Оптическая скрининг Роман бактерий-конкретных зонды на Ex Vivo человека легочной ткани, Конфокальная лазерная Endomicroscopy
Summary
Этот метод описывает процесс эффективный скрининг для оценки оптических изображений агентов бактерии конкретных внутри ex vivo человека легочной ткани, в расслоенных конфокальный флуоресцентной микроскопии для быстрой идентификации малых молекул химические зонд кандидатов с переводимые потенциалом.
Abstract
Улучшение скорости и точности обнаружения в бактериальные имеет важное значение для пациента стратификации и обеспечить надлежащее использование противомикробных препаратов. Для достижения этой цели, разработка методов диагностики признать бактериальное присутствие в режиме реального времени в момент ухода не требуется. Оптических изображений для прямой идентификации бактерий в пределах узла является привлекательным подход. Несколько попыток химических зонд конструкции и проверки были расследованы, однако никто еще не были успешно переведены на клинике. Здесь мы описываем метод для проверки ex vivo бактерий специфических преобразователей для идентификации бактерий в дистальной легких, отображаемого в расслоенных конфокальный флуоресцентной микроскопии (FCFM). Наша модель используется ex vivo человека легочной ткани и клинически утвержденных Конфокальная лазерная endomicroscopy (ДЗ) платформа для экрана Роман бактерии конкретных изображений соединений, тесно имитирует изображений условий, ожидается, что столкнулся с пациентами. Таким образом скрининга соединений, этот метод обеспечивает доверие потенциальных клинических уступчивость.
Introduction
Этот метод описывает процесс быстрого скрининга для оценки бактерии конкретных оптических изображений агентов в рамках ex vivo человека легочной ткани, “КЛЕ”, с помощью FCFM для быстрой идентификации соединений с потенциальными клинической полезности для визуализации бактерии в дистальной легких в situ.
Существует неотложных глобальных требование рацион антимикробной назначения в эпоху роста резистентности к противомикробным препаратам1. С этой целью разработки диагностических методов, которые действуют для определения бактериальной инфекции с высокой специфичностью, чувствительность и в режиме реального времени сильно стремились2. Существующие методы для подтверждения диагноза пневмоний у больных критически нездоровы, например в рамках интенсивной терапии (палаты интенсивной терапии), часто полагаются на интерпретации неспецифические клинические или радиологических функции наряду с бактериальной культуры техники от атмосферный жидкости/тканей, которые может занять до 3 дней для получения результатов. Кроме того бактериальной культуры от жидкости воплощено в дистальной легких и извлечь подвержен загрязнению от более проксимальном airways3 и часто культура отрицательные вследствие сопутствующего антибактериальной терапии или методов бедных выборки. Кроме того молекулярные методы, такие как полимеразной цепной реакции слишком чувствительны, когда используется на атмосферный жидкости, рискуя перенасыщению больных. Новые диагностические подход является молекулярный оптических изображений, что делает в situ молекулярной патологии тканей возможность; Однако требуется разработка и проверка соединений оптических изображений. Тем не менее прямой визуализации бактерий, через активируемых Оптические зонды потенциально очень мощный метод, чтобы разрешить изучение присутствия и эволюция пневмонии в пациента и, главное, могут использоваться для изучения взаимодействия хост возбудителя в ответ на лечение в реальном времени в.
“КЛЕ” является процедурой расследования в нескольких заболеваний4, включая в области гастроэнтерологии5,6,онкологии7и для допроса airways и альвеолярного мешки8, 9. Это позволяет точку ухода структурных изображений пораженной ткани, с использованием изображений bundle, который проходит через рабочий канал клинических эндоскопа волокно и форм прямой контакт с поверхности ткани, чтобы быть imaged confocal микроскопии. Однако одно ограничение, которое по-прежнему является необходимость универсального контрастного вещества. Таким образом использование конкретных зонды болезней, например определенных бактериальных агентов, может значительно расширить полезность этой модальности, непосредственно визуализации бактерий на месте предполагаемых инфекции. Оптическая агенты предлагают множество преимуществ перед другими методами, позволяя в реальном времени, с высоким разрешением изображения с диагностический потенциал. Кроме того оптические датчики предлагают перспективы мультиплексирования для допроса нескольких целей, все достигнутые при относительно низких затратах. Количество оптических агенты находятся в стадии разработки для этой цели, однако никто еще не были успешно осуществлены в рамках клиники10. Мы синтезированных библиотеки малых молекул химические датчики с специфичность к бактерии и разработали быстрого, эффективного трубопровода для оценки функции зонд для обнаружения бактериальной пневмонии на месте11.
