Roman bakteri özel optik tarama Ex Vivo insan Akciğer doku Confocal lazer Endomicroscopy tarafından probları
Summary
Bu teknik ex vivo insan akciğer dokusu, bakteri özel optik görüntüleme aracılarına yünden confocal floresan mikroskopi hızlı teşhis edilmesi için kullanılan küçük molekül kimyasal tarafından değerlendirilmesi için bir verimli tarama işlemini açıklar sonda-adaylar çevrilebilir potansiyele sahip.
Abstract
Bakteriyel algılama doğruluğunu ve hız iyileştirilmesi, hasta stratifikasyon ve antimicrobials uygun kullanımını sağlamak için önemlidir. Bakteriyel varlığı tanımak için tanılama yöntemlerin geliştirilmesi sayesinde bu hedefe ulaşmak için yapılan gerçek zamanlı bakım noktası gereklidir. Optik görüntüleme doğrudan ana içinde bakteri tanımlanması için çekici bir yaklaşımdır. Kimyasal sonda tasarım ve doğrulama çeşitli girişimler araştırdık, ancak hiçbiri henüz başarıyla kliniğe çevrildi. Burada bakteri özel probları yünden confocal Floresans mikroskobu (FCFM) tarafından yansıma distal akciğer içinde bakteri tanımlanması için ex vivo doğrulanması için bir yöntem açıklanmaktadır. Modelimiz ex vivo insan Akciğer doku ve klinik olarak onaylanmış confocal lazer endomicroscopy (CLE) platformu ekran roman bakteri özel bileşenleri, yakından hasta ile karşılaştı bekleniyor görüntüleme koşulları taklit görüntüleme için kullanılan. Bu nedenle, bu tekniği ile bileşikler eleme potansiyel klinik tractability güven sağlar.
Introduction
Bu teknik ex vivo insan akciğer dokusunun görüntülenmesi için potansiyel klinik yardımcı programı ile bileşikler hızlı tanımlanması için FCFM kullanarak görev tarafından bakteri özel optik görüntüleme aracılarına değerlendirmek için bir hızlı tarama süreci anlatılmaktadır distal akciğer içinde in situbakteri.
Antimikrobiyal yükselen Antimikrobiyal direnç1dönemde reçete tayın için acil bir küresel gereksinimi vardır. Bu amaçla, tanı yöntemleri ile yüksek özgüllük, duyarlılık ve gerçek zamanlı olarak bakteriyel enfeksiyon tanımlamak için hangi hareket çoğu son derece gelişimi2aradı. Bu yoğun bakım üniteleri (ICUs), içinde gibi kritik hasta hastalarda pnömoni tanısı onaylamak için güncel teknikler çoğunlukla bakteri kültürü teknikleri yanında non-spesifik klinik veya radyolojik özellikler yorumlama kullanır emişli sıvıları/sonuçlar üretmek için 3 gün sürebilir dokular. Ayrıca, sıvı bakteri kültürü distal akciğer telkin ve daha proksimal airways3 den kirlenme için eğilimli ve sık sık kültür eşlik eden antimikrobiyal tedavi ya da zavallı örnekleme teknikleri nedeniyle negatiftir. Ayrıca, Polimeraz zincir reaksiyonu gibi moleküler teknikleri overtreatment hastaların riske emişli sıvılar üzerinde kullanıldığında aşırı duyarlıdır. Ortaya çıkan tanı in situ Moleküler Patoloji dokuların bir olasılık yapma moleküler optik görüntüleme yaklaşımıdır; Ancak, geliştirme ve doğrulama optik görüntüleme bileşiklerin gereklidir. Yine de, bakterilerin alınabilen optik sonda üzerinden doğrudan görselleştirme potansiyel varlığı çalışma izin vermek için çok güçlü bir yöntem olduğunu ve pnömoni evrimi hasta ve önemlisi, ana bilgisayar-patojen etkileşimlerde çalışma için kullanılan olabilir yanıt-e doğru gerçek zamanlı tedaviler in situ durumdaki.
