共焦点レーザー Endomicroscopy Ex Vivoひと肺組織の新規細菌固有の光学検査プローブします。

インフォームド コンセント後すべてのひと肺組織を得、地域の倫理委員会で承認された研究。 1. 生物学的試料の調製 プローブの準備 各プローブの 1 mM 在庫ソリューションを構成する (例えば、カルセイン AM, UBI 3, 10 月 UBIなど) 滅菌 dH2O、化合物11をプローブ、凍結乾燥重量を量ることの微妙なバランスを使用します。DH2O を追加する量が重量を量られた質量と分子プローブの重量に基づいて計算します。 細菌文化の準備注: このメソッドの黄色ブドウ球菌は模範ひずみとして使用されました。任意の適切な菌株を選択できます。適切な励起と発光スペクトルを持つ細菌をラベル任意の商業染料は、細菌を積極的にラベルを選択できます。 滅菌ループを使って新鮮なホストゲノム スープ (LB) 寒天培地プレートから単一コロニー希望菌株を選択します。文化メディアにループの終わりを浸すことによってポンドの 10 mL の 50 mL の遠心管中に植民地を接種します。37 ° C で 16 時間 250 rpm で孵化させなさい (または夜通し)。 900 μ L 1 mL キュベットの LB に一晩かけて培養の 100 μ L を追加することによって一晩文化の OD595を決定します。595 で外径を測定分光光度計で nm (1 ml の LB キュベットを空白として使用)。得られた OD を一晩かけて培養の OD を取得する 10 に乗算します。 一晩文化のサブカルチャー。595 の光学濃度を調整することによってこれを行う nm (外径595) 新鮮なポンドの 10 の 0.1 mL を 10 mL に追加する一晩かけて培養の必要量を計算 0.1 OD595を調整する新鮮なポンド。37 ° c, 250 rpm、文化まで中間ログ相 (外径595 0.6 – 0.8)、文化を孵化させなさい約 4 時間。 文化の光密度 (ステップ 1.2.2) と 1 x 10 の収穫8コロニー 1.5 mL マイクロ チューブ (例えば、細菌文化が OD595 場合に単位 (CFU) (外径595 ~ 1-1 x 108 CFU/mL) 細菌文化を形成測定します。0.6、収集 1.67 mL)。文化常温細菌を餌に 1 分間、10,000 × g で遠心分離機します。リン酸で二度ペレット洗浄緩衝生理食塩水 (PBS) 再 (ピペッティング上下に慎重に) によって、1 mL の PBS は、上記のように遠心、上清を廃棄、繰り返しペレット。上清を取り外すとき細菌のペレットが外れないように注意してください。1 mL の PBS に最終的なペレットを再懸濁します。注: は、表示プロシージャごとに必要に応じて多くのサンプルを準備します。1.2.5.1、1.2.5.2、または 1.2.5.3 ステップが続く 1 h までのプロトコルがここで一時停止可能性が。 細菌染色 カルセイン AM と細菌をラベル付け、洗浄培養に 1 μ M の最終的な集中に染料を追加します。文化 300 rpm で振とうしながら 37 ° C で 30 分間インキュベートします。ステップ余分な染料を取り除く 1.2.4 のように遠心沈降法による PBS 3 回で counterstained の細菌懸濁液を洗浄します。1 mL の PBS に再懸濁します、100 μ L 外径595 0.5 カルセイン午前を 200 μ l 添加染色細菌を取得する PBS で 1:1 の希釈します。プロトコルは、1 h までここで停止可能性があります。 ラベル テスト プローブ (例えばUBI 3 か UBI 10)、細菌培養 OD595 0.5 で 200 μ L PBS を取得する PBS で 1:1 の 100 μ L を希釈します。細菌とプローブの徹底的な混合を確実にしたマイクロ チューブを数回反転を最終濃度 10 μ M のプローブのいずれかを追加します。注: イメージングは臨床シナリオを模倣するプローブの添加後すぐに実行する必要があります。 