Для выявления подходящего щупа кандидатов, пришлось быть выполнены до допроса зонда на ex vivo человека легочной ткани FCFM следующие условия: i) водный растворимость, ii) специфику и избирательности для быстро маркировки клинически соответствующих бактерий, iii) высокое соотношение сигнал шум и iv) стойкость к разложению в легких условиях. Последний был оценен Бронхоальвеолярный лаваж жидкости (BALF) от больных с острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), который является состоянием, которое характеризуется протеолитические и воспалительных сред в легких в реанимации. Кроме того зонды пришлось иметь подходящую Флюорофор для выявления клинически утвержденных оптических CLE изображений устройства в пределах человеческих легких альвеолярного ткани.
Трубопровод опросить каждого из этих предпосылок был следующим (на каждом этапе, только датчики, которые прошли были перенесены на следующий): (1) был синтезирован библиотека зондов должны расследоваться; (2) Каждый зонд был добавлен в группу живых бактерий для Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) для обеспечения бактериальных маркировки; (3) избирательность бактериальных маркировки над mammalian клеток в совместное культур с первичной нейтрофилов человека была учреждена CLSM; (4) стабильности и успешного маркировки бактерий в присутствии пациента ОРДС BALF определяется CLSM и матрица помощь лазерной десорбции/ионизации-время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии; (5) оптимальная концентрация кандидатов определяется CLSM, обеспечение селективности для бактерий над mammalian клеток была сохранена; (6) кандидатов были образы, FCFM в суспензии и ex vivo человека легких альвеолярного ткани для обеспечения стабильности и что сигнал шум был достаточным для обнаружения. Шаг 6 подробно рассматривается в рамках настоящего Протокола. Ранее сообщалось11была методология для шагов 1-5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Инфекции нижних дыхательных путей учета вторым наибольшим бременем болезней глобально12,13и существенное увеличение число инфекций, приписываемых антимикробные резистентных бактерий был сообщил14. Пневмония остается наиболее распространенная причина госпитализации. В реанимации развитие пневмонии осложняется диагностических неопределенности и связано с чрезвычайно высокой смертности показатель15. Во время наступления пневмонии бактерии размножаются в альвеолярной пространстве дистальной части легкого, область, которая является относительно стерильные, с минимальными микрофлору в области здравоохранения.
Этот метод описывает относительно поздней стадии ex vivo проверки бактерии конкретных оптических изображений зонды11, но дизайн, синтез, и зонд оценки до начала этот шаг проверки важно, как ранее показанного11 .
“КЛЕ” является формирующейся клинических техника для допроса болезни государства на месте в режиме реального времени. Он предлагает много преимуществ над традиционными методами для расследования предполагаемых легочной патологии, которая может включать биопсии и сбора жидкости промывания. Биопсии инвазивных и может привести к заболеваемости и смертности в вентилируемых пациентов, и собранные промывание жидкость часто бывает загрязнена бактерий из верхних дыхательных путей. “КЛЕ” в обнаружении пневмонии используется однако несколько ограничено из-за плохой наличие совместимых изображений датчики, которые могут предоставить функциональные сведения заболевания, несмотря на многие согласованные усилия10. Предлагает сочетание ДЗ с оптическим агенты перспективы диагностики пневмонии быстрее и меньше вмешательства по сравнению с текущей стандартной практикой.