CLE Gastroenteroloji5, Onkoloji6,7ve airways ve alveoler keseleri8, sorguya için alanları içinde de dahil olmak üzere birden çok hastalıklar4, kurulan soruşturma işlemdir 9. bakım noktası yapısal görüntüleme hastalıklı doku bir lif klinik bir endoskop çalışma kanalı ile geçer paket Imaging kullanarak sağlar ve formları doğrudan tarafından confocal mikroskobu yansıması için doku yüzeyi ile temas. Ancak, hala bir sınırlama genel kontrast ajanlar için ihtiyaç vardır. Bu nedenle, hastalık gibi belirli bakteriyel ajanlar, belirli probları kullanımını büyük ölçüde bu modalite yarar genişletmek olabilir doğrudan sitesinde şüpheli enfeksiyon bakteri görselleştirme tarafından. Optik ajanlar tanılama potansiyeli olan gerçek zamanlı, yüksek kararlılık düşsel etkinleştirerek diğer teknikleri birçok avantajlar sunuyor. Ayrıca, birden çok hedef, nispeten düşük maliyetli olarak tüm elde sorguya için çoğullama olasılığı optik sonda sunuyoruz. Hiçbiri henüz başarıyla içinde klinik10uygulanmıştır ancak optik aracılarının sayısını böyle bir amaç için geliştiriliyor. Biz küçük molekül kimyasal probları Kütüphanesi bakteri doğru özgüllük ile sentezlenmiş ve hızlı, etkili bir boru hattı bakteriyel pnömoni in situ11algılamak için sonda ile değerlendirilmesi için geliştirilen.
Uygun prob adaylarını tanımlamak için aşağıdaki Önkoşullar sonda ex vivo insan akciğer dokusu üzerinde sorgulama önce FCFM tarafından yerine getirilmesi gerekiyordu: i) sulu çözünürlük, II) özgüllük ve hızla klinik olarak etiketleme için seçicilik ilgili bakteri, III) yüksek sinyal gürültü oranı ve IV) bozulması akciğer ortamında direnç. İkinci bronchoalveolar lavaj sıvısı (BALF) tarafından hastalarda akut respiratuar distress Sendromu (ARDS), ile hangi bakımda akciğer proteolitik ve inflamatuar ortamlarda ile karakterize bir durumdur değerlendirildi. Ayrıca, sondalar bir klinik olarak onaylanmış optik görev görüntü aygıtı içinde insan akciğer alveolar doku tarafından algılama için uygun bir fluorophore olması gerekiyordu.
Her biri aşağıdaki önkoşulları yerine sorguya çekmek için boru hattı şöyleydi (her aşamada geçti probları ileri diğerine yapılmıştır): (1) probları araştırılması için bir kütüphane sentez; (2) her sonda bir panel confocal lazer tarama bakteriyel etiketleme sağlamak için (CLSM) mikroskopi için canlı bakteri eklendi; (3) seçicilik üzerinde birincil insan nötrofil ile ortak kültürleri memeli hücrelerinde bakteriyel etiketleme, CLSM tarafından kuruldu; (4) istikrar ve bakteri varlığında ARDS hasta BALF başarılı etiketlerine göre CLSM ve matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma-saat uçuş (MALDI-TOF) kütle spektrometresi tarafından kararlı; (5) adayların en iyi konsantrasyon bakteri memeli hücreleri üzerinde muhafaza için seçicilik sağlama CLSM tarafından tespit edilmiştir; (6) adaylar tarafından FCFM süspansiyon görüntüsü ve istikrar emniyetini ex vivo insan akciğer alveolar doku üzerinde sinyal gürültü algılama için yeterli. Adım 6 bu iletişim kuralı içinde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Adım 1-5 için metodoloji daha önce bildirilen11oldu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alt solunum yolu enfeksiyonları hesap ikinci en yüksek hastalık yükünün küresel12,13ve önemli bir artış içinde atfedilen için antimikrobiyal dirençli bakteri enfeksiyonları bildirilen14numara olmuştur. Pnömoni hastaneye yatış için ortak bir neden kalır. Bakımda, bir zatürree gelişimi tanılama belirsizlik içinde bileşik olduğunu ve bir son derece yüksek mortalite hızı15ile ilişkilidir. Zatürree başlangıcı sırasında distal akciğer, nispeten az microbiota sağlık ile steril bir alan alveoler alan içinde bakteri çoğalırlar.
Bakteri özel optik görüntüleme probları11, ama tasarımı, sentezi, nispeten geç sahne ex vivo doğrulanması bu yöntem açıklanır ve daha önce gösterilen11, bu doğrulama adımı başlamadan önce sonda değerlendirme şarttır .
CLE hastalığı sorguya bir ortaya çıkan klinik tekniği in situ gerçek zamanlı olarak devletler olduğunu. Biyopsi ve lavaj sıvı toplanması içerebilir şüpheli akciğer patoloji soruşturma için geleneksel teknikleri birçok avantaj sunar. Biyopsisi invaziv ve morbidite ve mortalite havalandırılmış hastalarda neden olabilir ve toplanan lavaj sıvı genellikle üst solunum yolları bakteri ile kontamine olduğunu. CLE Detection pnömoni ancak biraz sınırlı uyumlu görüntüleme zavallı durumu nedeniyle hangi hastalığı, birçok uyumlu çabaları10rağmen fonksiyonel bilgi sağlayabilir probları kullanmaktır. CLE optik ajanlar ile birleştirerek daha hızlı pnömoni tanısı olasılığı sunuyor ve daha az invaziv için geçerli standart bir uygulama ile karşılaştırıldığında.
