Vivre l’imagerie suivie d’une cellule unique de suivi pour surveiller la biologie cellulaire et la Progression de la lignée de plusieurs Populations de neurones

Les sections suivantes décrivent les étapes nécessaires pour son imagerie live suivie suivi de cellule unique de plusieurs populations de neurones (Figure 1). Toutes les procédures impliquant des animaux décrits dans le présent protocole doivent être effectués conformément aux directives du Conseil International pour Laboratory Animal Science (ICLAS). Figure 1. Schéma illustrant les principales étapes expérimentales de la procédure, c’est-à-dire: cell culture, imagerie live, PICC et collecte de données, seule cellule de suivi et le résultat final. Les étapes sont numérotées en fonction du flux de travail du protocole. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 1. Culture cellulaire : Isolation et plaquage de sélectionné Population neurale ou une lignée de cellules NOTE : En conjonction avec ce protocole, des exemples de son application à des populations cellulaires distincts sont donnés pour valider son utilité pour analyser la biologie de cellules nerveuses. Ceux-ci incluent : les cellules souches neurales adultes (aNSCs) dérivé de la souris subépendymaire Zone (ZES) (pour un isolement détaillé protocole voir14) ; Astrocytes corticaux postnatales pour étudier une reprogrammation neuronale (pour une isolation détaillé protocole voir15) ; Astrocytes cérébelleux postnatals (pour une isolation détaillée méthode Voir16) ; et ligne de cellules de neuroblastome souris Neuro-2 a (N2a). Les semences les cellules directement sur les plaques 24 puits enduits de poly-D-lysine. Utiliser 1 mL de milieu de culture par puits. Incuber les plaques à 37 ° C et 8 % CO2 pendant aNSCs, ou à 37 ° C et 5 % de CO2 pour la lignée d’astrocytes/cellulaire pendant 2 h avant l’imagerie live. Évitez d’utiliser des lamelles couvre-objet pour empêcher tout déplacement intempestif comme la platine du microscope motorisé ne soit déplacée qui en fait la seule cellule suivi infaisable.Remarque : La densité des cellules et des milieux de culture utilisés dans les expériences sont : 30-40 000 cellules/puits pour aNSCs en Dulbecco de l’aigle modifié (moyenne de DMEM:F12 mélange de nutriments) ; 20 000 cellules/puits pour les cellules dans un milieu DMEM hyperglycémie N2a, 80 000 cellules/puits pour les astrocytes cérébelleux dans un milieu DMEM hyperglycémie ; et les 55-65 000 cellules/puits pour les astrocytes postnatals dans un milieu DMEM:F12 mélange de nutriments. Normaliser le protocole de culture en ajustant la densité cellulaire de la culture pour le plus petit nombre de cellules possibles. Néanmoins, la densité cellulaire doit être suffisamment élevée pour maintenir la viabilité de la culture.Remarque : Si la densité cellulaire est trop élevée, l’excès de débris ou de pauvre dissociation (touffes) susceptibles de gêner suivi des cellules individuelles. 2. vivre d’imagerie en Time-lapse vidéo-microscopie Allumer les systèmes microscope, caméra, matériel et l’incubation. Régler la température et la pression à 37 ° C et 8 % de CO2 pour aNSCs, ou à 37 ° C et 5 % de CO2 pour la lignée astrocytes/cellulaire. Laisser la température et les niveaux de CO2 se stabiliser pendant 1 à 2 h.Remarque : Matériel spécifique est nécessaire pour effectuer une analyse vidéo Time-lapse, y compris : microscopes contraste/fluorescence champ lumineux et en phase avec les composants motorisés ; dispositifs d’incubation qui contrôlent la température, de CO2 et de l’humidité. et enfin, fiable et suffisamment puissant matériel et logiciels capables d’acquérir et de traiter le volume de photos obtient lors des expériences d’imagerie direct (s’il vous plaît vérifier la Table des matières). Une fois que les cellules soient solidement fixés à la plaque (2 h après le placage), utilisez