חיים הדמיה ואחריו תא בודד מעקב צג Cell Biology, ההתקדמות שושלת היוחסין של אוכלוסיות עצבית מרובים

הסעיפים הבאים מתארים את השלבים הדרושים לביצוע הדמיה חיה ולאחריו מעקב תא בודד של אוכלוסיות מרובות עצבית (איור 1). כל ההליכים חיות מעורבים שמתואר פרוטוקול זה חייב להיות מתבצעת על פי ההנחיות של המועצה הבינלאומית עבור המדע חיות מעבדה (ICLAS). איור 1. ערכת הממחישות את השלבים ניסיוני העיקרי של ההליך, קרי: תא תרבות, הדמיה בשידור חי, PICC ואיסוף נתונים, תא בודד מעקב, ואת התוצאה הסופית. השלבים ממוספרים על פי זרימת העבודה של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 1. תא תרבות: בידוד, ציפוי של הנבחר האוכלוסייה עצבית או שושלת היוחסין של תאי הערה: בשילוב עם פרוטוקול זה, דוגמאות של היישום שלה לאוכלוסיות שונות תא ניתנות לאימות השירות שלה לנתח את הביולוגיה של תאים עצביים. אלה כוללים: תאי גזע עצביים למבוגרים (aNSCs) נגזר מן העכבר SubEpendymal אזור (להלכה) (עבור בידוד מפורט פרוטוקול ראה14); האסטרוציטים קורטיקלית כמחנכת ללמוד התכנות עצביים (עבור בידוד מפורט פרוטוקול ראה15); כמחנכת האסטרוציטים אסטרוציטומה (עבור בידוד מפורטת שיטת ראה16); העכבר נוירו-2a נוירובלסטומה תאים בטור (N2a). הזרע התאים ישירות על פולי-D-ליזין מצופה לוחות 24-. טוב. השתמש 1 מ”ל של תרבות בינוני לכל טוב. דגירה הלוחות 37 ° C ו- 8% CO2 עבור aNSCs, או ב- 37 ° C ו- 5% CO2 עבור שורת האסטרוציטים תא כבר שעתיים לפני הדמיה בשידור חי. הימנע משימוש coverslips כדי למנוע תנועה בלתי רצויה כמו השלב מיקרוסקופ ממונע הוא שנעקרו שהופך לתא בודד מעקב אחר ישים.הערה: תא צפיפויות ומדיה תרבות המועסקים בניסויים הם: 30-40,000 תאים/טוב aNSCs ב Dulbecco המתואמת של בינוני הנשר (תערובת מזין DMEM:F12 בינוני); 20,000 תאים/טוב עבור תאים N2a DMEM גלוקוז גבוה בינוני, 80,000 תאים/טוב עבור האסטרוציטים אסטרוציטומה במדיום גלוקוז גבוהות DMEM; 55-65,000 תאים/טוב בשביל האסטרוציטים כמחנכת במדיום תערובת חומרי מזון DMEM:F12. לתקנן את פרוטוקול תרבות על-ידי התאמת הצפיפות תא של התרבות למספר הנמוך של תאים ריאלי. למרות זאת, צפיפות תא חייב להיות גבוה מספיק כדי לשמור על הכדאיות של התרבות.הערה: אם תא צפיפות גבוהה מדי, עודף פסולת או דיסוציאציה המסכן (גושים) שעלולות להפריע מעקב של תאים בודדים. 2. חיים הדמיה על ידי מיקרוסקופיה-וידאו בצילום מואץ להפעיל את המערכות מיקרוסקופ, מצלמה, חומרה, דגירה. הגדר את הטמפרטורה, אוויר בלחץ 37 ° C ו- 8% CO2 עבור aNSCs, או ל- 37 ° C ו- 5% CO2 עבור שורת האסטרוציטים תא. לאפשר את הטמפרטורה ורמות2 CO לייצב עבור h 1-2.הערה: ציוד ספציפי נדרש לבצע ניתוח וידאו זמן לשגות, לרבות: שדה בהיר/שלב מיקרוסקופים ניגודיות/זריחה עם רכיבים חשמליים; התקנים הדגירה השולטים טמפרטורה, CO2 ולחות; לבסוף, אמין וחזק מספיק חומרה ותוכנה מסוגל לרכוש וטיפול הנפח של תמונות שהתקבל במהלך הניסויים הדמיה בשידור חי (נא בדוק את הטבלה של חומרים). ברגע התאים מחוברים בחוזקה על הלוח (2h לאחר ציפוי), להשתמש עט טוש לעשות סימן קטן בתחתית באר אחת זה לא ישמש למעקב אחר, קרי, לבאר שאינו מכיל תאים.