Bu iletişim kuralı için kritik adım numune hazırlama ve görev platformunun kurulumu vardır. İnsan dokusu son klinik uygulamaya yönelik alma da bu çalışma içinde gösterildiği gibi insan akciğer dokusu gibi önemlidir. Doku autofluorescence ölçüde büyük türler arası değişimleri gösterir ve bu nedenle yansıma bakteri-sonda duyarlılığını saptırmak çünkü insan dokusu kullanmak gereklidir. Ayrıca, etik ve insan Akciğer doku kullanımı için elde etmek esastır. Bir teknik temizlik düşük düzey, doğru görüntüleme fiber ek görüntüleme LSU platformu ve Kalibrasyon eşdeğer bakteri sayıda Akciğer doku örnekleri eklendikten sağlanması gibi iyi bir çözünürlük ve tutarlı görüntüleme için esastır. Belgili tanımlık yarar probları panelleri süzmek için bu yöntemin daha da genişletmek için yordamı patojenler, pnömoni sorumlu ajan olma olasılığı olanlar gibi bir dizi yinelenen gereklidir.
Bu tekniğin en büyük sınırlama klinik olarak izin verilen görev aygıt yalnızca bir lazer olmasıdır (488 nm). Bu nedenle, şu anda, fluorophore sonda tasarım yelpazesi klinik olarak onaylanmış tek renk aygıtları uyarma ile yakın kızılötesi ve 660 nm dalga boyu var olmayan bu sistem ile kullanmak için sınırlı olsa da. Bu doku autofluorescence düzeyi üzerinde bakteri-sonda duyarlılığı artırmak için hayalice ayrı bir fluorophore ile geliştirilecek bir sonda etkinleştirmek için aynı aygıt içinde uygulanan ikinci bir lazer çizgi var son derece arzu edilir. Çift renkli görev aygıtları geliştirme aşamasında olan ederken, onlar da değil klinik olarak onaylanır ve/veya maliyet önemli16.
Patojenik bakteri ve ex vivo insan akciğer dokusu ekran potansiyel probları ile kullanarak görev vitro Akış Sitometresi ve CLSM gibi geleneksel vitro teknikleri ve klinik yarar arasında köprü. Bu adım güven ile klinik görev birleştiğinde olabilir ileri taşımak umut verici bileşikler seçerken Imaging sunuyor; ve olup olmadığı test sonda hedef özgüllük, tutar veya herhangi bir hedef kapalı, doku, doğrudan bağlanma gibi etiketleme gösterir veya istikrarsızlık ile ev sahibi proteolitik enzimler gösterir olarak gösterge sağlar. Ayrıca her biri alınabilen probları doğrudan insan Akciğer doku artı tam hızı gerçek zamanlı olarak harekete geçirmek ve sonda bağlama karakterize etmek için bakteri, örnekleri eklemek için uygun olacaktır.
Biz hızla görüntüleme distal akciğer hastalarının içinde potansiyeli değerlendirmek için roman bakteri özel probları süzmek için bizim boru hattı kliniğe çok daha hızlı çeviri neden olur inanıyorum. Bunun nedeni büyük ölçüde bakteriler özel sonda yerel olarak bu microdose anlam bir bronkoskop çalışma kanal eklenen bir kateter akciğerinden içinde teslim (< 100 µg) tutarların teslim edilecektir. Bu nedenle, sistemik teslimat ve biodistribution bahçedeki değil bir endişe birçok diğer enfeksiyon hedeflerin bünyesinde veya nükleer görüntüleme ile olduğu gibi. Ayrıca, görüntüleme sonda içinde küçük bir doz teslim toksisite riskini azaltır ilgili komplikasyonlar (toksisite tarama çeviri için gerekli olacağını rağmen). Sonda korumak, kateter sonra FCFM lif ve görev tarafından biz bu yöntemi içinde gerçekleştirdiyseniz aynı şekilde sorguya akciğer aynı bölgeye göre değiştirilebilir. Görüntüleme sonda uzakta belirlenemeyen konsantrasyonları yıkar önce sonda yüklemesini hızla takip yapılmalıdır.
Bu tarama hastalığı tanımlama unutmamak önemlidir probları bu tekniği ile bakteriyel görüntüleme acentelere sınırlı olmamalı, ama aynı zamanda iltihabı gibi alternatif hedefleri olan probları doğrulama genişletmek olabilir. Bu yaklaşım Ayrıca görüntüleme FCFM üzerinden izin verilen nerede diğer hastalık konumlara bünyesinde adapte olması.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mühendislik ve fizik Bilimleri Araştırma Konseyi (EPSRC, Birleşik Krallık) disiplinler arası araştırma işbirliği hibe EP/K03197X/1, Sağlık Bakanlığı ve Wellcome Trust sağlık yenilik sorun Fonu (HICF) aracılığıyla teşekkür etmek istiyorum . Finansman referans numarası: 0510-069.