コントロールを準備するには、文化無染色の 200 μ L を取得する PBS で 1:1 の希釈 100 μ、無染色細菌サンプルは595 0.5 サンプルを OD します。 ひと肺組織体外の準備注: ひと肺組織のサンプルは、肺癌に対する外科的切除を受けた患者から得られました。イメージング用すべての組織は、癌の成長から正常肺組織のサンプルから得られました。サンプルは、オペレーティング劇場から新鮮な撮影され、使用するまで-80 ° c チューブ ・遠心分離チューブに格納されています。 イメージング、直前にドライアイス冷凍庫からひと肺組織のサンプルを削除します。常温で組織に少し; 解凍を許可します。1 x 4 mm2セクションにメスをスライスするだけ。注: 融解のレベルは重要です。冷凍も解凍も組織がなく、チッピングなしスライスし、組織は柔らかすぎてスライスします。 鉗子を使用すると、96 ウェル クリア フラット下部組織培養プレートのウェルにスライスしたひと肺組織を配置します。ドライアイス-80 ° C のフリーザーに戻る輸送のための任意の未使用のひと肺組織をストレージ コンテナーと場所にすぐに戻る。 100 μ L の PBS をピペットでそれぞれの肺組織のサンプルに追加します。すべての組織は、PBS で覆われている (そして井戸の壁にこだわっていない) ようにピペット チップを使用します。組織がわずかに膨らむし、浮くことがあります。サンプル ソリューションに組織から濾すこと血を許可するように数分間に PBS を残します。できるだけ PBS の多くを削除します。組織は、ピペットの先端の端をブロック可能性があります。これを防ぐためにプレート/チップ配置の角度をみてください。 無染色の 100 μ L をピペット、カルセインだというラベルの付いた、またはテスト プローブ標識も含む各肺組織に細菌。また肺組織と 100 μ L の PBS を使用してコントロールを設定します。これらのコントロールの井戸には、細菌なしプローブ蛍光バック グラウンドやプローブの非特異的活性化の増加を測定する肺組織だけで追加できます。肺組織と PBS 井戸も含まれる必要があります。 2. FCFM CLE デバイスとイメージング CLE デバイスをセットアップします。注: CLE システム 20 分ウォーム アップ レーザーを許可するように校正前に、の準備します。 システムのトランスの背面に on/off スイッチを押すし、指定したコンピューターをオンに。レーザースキャニング ユニット (LSU) の前面のオン/オフ ボタンを押します。ユニットがオンになっていることを示す緑のライトの外観を確認します。 CLE ソフトウェア アイコンをダブルクリックします。ログイン情報を入力し、(10-30 s) の初期化に LSU を待ちます。 繊維をイメージング新しい FCFM の使用は、付属 CD のインストールが必要です。インストール CD をコンピューターの CD ドライブに挿入し、画面の指示に従ってください。 繊維クリーナー FCFM イメージング光ファイバー コネクタ ユニットをクリーンアップします。前進ほこり/汚れのクリーニング リボン コネクタをこする。LSU の前面から保護の黄色のキャップを取り外します。 LSU のハブを準備するには、ゆっくり止まるまで反時計回り銀ハブを回転します。上向きコネクタの平らな面と、FCFM イメージング ファイバー コネクタをハブに挿入します。場所で繊維を押し、それを 2 回クリックするまで時計回りに銀ハブを回します。さらに 45 ° 銀のハブを時計回りに回転させることで接続が完了します。注: 繊維が認識されない場合、イメージングファイバー FCFM をインストールされており、正しい向きで接続されていることを確認します。 ポップアップ イメージング繊維校正 FCFM を完了するための指示に従います。3 つのステップがある: (1) FCFM イメージング繊維試験 (ステップ 2.1.7 – 2.1.8)、背景 (2) 買収 (2.1.9 ステップ)、(3) 光ファイバー検出 (ステップ 2.1.10)。 画面の ‘開始レーザー’ ボタンを押します。レーザーが中心します。 