הערה: הסימן הזה ישמש כהפניה לאפס את הקואורדינטות xyz, ניתן להשתמש בכל עת במהלך או לאחר הניסוי, או בין השינויים של מדיום, כדי להחזיר האפס. למקם את הצלחת בתוך תא דגירה של המיקרוסקופ וצרף בחוזקה את הצלחת על הבמה כדי למנוע כל תנועה בלתי רצויה במהלך העקירה של שלב ממונע של המיקרוסקופ. לאפשר את הטמפרטורה של המדיום התרבות התא כדי equilibrate בבית הבליעה למשך כ 20 דקות. שלב זה תוכל להימנע אובדן מיקוד במהלך ההקלטה עקב התרחבות של רכיבים. הפעל את תוכנת הדמיה לחיות ובחר את המודול בצילום מואץ כדי להגדיר את הניסוי. להגדיר את משך הזמן הכולל של הניסוי ומחזורי רכישה את התמונה “תפריט בכרטיסיה לוח זמנים”. עקב phototoxicity הטבועה של ששודרו או זריחה האור בשימוש, הגדר מרווח נאותה כדי לאזן בין הפתרון הזמני של הניתוח של מות תאים פוטנציאליים.הערה: לדוגמה, סכום כולל של 120 h נבחרה עבור תרבויות aNSC, רכישת תמונות brightfield כל 5 דק שקול רכישת h 120 לש יברמה בתצורה זו תדרוש 120-150 ג ‘ יגה בייט של שטח אחסון חינם את ההתקן למחשב. בחר את העמדות התמונה שהוגדרו על-ידי ה-x קואורדינטות y, ואת מרחק מוקד (הקואורדינטה z) “תפריט tab xyz נקודות”. כוללות את נקודת ההתייחסות (קואורדינטות xyz אפס) המיקום הראשוני כדי לאחזר את נקודות הציון בכל עת. בחר את הסוג של רכישת “גל הבחירה tab בתפריט”, brightfield בלבד או בשילוב עם עירור epifluorescence בעת הצורך. בחר את זמן החשיפה. יש לזכור כי חשיפת יתר ששודרו, אור ניאון במיוחד, עלול לפגוע תא הכדאיות (כמצוין לעיל). עבור aNSCs, האסטרוציטים אסטרוציטומה ותאים N2a, בחר brightfield (זמן חשיפה ms 10-50). עבור האסטרוציטים קורטיקליים transduced בוחר brightfield (זמן חשיפה של 10-50 ms) בשילוב עם פלורסצנטיות אדום/ירוק, תלוי על הכתב המשמש את הניסוי (אורך גל עירור אדום: 550 ננומטר ו- 400 ms זמן חשיפה; עירור ירוק גל: 460-500 ננומטר, זמן החשיפה 100 ms). להגדיר את שם הניסוי ואת התיקיה שבה יאוחסנו התמונות. לשמור את רשימת תפקידים כדי לטעון מחדש את הניסוי בכל עת, לאחר כל התנאים הוגדרו, הפעל את הניסוי על-ידי לחיצה על לחצן “הפעל כעת”. להשהות את הניסוי והתאם מחדש את התנאים המוקד לחיצה על “החלף כפתור z” פעם ביום עד השלמת הניסוי. אם השינויים במדיום נדרשים במהלך ההדמיה בשידור חי, להשהות את הניסוי ולאחזר את הצלחת מהתא זמן לשגות.לשנות המדיום בתנאים סטריליים ולהציב את הצלחת בחזרה אל השלב הבא, (ראה שלב 2.3). מחדש להתאים את התנאים המוקד ולחדש את הניסוי.הערה: השינויים ב- pH של המדיום עקב מות תאים או התפשטות יתר, וכן וריאציות הטמפרטורה בחדר, עשוי להשפיע על מיקוד נכון של המיקרוסקופ על התאים. עבור תרבויות רגיש (כגון aNSCs) אנו ממליצים על השימוש בינוני בתוספת חומצה-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 4 (HEPES) (הריכוז הסופי: 1 מ מ). 