un stylo marqueur permanent pour faire une petite marque sur le fond d’un puits qui ne servira pas pour le suivi, c’est-à-dire un bien qui ne contient-elle pas de cellules.Remarque : Cette marque servira comme référence à zéro les coordonnées xyz, et il peut être utilisé à tout moment pendant ou après l’expérience ou entre les changements de milieu, pour revenir à la position zéro. Placer la plaque à l’intérieur de la chambre d’incubation du microscope et fixez solidement la plaque sur la scène pour éviter tout mouvement intempestif pendant le déplacement de la platine motorisée du microscope. Laisser la température du milieu de culture cellulaire s’équilibrer dans la chambre pendant environ 20 min. Cette étape permettra d’éviter une perte de focus lors de l’enregistrement en raison de la dilatation des composants. Lancez le logiciel de création d’images en direct et sélectionnez le module Time-lapse pour entamer l’expérience. Définissez la durée totale de l’expérience et les cycles d’acquisition image dans le menu « onglet Calendrier ». En raison de la phototoxicité inhérente de la transmission ou la lumière de fluorescence utilisée, définir un intervalle suffisant à l’équilibre entre la résolution temporelle de l’analyse et la mort cellulaire potentiels.NOTE : par exemple, un total de 120 h a été sélectionné pour les cultures aNSC, acquérir des images de fond clair chaque 5 min. prendre en considération que l’acquisition de 120 h d’un seul film dans cette configuration nécessite 120-150 gigaoctets d’espace de stockage gratuit dans le périphérique de l’ordinateur. Sélectionner les positions d’image définies par x et y coordonnées et la distance focale (la coordonnée z) dans le « menu points xyz tab ». Inclure le point de référence (coordonnées xyz zéro) comme la position initiale afin de récupérer les coordonnées à tout moment. Sélectionnez le type d’acquisition dans la « longueur d’onde onglet menu de sélection », fond clair, seuls ou en combinaison avec épifluorescence excitation lorsque requis. Sélectionnez la durée d’exposition. Gardez à l’esprit que la surexposition aux transmis et éclairage fluorescent en particulier, peut compromettre la viabilité de cellules (comme indiqué ci-dessus). Pour aNSCs, cérébelleuses astrocytes et les cellules N2a, sélectionnez fond clair (temps d’exposition de 10 à 50 ms). Pour les astrocytes corticaux transduits sélectionnez fond clair (temps d’exposition de 10 à 50 ms) en combinaison avec fluorescence rouge/vert, selon le journaliste utilisé pour l’expérience (longueur d’onde rouge d’excitation : temps d’exposition 550 nm et 400 ms ; excitation verte longueur d’onde : 460-500 nm et durée d’exposition de 100 ms). Définir le nom de l’expérience et le dossier où seront stockées les images. Enregistrer la liste des postes pour recharger l’expérience à tout moment et une fois que toutes les conditions ont été fixées, exécuter l’expérience en cliquant sur le bouton « Exécuter maintenant ». L’expérience de mettre en pause et réajuster les conditions de mise au point en cliquant sur le bouton z « écraser » une fois par jour jusqu’à ce que l’expérience est terminée. Si des changements dans le milieu sont nécessaires durant l’imagerie en direct, mettre en pause l’expérience et récupérer la plaque de la chambre de laps de temps.Ensuite, changer le milieu dans des conditions stériles et placer la plaque de retour à la scène (voir étape 2.3). Ré-ajuster les conditions de mise au point et reprendre l’expérience.Remarque : Les modifications du pH du milieu en raison de la mort cellulaire ou prolifération excessive, ainsi que les variations de température de la pièce, susceptibles d’affecter la mise au point correcte du microscope sur les cellules. Pour les cultures sensibles (par exemple, aNSCs), nous recommandons l’utilisation du milieu supplémenté avec 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acide (HEPES) (concentration finale : 1 mM). 