В пробоподготовки и установки платформы “КЛЕ” критические шаги к настоящему Протоколу. Получение тканей человека отношение к окончательной клиническое применение также важна, как человека легочной ткани, как продемонстрировано в рамках этого исследования. Это необходимо для использования тканей человека, потому что степень ткани аутофлюоресценция показывает большие различия между видами и поэтому может ввести в заблуждение чувствительность бактерии зонд изображаемого. Кроме того важно получение этики для поиска и использования человеческого легочной ткани. От технического уровня, правильной очистки, вложение изображений волокна в LSU платформа, и калибровки имеет важное значение для хорошего разрешения и последовательной обработки изображений, как обеспечение эквивалентного количества бактерий добавляются для каждого образца ткани легких. Для дальнейшего расширения полезности этого метода для проверки панели датчиков, повторяя процедуру с спектр патогенов, таких как те, вероятно, будет возбудителей пневмонии является необходимым.
Крупнейший ограничением этой методики является, что клинически утвержденных CLE устройство имеет только один лазерный (488 нм). Таким образом в настоящее время, выбор Флюорофор для Конструкция зонда ограничен для использования с этой системой, хотя клинически утвержденных одного цвета, которую устройства существуют с длинами волн возбуждения 660 нм и ближней ИК-области спектра. Весьма желательно иметь второй линии лазерного реализовано в рамках того же устройства, чтобы зонд с спектрально собственный Флюорофор для повышения чувствительности бактерий зонд над уровнем аутофлюоресценция ткани. Хотя двухцветный CLE устройства находятся в стадии разработки, либо они утверждаются не клинически и/или их стоимость значительные16.
“КЛЕ” в пробирке с использованием патогенных бактерий и ex vivo человека легочной ткани на экране потенциальных зонды ликвидирует разрыв между обычными в vitro методы, такие как проточной цитометрии и CLSM и клинической полезности. Этот шаг предлагает доверие при выборе перспективных соединений для продвижения вперед в сочетании с клинической CLE изображений; и даст указание ли проверенный зонд поддерживает целевую специфику, или демонстрирует любой пробить маркировки, например привязку непосредственно к ткани, или показывает нестабильность с принимающей протеолитических ферментов. Было бы также целесообразно добавить каждый из доступных зондов непосредственно образцы человеческого легочной ткани плюс бактерий, полностью характеризовать скорость зонда привязки и активации в режиме реального времени.
Мы считаем, что наш трубопровод для быстрого скрининга Роман бактерии конкретных зонды оценить их потенциал для обработки изображений в дистальной легких пациентов приведет к гораздо быстрее перевод в клинику. Это главным образом потому, что бактерии конкретных зонд может быть доставлено локально в легких через катетер, вставлен вниз рабочий канал бронхоскоп, означает, что microdose (< 100 мкг) суммы может быть доставлено. Таким образом системные поставки и накопление этого соединения является не является проблемой, как в случае многих других целей инфекции в теле, или с ядерными изображений. Кроме того, обеспечивая изображений зонд в такой небольшой дозы уменьшает риск токсичности связанных осложнений (хотя для перевода потребуется токсичности скрининга). После инстилляции зонда катетер может затем быть заменена FCFM волокна и того же региона легких, допрашивали "КЛЕ", так же, мы провели в этом методе. Изображения должны быть выполнены быстро после установки зонда перед зонд смывает обнаружить концентрации.
Важно также отметить, что Скрининг болезней выявление зонды, эта техника не должна быть ограничена агентов бактериальной изображений, но может также распространяться на проверки датчиков с альтернативных целей, таких как воспаление. Этот подход должен также быть адаптированы для других заболеваний места в тексте, где допустимо изображений через FCFM.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить инженерии и физическим научным исследованиям Совета (EPSRC, Соединенное Королевство) междисциплинарных исследований сотрудничестве Грант EP/K03197X/1, Департамент здравоохранения и Уэллком траст через фонд инноваций вызов здравоохранения (HICF) . Финансирования номер: 0510-069.