3. פוסט-הדמיה Immunocytochemistry (PICC), אוסף נתונים ועיבוד עם סיום הניסוי, להשהות את התוכנה ולאחזר את הצלחת עבור קיבוע ו- PICC, כמתואר בצעדים הבאים. לבצע קיבוע תא: לשטוף את התאים פעם אחת עם 1 מ ל תמיסת מלח פוספט buffered (PBS) ולהוסיף 500 µL של paraformaldehyde (PFA) (4% ב- PBS), המקננת 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).התראה: Paraformaldehyde מקבע חזק, צריך להיות מטופל בקפידה כדי למנוע מגע עם העור או העיניים. זה חייב להשפיע רק בתוך ברדס fume. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1 מ”ל של PBS ולהוסיף 500 µL של הפתרון חסימה (PBS המכיל 2% (wt/כרך) של אלבומין שור (BSA) ו- 0.2% (vol/כרך) חומרים פעילי שטח ללא יונית). דגירה h 1-RT. להסיר את הפתרון חסימה ולהוסיף 250-400 µL של הפתרון העיקרי נוגדנים. דגירה 2 h-RT. הפתרון העיקרי נוגדנים מכיל נוגדנים העיקרי מדולל ב- PBS המכיל 2% (wt/כרך) של BSA ו- 0.2% (vol/כרך) חומרים פעילי שטח ללא יונית. נוגדנים המשמשים את הניסויים המתוארים כאן: GFAP (שבערך), βIII-טובולין (1:1, 000) וα-טובולין (1:1, 000). כמו זה מתבצעת ישירות בתוך הבאר, אחסון גדולים יותר של הפתרונות נדרשים (250-400 µL) כדי לכסות את כל התאים. לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ”ל ל- PBS, להוסיף 250-400 µL של הפתרון נוגדנים משניים (מדולל כפי שמתואר בשלב 3.4). נוגדנים משניים המשמשים את הניסויים המתוארים כאן: אנטי-העכבר Fluorescein (FITC) (1:800), ארנב אנטי Cy3 (שבערך). דגירה h 1 ב RT בחושך. רחץ שלוש פעמים ב 1 מ”ל ל- PBS. שמור את התאים 1 מ”ל של PBS עבור והשלבים הבאים של הפרוטוקול. למקם את הצלחת בחזרה על הבמה מיקרוסקופ וצרפם בחוזקה על הבמה כדי למנוע תנועה בלתי רצויה במהלך העקירה של השלב מיקרוסקופ ממונע. אחזר את xyz האפס באמצעות הסימן שבוצעו בשלב 2.2, להגדיר מחדש את העמדות לנקודה זו הפניה על-ידי לחיצה על כפתור “לקזז כל X, Y, Z”. להגדיר מחדש את מרחק מוקד לכל תפקיד. לרכוש סיבוב הסופי של תמונות, הגדרת התנאים הדרושים עבור פליטת קרינה פלואורסצנטית ב “תפריט בכרטיסיה בחירה גל” כדי לזהות אנטיגנים ממוקד בעבר PICC. בקצרה, בנוסף brightfield, להפעיל את FITC (עירור: 495 ננומטר) ו Cy3 (עירור: 550 ננומטר) אפשרויות רכישת התוכנה. השתמש 10-50 ms לחשיפה 400 ms brightfield כדי לזהות את fluorophores ולחץ על הכפתור “לולאת זמן 1”, לרכוש סיבוב הסופי של תמונות.הערה: עוצמת קרינה פלואורסצנטית עשויות להשתנות בהתאם לתוצאה PICC. שינוי משך הזמן תערוכות על מנת לקבל את איכות התמונה המיטבית. בחר באפשרות קובץ/יצוא של התוכנה ולייצא את התמונות שתייגת פורמט קובץ התמונה (Tiff) או בתבנית משותפת קבוצת מומחים הצילום (Jpeg) אל תיקיית יעד מוגדר מראש. להמיר את התמונות לייצא בפורמט הנדרש על-ידי תוכנת מעקב: הכלי מעקב17 (tTt). כדי להשיג זאת, להגדיר את הקלט פלט תיקייה “tTt ממיר בכלי” הפועלים חלון, כמו גם את סמני המשמש עבור תפקידים (xy), ערוצי (c), בזמן נקודות (t), ואת לחצו על כפתור “להמיר תמונות”.