3. l’imagerie immunocytochimie (PICC), la collecte de données et traitement Une fois l’expérience est terminée, mettre en pause le logiciel et récupérer la plaque de fixation et PICC, tel que décrit dans les étapes suivantes. Effectuer la fixation cellulaire : laver les cellules une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate de 1 mL (PBS) et ajouter 500 µL de paraformaldéhyde (PFA) (4 % dans du PBS), incuber 10 min à température ambiante (RT).ATTENTION : Paraformaldéhyde est un fixateur fort et doit être manipulé avec soin pour éviter le contact avec la peau ou les yeux. Il doit être manipulé qu’à l’intérieur d’une hotte aspirante. Laver les cellules trois fois avec 1 mL de PBS et ajouter 500 µL de la solution de saturation (PBS contenant 2 % (wt/vol) de l’albumine sérique bovine (BSA) et de 0,2 % (vol/vol) d’un agent tensioactif non ionique). Incuber 1 h à température ambiante. Enlever la solution de blocage et ajouter 250-400 µL de la solution d’anticorps primaires. Incuber pendant 2 heures à température ambiante. La solution d’anticorps primaires contient des anticorps primaires dilués dans du PBS contenant 2 % (wt/vol) de BSA et de 0,2 % (vol/vol) d’un agent tensioactif non ionique. Les anticorps utilisés dans les expériences décrites ici : GFAP (1/500), βIII-tubuline (1:1, 000) et α-tubuline (1:1, 000). Comme cela se fait directement dans le puits, les plus grands volumes des solutions sont nécessaires (250-400 µL) pour couvrir toutes les cellules. Laver trois fois avec 1 mL de PBS et ajouter 250-400 µL de la solution d’anticorps secondaires (diluée comme indiqué au point 3.4). Anticorps secondaires utilisés dans les expériences décrites ici : anti-souris fluorescéine (FITC) (1:800), anti-lapin Cy3 (1/500). Incuber 1 h à RT dans l’obscurité. Laver trois fois dans 1 mL de PBS. Garder les cellules dans 1 mL de PBS pour les étapes ultérieures du protocole. Replacez la plaque sur la platine du microscope et l’attacher fermement sur scène pour éviter les mouvement intempestif pendant le déplacement de la platine du microscope motorisé. Récupérer le xyz position zéro à l’aide de la marque effectuée à l’étape 2.2 et re-définir les positions à ce point de référence en appuyant sur le bouton « Compenser tous les X, Y, Z ». Réglez la distance focale pour chaque poste. Acquérir une dernière série d’images, configurer les conditions nécessaires à l’émission de fluorescence dans le menu « longueur d’onde sélection onglet » afin de détecter les antigènes ciblés auparavant dans la PICC. En bref, en plus du fond clair, activer FITC (Excitation : 495 nm) et Cy3 (Excitation : 550 nm) options d’acquisition du logiciel. 10-50 ms pour l’exposition de 400 ms fond clair permet de détecter les fluorophores et appuyez sur la touche « 1 boucle temporelle », en vue d’acquérir une dernière série de photos.Remarque : L’intensité de la fluorescence peut différer en fonction des résultats PICC. Régler le temps d’exposition afin d’obtenir la qualité d’image optimale. Sélectionnez l’option fichier/exporter du logiciel et d’exporter les photos Tagged Image File Format (Tiff) ou format Joint Photographic Experts Group (Jpeg) dans un dossier de destination prédéfini. Convertir les images exportées au format requis par le logiciel de suivi : l’outil de suivi17 (tTt). Pour ce faire, définir l’entrée et sortie de dossier dans le « outil de conversion de tTt » fenêtre, ainsi que les marqueurs utilisés pour les postes (xy) et canaux (c)-points dans le temps (t) et appuyez sur le bouton « convertir des images ».Remarque : Les images doivent être renommées selon les réglages spécifiques et ils doivent être stockés dans des dossiers individuels pour chaque poste utilisé dans l’expérience. Instructions pour l’installation, exigences, renommage