Materials
| 1-14 Microfuge | SciQuip | 90616 | Small benchtop microcentrifuge |
| 96-well plate | Corning | 3370 | Assay plate |
| Calcein AM | Sigma Aldrich | 17783 | Commercial fluorescent dye |
| Cellvizio 488 nm Research CLE | Mauna Kea Technologies | LC-0001-488 | Confocal laser endomicroscopy device |
| Cletop-S | Cletop | 14110601 | Fibre cleaner |
| Eppendorf (1.5 mL) | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microfuge tube |
| Eppendorf Research Plus Pipettes | Fisher Scientific | 11568663 | Micro pipettes |
| Falcon tube (50 mL) | Scientific Lab Supplies | 352070 | 50 ml centrifugation tube |
| Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PBS – wash media |
| IC-Viewer | Mauna Kea Technologies | LW-0001 | Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system |
| Incu-Shake midi | Sciquip | SQ-4020 | Floor standing shaking incubator |
| Lysogeny Broth | Sigma Aldrich (Miller) | L3522 | LB Growth media for S. aureus |
| non-standard research AlveoFlex 488 nm | Mauna Kea Technologies | MP-0002-AF3 | Fibred confocal fluorescence microscopy fibre |
| Quanti Kit 488 nm | Mauna Kea Technologies | LQ-0005 | Calibration kit for the CellVizio 488 system |
| S. aureus ATCC 25923 | ATCC | 25923 | Bacterial strain used in this study |
| Semi-micro spectrophotometry cuvette | Sigma Aldrich | C5416-100EA | For spectrophotometry |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 41102422 | Benchtop heater with shaking |
| UV 1101 Biotech photometer | Biochrom WPA | Spectrophotometer |
References
- Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. London: H M Government/Wellcome Trust Available from: https://amr-review.org/sites/default/files/160518_Final%20paper_with%20cover.pdf (2016)
- Caliendo, A. M., et al. Better Tests, Better Care: Improved Diagnostics for Infectious Diseases. Clin. Infect. Dis. 57, 139-170 (2013).
- Zumla, A., et al. Rapid point of care diagnostic tests for viral and bacterial respiratory tract infections-needs, advances, and future prospects. Lancet Infect. Dis. 14 (11), 1123-1135 (2014).
- Neumann, H., Kiesslich, R. . Yamada’s Textbook of Gastroent. , 2944-2949 (2015).
- Chauhan, S. S., et al. Confocal laser endomicroscopy. Gastrointest Endosc. 80 (6), 928-938 (2014).
- Goetz, M., Malek, N. P., Kiesslich, R. Microscopic imaging in endoscopy: endomicroscopy and endocytoscopy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11 (1), 11-18 (2014).
- Abbaci, M., et al. Confocal laser endomicroscopy for non-invasive head and neck cancer imaging: A comprehensive review. Oral Oncol. 50 (8), 711-716 (2014).
- Thiberville, L., et al. Human in vivo fluorescence microimaging of the alveolar ducts and sacs during bronchoscopy. Eur Respir J. 33, (2009).
- Thiberville, L., et al. Confocal fluorescence endomicroscopy of the human airways. Proc Am Thorac Soc. 6 (5), 444-449 (2009).
- Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical imaging of bacterial infections. Clin. Transl. Imaging. 4 (3), 163-174 (2016).
- Akram, A. R., et al. A labelled-ubiquicidin antimicrobial peptide for immediate in situ optical detection of live bacteria in human alveolar lung tissue. Chem. Sci. 6 (12), 6971-6979 (2015).
- Dickson, R. P., Erb-Downward, J. R., Huffnagle, G. B. Towards an ecology of the lung: new conceptual models of pulmonary microbiology and pneumonia pathogenesis. Lancet Respir Med. 2 (3), 238-246 (2014).
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Magiorakos, A. P., et al. The rise of carbapenem resistance in Europe: just the tip of the iceberg. Antimicrob Resist Infect Control. 2 (1), 6 (2013).
- Chastre, J., Fagon, J. -. Y. Ventilator-associated Pneumonia. Am. J. Respir Crit Care Med. 165 (7), 867-903 (2002).
- Krstajić, N., et al. Two-color widefield fluorescence microendoscopy enables multiplexed molecular imaging in the alveolar space of human lung tissue. J Biomed Opt. 21 (4), 046009-046009 (2016).