הערה: התמונות חייב ישונו בהתאם להגדרות ספציפיות, הם להיות מאוחסן בתיקיות נפרדות לכל תפקיד המשמשים את הניסוי. הוראות ההתקנה, דרישות, שינוי שם של עמדות/תמונות, ושימוש בכלי מעקב זמינים להורדה בכתובת: https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/tTt-and-qtfy.html. 4. תא ותא מעקב לאחר שינוי שם את הנתונים, להפעיל את התוכנה tTt. בחר משתמש tTt ושם העבודה בתיקיה.הערה: את המעקב אחר כלי עבודה התיקיה תאחסן כל הנתונים והתוצאות המיוצא. תיקיית עבודה צריך להיקרא בשם tTtexport, המכילה תיקיות משנה בשם “AVIexport”, “Configs”, “TreeExport” ו- “tTtfiles”. בחר את הניסוי שיש לטעון, “ניסוי בחר תיקיה בחלון”, המציינת את נתיב התיקיה שבה מאוחסן הניסוי, ולאחר מכן לחץ על כפתור “טען ניסוי”. הפעל את הממיר קובץ יומן הרישום כדי להפוך את התמונות שנטענו לתוך תבנית שניתן לקריאה על-ידי תוכנת מעקב (לניסויים טעון בפעם הראשונה, זה יבקש באופן אוטומטי על-ידי התוכנה). בחר מיקום עבור מעקב על ידי לחיצה על הסימן שלה (לאחר ההמרה, סקירה כללית של עמדות שנרשם במהלך הניסויים יוצגו בחלון”פריסת המיקום”). לכל תפקיד ייוצג על-ידי סימן המורכב בתמונה של העמדה לבין מספר המקביל שלו (ראה איור 1). לאחר שנבחר המיקום, מוצגת רשימה של תמונות זמינות בצד ימין של “מיקום חלון הפריסה”, בחר אותם ולחץ על הלחצן “לטעון תמונות”. לאחר הטעינה הושלמה “בחלון העורך תא” מופיע, בחר את אורכי הגל ואת התמונה מרווח לבצע אחריהם מעקב בחלון”העורך תא”. גל 0 מקביל brightfield, 1 מקביל FITC, 2 Cy3, ו- 3 כדי דאפי. הניסויים המתוארים כאן, שימשה מרווח 1, דהיינו, כל התמונות שנטענו. כדי להבהיר, מרווח 2 פירושו הטעינה של כל תמונה שנייה. לאחר טעינת התמונות, לחזור “מיקום חלון הפריסה” ולחץ פעמיים על הסמל המייצג את מיקום שנטען קודם לכן. “חלון הסרט” יופיע המאפשר את המעקב אחר לתא בודד שיש לבצע. בעקבות ההוראות כלי מעקב, המשך מעקב. בחרו בערוץ 0 (תואם ל- brightfield), להתאים את הבהירות והניגודיות (“התאמת גמא כפתור”). להתחיל את המעקב אחר על-ידי הקשה על מקש F2.הערה: במהלך מעקב, התא מסומנים לאחר מכן על-ידי הצבת מצביע העכבר עליה והקשה על מקש “0”. חלוקת התא, התא אפופטוזיס והלחצנים תא לאיבוד זמינים לעקוב אחר אירועים אלה תאים מסוים.כמו הניסוי מתבצע מעקב אחר, כל אלה אפשרויות תוצג אוטומטית עץ היוחסין שצוירו ב- “בחלון העורך תא” כמו הניסוי נמצאת במעקב. לאחר מעקב אחר השיבוט, להתאים את התמונות brightfield עם תמונות immunofluorescence מתקבל על ידי PICC כדי לזהות את אופי הוא צאצא לתא. כל ערוץ epifluorescence יהיה מיוצג בחלון”סרט” (ערוץ 1, 2, וכדומה). 5. התוצאה הסופית לאחר תא בודד מעקב הושלמה, הוא צאצא מזוהה, להציל את הניסוי (הכרטיסיה תא עורך חלון/קובץ / שמור עץ הנוכחי כמו) והמשך לייצא את התוצאות. לייצא את שושלות היוחסין והנתונים תא “ייצוא בתפריט” ממוקם בחלון”תא העורך”. באופן דומה, לייצא את התא תמונות וסרטים דרך תפריט”ייצוא” נגיש דרך החלון”סרט”. תמונות, שושלות היוחסין, נתונים וסרטים ייוצאו אל תיקיית עבודה tTt.