Hier präsentieren wir Ihnen einen Rahmen für die breite Palette diätetische Einschränkung auf Genexpression und Lebensdauer zu beziehen. Wir beschreiben Protokolle für die breite Palette diätetische Einschränkung und quantitative Bildgebung der Genexpression unter diesem Paradigma. Wir skizzieren weitere numerische Analysen zu offenbaren zugrunde liegenden Informationen Bearbeitungsfunktionen der genetischen Schaltungen in Essen-sensing beteiligt.
Sensorische Systeme erlauben Tiere zu erkennen, zu verarbeiten und auf ihre Umgebung reagieren. Essen Fülle ist eine ökologische Stichwort, das tief greifende Auswirkungen auf tierische Physiologie und Verhalten hat. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass Modulation der Langlebigkeit in der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans durch Essen Fülle komplexer als früher erkannt. Die Reaktionsfähigkeit der Lebensdauer zu Veränderungen im Gastro-Level richtet sich nach bestimmten Genen, die durch die Kontrolle der Informationsverarbeitung innerhalb einer neuronalen Schaltung fungieren. Unser Framework verbindet Genanalyse, Hochdurchsatz-quantitative Bildgebung und Informationstheorie. Hier beschreiben wir, wie diese Techniken verwendet werden können, um jedes Gen zu charakterisieren, die eine physiologische Bedeutung in breiter Palette diätetische Einschränkung hat. Speziell ist dieses Workflows zeigen, wie ein Gen des Interesses Lebensdauer unter breiter Palette diätetische Einschränkung regelt; dann, wie die Expression des Gens mit Gastro-Level variiert zu etablieren; und zu guter Letzt eine unvoreingenommene quantifiziert die Menge an Informationen übermittelt durch Genexpression über Lebensmittel Fülle in der Umgebung. Wenn man mehrere Gene gleichzeitig im Kontext einer neuronalen Schaltung betrachtet, kann diesen Workflow die Codierung Strategie durch die Schaltung aufdecken.
Alle Organismen müssen in der Lage zu spüren und reagieren auf Änderungen der Umgebung um ihr Überleben zu sichern. Bei Tieren das Nervensystem ist die primäre Detektor und Wandler von Informationen über die Umgebung und koordiniert die physiologische Reaktion auf Änderungen, die den Organismus überleben1beeinflussen könnten. Essen Fülle ist eine ökologische Cue, die gut in mehreren Kontexten untersucht wird, die nicht nur lebensmittelbezogene Verhaltensweisen wie Nahrungssuche2 regelt, sondern auch Auswirkungen auf die Lebensdauer des Tieres. Die Modulation der Lebensdauer durch Veränderungen in Hülle und Fülle der Lebensmittel ist ein Phänomen bekannt als diätetische Einschränkung (DR) und hat breite evolutionären Erhaltung3.
Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans ist ein leistungsfähiges Modell für grundlegende biologische Fragen. Eine Vielzahl von Techniken entwickelt worden, die Manipulation des Genoms Wurm, wie RNAi und in-Vivo -gen Bearbeitung Techniken zu ermöglichen. Die geringe Größe der Schnecke und seine optische Transparenz eignen sich auch für in-Vivo Bildgebung sowohl transkriptionelle und translationale fluoreszierende Reporter und den Nutzen von Hochdurchsatz-Technologien wie Mikrofluidik4. Zusammen, können diese Tools genutzt werden, um wie neuronale Schaltkreise direkt das Verhalten der Tiere zu untersuchen.
