plano de imagem. As projecções máximos então são computadas e um algoritmo de limiarização é utilizado para localizar as células fluorescentes individuais. Identificação de célula é então calculada baseado em distâncias relativas e locais dentro do worm ' cabeça de s. Para quantificar fluorescência de repórter, extrair o volume tridimensional em torno de cada localização celular da z-pilha. Integrar a intensidade sobre um número consistente de pixels mais brilhantes, que encapsulam inteiramente toda a célula em todos os casos. Para eliminar a interferência de alterações de condição-cepa específica ou experimentais na barriga autofluorescência de cada animal, calcular a intensidade de fundo para os pares de celular mais próxima do intestino (ADF e ASI) através da estimativa do modo do distribuição de intensidade em um volume ao redor do neurônio. Subtrair esse valor de intensidade de fundo de fluorescência integrada para obter a saída final. 10. Conjunto de dados Nota: as intensidades de fluorescência de todos os neurônios analisados pelo software de processamento de imagem são combinadas em arquivo de dados de expressão filtrada (FED), que é usado para estimar os perfis de distribuição do gene expressão (modelo R e C++ scripts estão disponíveis em https://github.com/giovannidiana/templates). Imagem de cheque cada processada manualmente para confirmar a correta identificação de todas as células. Imagens com identificação errônea da célula devem ser gravadas em um arquivo de exclusão. Em Diana et al. (2017) 13, o arquivo de exclusão consiste em uma tabela binária com ' 0 ' para corrigir e ' 1 ' para identificação de célula incorreta. O número de linhas na tabela é igual ao número de vermes fotografada com uma coluna para cada célula fotografada (i. e ASI, ADF e NSM). Gerar o arquivo do FED: executar o bash script " gen_data + tempo " gerar arquivos específicos de célula, combinando os valores de expressão obtidos de cada worm fotografada filtrado usando o arquivo de exclusão. Para cada pasta gerada pelo software de processamento de imagem, o bash script lê o arquivo de anotação < folderprefix > _EXP.txt para extrair as condições experimentais e o arquivo de exclusão < folderprefix > _X.csv para selecionar somente corretamente identificados os neurônios. Valores de expressão leitura dos arquivos de < folderprefix > _data_ < neurônio >. csv. Concatenar todos os ficheiros para " FED_split.dat " e classificá-lo pelo código de lote do experimento, worm identidade rótulo e célula. Executar " tipo " (programa de C++, uso:. / classificar FED_split.dat FED_merged.dat) para selecionar as entradas com fluorescência não-zero para cada célula e combiná-los em linhas simples, em FED_merged.dat. 11. Estimativa de informações codificadas Nota: O procedimento a seguir descreve como quantificar as informações sobre condições ambientais específicas, codificado por um conjunto de expressões de gene. Em Diana et al. (2017) 13, as informações codificadas sobre a abundância de comida no ambiente foi examinada, no entanto, o próprio método é aplicável a qualquer número discreto de Estados ambientais. O ingrediente essencial para quantificar variáveis teórico de informação como entropias informações ou redundância é a distribuição conjunta de probabilidades das respostas neurais sob os estímulos do ambiente conjunto considerados. Para realizar essa estimativa, é crucial ter uma amostragem suficiente da resposta do outro lado as populações de minhocas. Distribuições gaussianas podem ser estimadas a partir de amostras relativamente pequenas; no entanto, é importante ter uma ideia da forma esperada da distribuição expressão para quantificar o tamanho de amostra adequado para uma estimativa confiável de densidade. Devido à variabilidade inevitável através de ensaios diferentes, é essencial verificar que os valores centrais das distribuições obtidas em diferentes repetições do mesmo experimento não são sistematicamente deslocados ou que qualquer dos recursos estatísticos do distribuição de expressão não são significativamente alteradas através de ensaios. No caso da variabilidade de julgamento-para-julgamento é compatível com a variabilidade dentro de cada julgamento, é crucial equilibrar o número de ensaios versus o número de vermes dentro de ensaios a média desses fatores ambientais/biológicas que afetam o julgamento-para-julgamento variabilidade. Undersampling esses fatores poderia viés fortemente a análise teórica informações. Script como o R " code3D.R " fornece um modelo para a geração de densidades tridimensionais baseadas no arquivo " FED_merged.dat ", modificar este modelo de acordo com o formato de cabeçalho