Materials
| 1-14 Microfuge | SciQuip | 90616 | Small benchtop microcentrifuge |
| 96-well plate | Corning | 3370 | Assay plate |
| Calcein AM | Sigma Aldrich | 17783 | Commercial fluorescent dye |
| Cellvizio 488 nm Research CLE | Mauna Kea Technologies | LC-0001-488 | Confocal laser endomicroscopy device |
| Cletop-S | Cletop | 14110601 | Fibre cleaner |
| Eppendorf (1.5 mL) | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microfuge tube |
| Eppendorf Research Plus Pipettes | Fisher Scientific | 11568663 | Micro pipettes |
| Falcon tube (50 mL) | Scientific Lab Supplies | 352070 | 50 ml centrifugation tube |
| Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PBS – wash media |
| IC-Viewer | Mauna Kea Technologies | LW-0001 | Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system |
| Incu-Shake midi | Sciquip | SQ-4020 | Floor standing shaking incubator |
| Lysogeny Broth | Sigma Aldrich (Miller) | L3522 | LB Growth media for S. aureus |
| non-standard research AlveoFlex 488 nm | Mauna Kea Technologies | MP-0002-AF3 | Fibred confocal fluorescence microscopy fibre |
| Quanti Kit 488 nm | Mauna Kea Technologies | LQ-0005 | Calibration kit for the CellVizio 488 system |
| S. aureus ATCC 25923 | ATCC | 25923 | Bacterial strain used in this study |
| Semi-micro spectrophotometry cuvette | Sigma Aldrich | C5416-100EA | For spectrophotometry |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 41102422 | Benchtop heater with shaking |
| UV 1101 Biotech photometer | Biochrom WPA | Spectrophotometer |
References
- Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. London: H M Government/Wellcome Trust Available from: https://amr-review.org/sites/default/files/160518_Final%20paper_with%20cover.pdf (2016)
- Caliendo, A. M., et al. Better Tests, Better Care: Improved Diagnostics for Infectious Diseases. Clin. Infect. Dis. 57, 139-170 (2013).
- Zumla, A., et al. Rapid point of care diagnostic tests for viral and bacterial respiratory tract infections-needs, advances, and future prospects. Lancet Infect. Dis. 14 (11), 1123-1135 (2014).
- Neumann, H., Kiesslich, R. . Yamada’s Textbook of Gastroent. , 2944-2949 (2015).
- Chauhan, S. S., et al. Confocal laser endomicroscopy. Gastrointest Endosc. 80 (6), 928-938 (2014).
- Goetz, M., Malek, N. P., Kiesslich, R. Microscopic imaging in endoscopy: endomicroscopy and endocytoscopy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11 (1), 11-18 (2014).
- Abbaci, M., et al. Confocal laser endomicroscopy for non-invasive head and neck cancer imaging: A comprehensive review. Oral Oncol. 50 (8), 711-716 (2014).
- Thiberville, L., et al. Human in vivo fluorescence microimaging of the alveolar ducts and sacs during bronchoscopy. Eur Respir J. 33, (2009).
- Thiberville, L., et al. Confocal fluorescence endomicroscopy of the human airways. Proc Am Thorac Soc. 6 (5), 444-449 (2009).
- Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical imaging of bacterial infections. Clin. Transl. Imaging. 4 (3), 163-174 (2016).
- Akram, A. R., et al. A labelled-ubiquicidin antimicrobial peptide for immediate in situ optical detection of live bacteria in human alveolar lung tissue. Chem. Sci. 6 (12), 6971-6979 (2015).
- Dickson, R. P., Erb-Downward, J. R., Huffnagle, G. B. Towards an ecology of the lung: new conceptual models of pulmonary microbiology and pneumonia pathogenesis. Lancet Respir Med. 2 (3), 238-246 (2014).
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Magiorakos, A. P., et al. The rise of carbapenem resistance in Europe: just the tip of the iceberg. Antimicrob Resist Infect Control. 2 (1), 6 (2013).
- Chastre, J., Fagon, J. -. Y. Ventilator-associated Pneumonia. Am. J. Respir Crit Care Med. 165 (7), 867-903 (2002).
- Krstajić, N., et al. Two-color widefield fluorescence microendoscopy enables multiplexed molecular imaging in the alveolar space of human lung tissue. J Biomed Opt. 21 (4), 046009-046009 (2016).