C. Elegans ist ein Bacterivore und mehrere Methoden veröffentlicht worden, die für die präzise Kontrolle der Lebensmittel Fülle zu ermöglichen, durch Manipulation der Bakterienkonzentration5,6,7,8 . Innerhalb der Forschungsgemeinschaft C. Elegans wurde DR in zwei unterschiedlichen Kontexten untersucht. Das erste könnte man “klassische DR”, bezeichnen, wie es die Veränderungen als Reaktion spiegelt auf die Verminderung der Zahl der Essen in anderen Organismen. In diesem Zusammenhang führt abnehmender Lebensmittel Fülle von Ad Libitum Ebenen eine steigende Lebenserwartung, bis ein Optimum erreicht ist, nachdem dieser Punkt Langlebigkeit mit weiteren Reduzierung der Nahrung6,7abnimmt, 9. Der zweite Kontext unter dem DR in C. Elegans untersucht worden ist diätetische Entbehrung, in dem die Langlebigkeit der Würmer durch die vollständige Entfernung des bakterielle Nahrung Quelle10,11erhöht ist. In Entchev Et Al. (2015)12, zeigten wir, dass die Komplexität in DR aus diesen beiden unterschiedlichen Paradigmen untersucht werden kann gleichzeitig in einem Kontext bezeichnen wir ‘breit-Spektrum DR’. Mithilfe des Protokolls, die unten beschriebenen haben wir eine neue Klasse von Genen identifiziert DR beteiligt, dass bidirektional modulieren die Lebensdauer Reaktion auf Lebensmittel Fülle und neuronale Schaltkreise, die Lebensmittel12 (Abbildung 1) Sinn beteiligt sind.
Die Reaktion des Tieres auf Veränderungen im Umfeld integriert eine Reihe von biologischen Prozessen, die das sensorische System mit komplexen regulatorischen Interaktionen vermitteln Umweltinformationen zur Physiologie zu verknüpfen. Obwohl die mechanistischen Details solcher “Informationsfluss” oft unbekannt sind, können genetische Werkzeuge verwendet werden, erwerben Sie einen Einblick, wie diese komplexe Berechnung unter verschiedenen biologischen Komponenten aufgebaut ist. In unserer neuesten Arbeiten haben wir gezeigt, dass Daf-7 und Tph-1 bei der Übertragung von Umweltinformationen über Lebensmittel Fülle durch einen Lebensmittel-sensing neuronale Schaltkreis beteiligt sind, die Lebensdauer in C. Elegans12 moduliert , 13. durch die Anwendung der mathematischen Rahmens der Informationstheorie14, konnten wir den Betrag von Umweltinformationen in Bezug auf Bits, zu quantifizieren, die durch die Veränderungen der Genexpression in Daf-7 und dargestellt ist Tph-1 in spezifischen Neuronen über verschiedene Lebensmittel Ebenen. Aus diesem Grund konnten wir dann entdecken Sie die Codierung Strategie von dieser neuronale Schaltkreis und wie es genetisch gesteuert wird (Abbildung 2).
In das folgende Protokoll beschreiben wir die Schritte zu verstehen, was die Auswirkungen von Genen von Interesse an spezifische Neuronen sind und wie sie um den Fluss der Informationen über Lebensmittel aus der Umgebung, um Lebensdauer teilnehmen. Im großen und ganzen ist unser Framework aufgeteilt in zwei experimentelle Protokolle und eine rechnerische Workflow. Für die experimentelle Aspekte, es ist wichtig, durch Mutation entstehende Variationen der Gene von Interesse, die unter breit-Bereich geprüft werden kann DR. Faithful transkriptionelle Reporter sind auch notwendig, um die Expression der Gene auf verschiedene Lebensmittel Ebenen zu quantifizieren. Um die rechnerische Analyse diskutiert in unserer Methode durchführen zu können, muss das Dataset von ausreichender Größe, sinnvolle Schätzungen der Ausdruck Distributionen abzugeben. Obwohl wir die Analysen Vorlage Quellcodes vorsehen, muss der Benutzer mit der Sprache der Informationstheorie vertraut sein, ausgiebig in unserem computational Framework verwendet wird. Die Quelltexte sind in R und C++ geschrieben. Daher ist ein gewisses Maß an Programmierung Kenntnisse auch in einer sinnvollen Weise anzuwenden.