específico do FED. A lista " HeaderNames " representa os nomes de cada campo no arquivo FED enquanto " RONames " é a lista de avisos. O script usa o pacote R ' ks ' 28 , 29 para estimar distribuições multivariadas dentro de uma rede de hipercúbico com GS escaninhos em cada dimensão, subdividindo o intervalo entre o mínimo e máximo valores no conjunto de dados para cada leitura. Quando a variável interna " grupo " é definido como 0, todos os dados são usados para a estimativa da densidade. Quando o " grupo " rótulo é entre 1 a 5, o dataset é dividido em 5 Conjuntos disjuntos, e as densidades de expressão são estimadas dos 80% dos dados resultantes da exclusão de um dos cinco conjuntos. Esse recurso é usado mais tarde para estimar incertezas. Nota: Uso de code3D.R: code3D.R Rscript < GT > < comida > < GS > < outfolder > < rótulo > < grupo > < frac > onde GT representa o genótipo, a comida é a condição ambiental, outfolder é o pré-existente pasta onde serão armazenadas as distribuições, rótulo é um prefixo de nome de arquivo e frac é a fração do dataset usado. Para cada condição ambiental gerar as distribuições multivariadas com grade diferente tamanhos GS (por exemplo, 20,30,40 caixas). Para reduzir a carga computacional, menores valores de GS são preferíveis quando melhores resoluções não alteram significativamente a estimativa de informações. Distribuição de expressão gênica são escritos na pasta < outfolder > especificado ao executar code3D.R como simples arquivos de texto da coluna com o nome do arquivo estrutura < rótulo > _ < GT > _ < comida > _GS < GS > _group < grupo >. dat. Nota: as etapas anteriores fornecem a estimativa das distribuições de probabilidade condicional onde g denota o vetor de todas as leituras e f é a condição ambiental. No entanto, para calcular a informação mútua entre a expressão do gene e o ambiente 30 , 31. temos a distribuição da entrada que também determina o (entrada-) em média a expressão do gene . Quando a distribuição de entrada não é diretamente disponível, uma quantidade significativa para caracterizar os recursos de codificação é a capacidade do canal, que pode ser obtida através da maximização da informação mútua entre todas as distribuições possíveis de entrada. Usando a distribuição de expressão gênica, aplicar o algoritmo de 32 Arimoto-Blahut para estimar a capacidade de canais do sistema e a distribuição da entrada ambiental que maximiza a informação. Um exemplo de implementação do algoritmo pode ser encontrado no programa C++ " Ccap3D.cpp " para a expressão do gene tridimensional código analisado na Diana et al. (2017) 13. Exemplo: se as distribuições a partir do genótipo GT123 são obtidas a partir de 80% dos dados (grupo 3) com o tamanho da grade igual a 30 e armazenados na pasta ". /pdf/ " usando um rótulo de prefixo = " PDF ". É o comando para calcular as informações codificadas no fundo GT123. / Ccap3D GT123 pdf PDF 30 3 Nota: A estimativa da informação codificada pelo sistema é afectada por várias fontes de incerteza, incluindo a escolha da estimativa de densidade viés de tamanho de algoritmo e amostra. 11.1-11.2 de etapas devem ser repetidas usando métodos de estimativa de densidade diferentes para avaliar o tamanho da polarização sistemática introduzida por cada algoritmo. Para estimar a incerteza devido ao tamanho da amostra, recalcular informações da escadaria 11.1-11.2 com grupos entre 1 a 5. A variabilidade entre estas cinco amostragens independentes dos 80% dos dados irá refletir o impacto do tamanho da amostra na estimativa informações. Calcular informações usando etapas 11.1-11.2 sobre aumento da fração dos dados (como na etapa 5) para corrigir para o tamanho da amostra viés (Jack-Knife método) 33. 12. Cálculo de redundância, ruído e correlação de sinal uso o ideal entradas distribuições obtidos da estimativa da máxima informação para calcular a informação mútua entre a entrada e gene resposta de expressão de cada neurônio N. O arquivo de origem C++ " GetMI1D.c " é um programa de exemplo para obter informação mútua marginal da distribuição conjunta de probabilidades. Calcular redundância tomando a soma da informação mútua para cada neurônio obtida acima e em seguida, subtrair a capacidade de canal. Calcular o " shuffle " termo informações 13 , 34. Um arquivo de origem C++ de modelo pode ser encontrado em " GetShuffle.c ". Uso o " shuffle " termo para calcular a correlação de sinal e ruído. Para a signacorrelação de l, temos e para a correlação de ruído, temos . Incertezas na redundância, obter o ruído e correlação quanto a informação total (etapa 11.3 da seção anterior) de coletas múltiplas dos 80% dos dados e tomar o desvio padrão de sinal.