des postes/images et l’utilisation de l’outil de suivi sont disponibles en téléchargement sur : https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/tTt-and-qtfy.html. 4. cellule suivi Après avoir renommé les données, exécutez le logiciel de tTt. Sélectionnez un dossier de travail utilisateur nom et tTt.Remarque : Le tracking tool travail dossier contiendra toutes les données analysées et les résultats exportés. Le dossier de travail doit être nommé tTtexport, contenant des sous-dossiers nommés « AVIexport », « Configs », « TreeExport » et « tTtfiles ». Choisir l’expérience d’être chargé dans la « fenêtre de dossier sélectionnez experiment », indiquant le chemin du dossier où l’expérience est stockée, et puis cliquez sur le bouton « Charger l’expérience ». Exécuter le convertisseur de fichier journal pour transformer les images chargées dans un format qui peut être lu par le logiciel de suivi (pour les expériences chargées pour la première fois, cela sera demandé automatiquement par le logiciel). Sélectionnez un poste pour le suivi en cliquant sur son icône (après que conversion, un aperçu des positions enregistrées au cours des expériences s’affichera dans la fenêtre « position du schéma »). Chaque poste sera représentée par un symbole composé dans une photo de la poste et son numéro correspondant (voir Figure 1). Une fois que la position a été sélectionnée et une liste des images disponibles est affichée sur la droite de la fenêtre « position du schéma », sélectionnez-les et cliquez sur le bouton « Charger les images ». Une fois que le chargement est terminé et la « fenêtre de l’éditeur de cellule » s’affiche, sélectionner les longueurs d’onde et l’intervalle d’image à suivre dans la « fenêtre d’éditeur de cellule ». Longueur d’onde 0 correspond à fond clair, 1 au FITC et 2 à Cy3 et 3 au DAPI. Dans les expériences décrites ici, intervalle de 1 a été utilisée, c.-à-d., toutes les images chargées. Pour clarifier, intervalle 2 signifie chargement de chaque seconde de l’image. Une fois que les images ont été chargées, revenir à la fenêtre « position du schéma » et double-cliquez sur l’icône qui représente la position précédemment chargée. La fenêtre « film » apparaîtra qui permet le suivi de la cellule unique à exécuter. Suivant les instructions de l’outil de suivi, effectuer le suivi. Sélectionnez le canal 0 (correspondant à fond clair) et ajuster la luminosité et le contraste (« gamma bouton d’ajustement »). Démarrez le suivi en appuyant sur la touche F2.Remarque : Lors du suivi, la cellule de suivi sera suivie en plaçant le pointeur de la souris dessus et en appuyant sur la touche « 0 ». La division cellulaire, l’apoptose des cellules et la cellule perdu boutons sont disponibles pour surveiller ces événements spécifiques de cellules.Que l’expérience est suivie, chacune de ces options apparaîtront automatiquement dans l’arborescence de la lignée dessiné dans la « fenêtre de l’éditeur cellule » que l’expérience est suivie. Une fois que le clone est suivi, assortir les images de fond clair avec les images d’immunofluorescence obtenues par PICC pour identifier la nature de la descendance de la cellule. Chaque canal épifluorescence est représentée dans la fenêtre « film » (canal 1, 2, etc.). 5. issue Une fois que la cellule de suivi a été achevée et la progéniture identifiée, sauver l’expérience (onglet Éditeur de cellule fenêtre/fichier / enregistrer l’arborescence actuelle comme) et continuer à exporter les résultats. Exporter les arbres de la lignée et les données des cellules dans le menu « Export », situé dans la « fenêtre d’éditeur de cellule ». De même, exporter les images de la cellule et les films via le menu « Export » accessible par le biais de la fenêtre « film ». Les images, les arbres de la lignée, données et films seront exportés dans le dossier de travail de tTt.