Hier präsentieren wir Ihnen eine neue Methode für diätetische Einschränkung, die eine viel breitere Palette von Lebensmittel-Konzentrationen als zuvor veröffentlichten Protokolle kapselt. Diese Methode verbindet zwei bisher getrennte Phänomene in C. Elegans DR Literatur gesehen, bakterielle Deprivation und klassische diätetische Einschränkung, so dass beide diätetische Effekte zu studierte unter einem Protokoll. Mit dem neuen breiten Palette DR Paradigma, präsentieren wir einen allgemeinen Rahmen für die Prüfung der Einzelzelle Genexpression in Reaktion auf einen spezifischen ökologischen Cue und bestimmen, wie diese Zelle Informationen kodiert. Unser Rahmen besteht aus zwei experimentelle Protokolle, die veranschaulichen, wie Lebensdauer und quantitative Bildgebung, bzw. durchgeführt, unter breiter Palette DR. Data aus dieser experimentelle Protokolle können dann mit der computergestützten Analysen geprüft werden diesem Rahmen, die Informationen kodiert durch Veränderungen in der gen-Expression-Ebenen oder Laufzeiten über verschiedene Lebensmittel-Bedingungen zu quantifizieren.
Lebensdauer-Experimente mit breiter Palette DR Paradigma umfassen sechs verschiedene Lebensmittel Ebenen (Tabelle 1). Dies erfordert einen arbeitsintensiven Ansatz als Prüfung Langlebigkeit unter weniger essen Ebenen wie diätetische Entbehrung10,11 oder über das Essen 2 genetischen Hintergrund35. Prüfung auf Lebensdauer unter einer einzigen Bedingung kann jedoch die Interpretationen der Rolle eines Gens in DR einschränken. Beispielsweise haben wir vor kurzem gezeigt, dass Daf-7 Mutanten eine bidirektionale Dämpfung der Reaktion auf Lebensmittel-Konzentration im Vergleich zum Wildtyp Tiere12 (Abbildung 1A haben). In Ermangelung von Lebensmitteln anzeigen Daf-7 Mutanten eine Verkürzung ihrer Lebensdauer im Vergleich zu Wildtyp-Tieren. Wenn wir nur diätetischen Mangel betrachtet hatte, wir würden haben interpretiert, dass das Daf-7 -gen als notwendig für nur Lebensdauerverlängerung, , Daf-7 Rolle viel komplexer ist. Daher ist das entscheidende Ergebnis dieses Teils des Protokolls, ob ein Gen des Interesses herzustellen modulieren die gesamte Antwort Lebensdauer für Änderungen in Hülle und Fülle Essen beteiligt ist.
Ein großer Vorteil dieses Protokolls im Vergleich zu anderen Methoden ist, dass es eine neuartige Methode verwendet, um Nachkommen Produktion bei den Tieren Lebensdauer Analyse unterziehen zu beseitigen. Die meisten Studien verwenden Sie das Medikament FuDR, um Verbreitung der Keimbahn bei Erwachsenen, wodurch sie steril zu hemmen. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, FuDR Behandlung Zustand und Gen-spezifischen Auswirkungen auf die Lebensdauer17,18,19,20,21, vordringen können die allgemeine Anwendbarkeit in Frage zu stellen. In diesem Protokoll, Beseitigung von Nachkommen Produktion wird erreicht durch eine 24 h Behandlung von Tieren mit Ausrichtung auf das Ei-5 -gen, das hemmt die Bildung von Chitin Eierschale von RNAi befruchtet C. Elegans Eizellen wiederum ihre Tod,22,23. Der Vorteil dieser Methode ist, dass es sehr spät wirkend und so stört nicht die Keimbahn, die ein wichtiger der Langlebigkeit in C. Elegans Regulator.
Eine mögliche Einschränkung des breiten Palette DR Protokolls ist seine Abhängigkeit von der Verwendung von Antibiotika, bakterielle Vermehrung um enge Kontrolle der Bakterienkonzentration gewährleisten zu kontrollieren. Bakterielle Vermehrung im Darm des Wurms ist bekanntermaßen eine Hauptursache des Todes in C. Elegans16. So bakteriostatische Antibiotika, wie z. B. Carbenicillin in NGM Agar verhindert bakterielle Proliferation und erhöht die Lebensdauer der Würmer im Vergleich zu nicht-Antibiotikum Kontrollen16. Bestimmte Antibiotika wie Rifampicin36 und Mitglieder von Tetracyclin Familie37,38, haben gezeigt worden, um Lebensdauer in C. Elegans unabhängig von ihrer Wirkung auf bakterielle verlängern Verbreitung. Allerdings gibt es keine Hinweise in der Literatur, dass entweder Carbenicillin oder Streptomycin Langlebigkeit unabhängig von ihrer Wirkung auf bakterielle Vermehrung erhöhen kann.
Lebensdauer kann als die Ausgabe einer komplexen Berechnung wo Umweltinformationen, geleitet durch Genexpression in neuronalen Netzwerken, Physiologie übermittelt angesehen werden. Unser Protokoll bietet eine Methode um zu verstehen, wie bestimmte Gene beeinflussen diese Strömung von Umweltinformationen. Um diese Frage zu lösen, brauchen wir zuverlässige Bildverarbeitung um die Verteilung von gen Ausdruck Antworten auf die einzelne Zelle Ebene zu bestimmen. Die Möglichkeit, nicht nur die durchschnittliche Antwort der Genexpression, ändert sich in Hülle und Fülle Essen aber auch die vollständige statistische Verteilung von großen Populationen stellt eine wichtige Voraussetzung für die Anwendbarkeit der Methode zu schätzen. Diese genaue Beschreibung der gen Ausdruck Reaktionen auf Lebensmittel Fülle ermöglicht die Anwendung der Informationstheorie, die Informationen kodiert, indem die spezifischen Nervenzellen sowie die Codierung Strategie durch die neuralen Schaltkreis zu quantifizieren.
Die bildgebenden und rechnerische Aspekte der in diesem Protokoll beschriebenen Methoden sind anwendbar auf eine größere Gruppe von biologischen zusammenhängen. In unserer Arbeit konzentrierten wir uns auf ein kleines neuronales Netz beteiligt Essen abfragend, beschränken sich jedoch die Analysen der Informationsverarbeitung Funktionen nicht zu einem bestimmten Zelltyp oder bestimmte ökologische Hinweise. In Zukunft können diese Methoden möglicherweise zu einer größeren Vielfalt an Eingabevariablen, beeinträchtigen keine physiologische Ausgabe erweitert werden. Diese Ansätze trägt zu einem besseren Verständnis der wie gen Regulationsnetzwerke kodieren, Prozess und Informationen zu übermitteln.
The authors have nothing to disclose.
Wir bedanken uns bei den Bargmann und Horvitz Labors für Reagenzien. Einige Stämme lieferte die CGC, das von NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird. Wir danken auch M. Lipovsek für Kommentare auf das Manuskript. Diese Forschung wurde von der Wellcome Trust (Project Grant 087146, Q.C), BBSRC (BB/H020500/1 und BB/M00757X/1, Q.C), European Research Council (NeuroAge 242666, Q.C), US National Institute of Health (R01AG035317 und R01GM088333, H.L) und USA unterstützt. National Science Foundation (0954578, H.L., 0946809 GRFP, M.Z).
Carbenicillin di-Sodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-5G | Antibiotic |
Streptomycin Sulphate salt | Sigma-Aldrich | S6501-50G | Antibiotic |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758-10G | Inducer for RNAi plates |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 71380-1KG-M | Used in S basal, and NGM agar |
di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1.05104.1000 | Used in S basal, and NGM agar |
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791-1KG | Used in S basal, and NGM agar |
Magnesium Sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M2643-1KG | Used in NGM agar |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | Used in NGM agar |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 71687-500G | Used for bleaching |
Pluronic-F127 | Sigma-Aldrich | P2443-1KG | Used in imaging |
Sodium Hypochlorite (NaClO) | Sigma-Aldrich | 1.05614.2500 | Used for bleaching |
LB Broth | Invitrogen | 12780052 | Used to grow bacteria |
Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 628960 | Plates for lifespan |
CellStar 10cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 664160 | Plates for imaging |
Low Retention P200 tips | Brandt | 732832 | Tips for handling worms in liquid |
Agar | BD | 214510 | Agar for NGM, RNAi and NSC plates |
Bacto-peptone | BD | 211820 | Peptone for NGM, RNAi and NSC plates |