新鮮なバイアルを選択 (黄色: キャリブレーション; 赤: きれい; 青: リンス) キャリブレーションからキットし、画面の指示に従って: 黄色のバイアルに繊維をイメージング FCFM の遠位端に配置し、モニターの蛍光性の増加のため見る場所、(攪拌) なし赤のバイアルにファイバー先端。(下図のコンピューターのモニター上に) 消える蛍光を待ちます。最終的にブルーの瓶で先端を洗浄します。注: 蛍光が消えていない場合 8% H2O2とレンズ クリーニング組織 FCFM イメージング繊維をきれいし、再開します。満足のいく結果が得られるまで手順を繰り返します (イメージの品質が明確で、明白な汚れからマークがない)。 青い瓶に繊維をイメージング FCFM を配置します。プレス ‘スタート レーザー’ ‘計算’ オプションになったらこれが続きます。 黄色のバイアルに繊維をイメージング FCFM を配置します。プレス ‘スタート レーザー’ ‘計算’ オプションになったらこれが続きます。 自動校正時の赤のバイアルに置くことによって繊維をイメージング FCFM の遠位端をきれい > 10 の青のバイアルに続いて s > 4 s、ソフトウェアによって示される。 CLE でデータの収集 セットアップ後、保存場所とファイルのプレフィックスを選択するウィンドウが開きます。データ ストレージの目的のフォルダーを選択、それに応じてプレフィックスの名前します。 フットペダルを置き、オペレーターが簡単にアクセスすることができます。左のペダル: レーザーがオン/オフ。センター ペダル: 一時停止;右のペダル: 録画/停止します。注: レーザー コントロールは、画面上のコントロールからもアクセスできます。 画面上の「スタート」をクリックか、レーザーをオンに左の足ペダルを押します。これは集録を開始し、100% のレーザー出力と 12 フレーム/秒 (デフォルト設定) のフレーム レートを使用して画像を得る。注: 他のアプリケーションの画面サンプルの種類に応じて、必要な場合にこれらの設定を変更できます。 それぞれの細菌懸濁液サンプル画像します。 FCFM イメージングファイバーの遠位端を挿入し、サンプルを尋問する懸濁液を通してゆっくりと繊維を移動します。 任意の長さの動画を記録 (10 分程度)、右足ペダルを押すか繊維がサンプルをゆっくり移動、画面上のレコード コントロールを選択します。 8% H2O2とレンズのサンプル間の組織を洗浄 FCFM イメージングファイバーの遠位端をきれいに。注: 10 30 s の典型的なビデオ長さの in vitroイメージング十分です。 肺組織のサンプルのそれぞれをイメージします。 サンプルに光・ イメージングは、ファイバーの末端と組織の間の直接の接触が行われることを確保する FCFM の遠位端を挿入します。ゆっくりサンプルを尋問する周りイメージングファイバーの末尾を移動します。注: 組織から繊維の端を持ち上げた焦点平面から組織が削除されます。ただし、これを使用して、組織に満たされていないラベルの付いた細菌の画像があります。 任意の長さの動画を記録 (10 分程度)、右足ペダルを押すか繊維がサンプルをゆっくり移動、画面上のレコード コントロールを選択します。注: 通常、ビデオの長さ 30 s が組織にex vivoイメージングのために十分。 レンズの組織と 8% H2O2サンプル間のクリーニングできれいに FCFM イメージングファイバーの遠位端。 システムをオフにします。 レーザーをオフにして、左足のペダルを押すかをクリックして、画面に表示されるボタンをクリックします。 CLE デバイスから銀の LSU ハブを反時計回り止まるまで回して FCFM イメージング繊維を外します。LSU のハブから、LSU から光ファイバー コネクタを注意深く引いてイメージングファイバー FCFM を削除します。 きれいにし 8% H2O2とレンズ クリーニング組織 FCFM イメージング ファイバーを消毒します。FCFM イメージングファイバーの近位端と LSU ユニットの前面に保護キャップを戻ります。ストレージ ボックスに繊維をそっと置きます。 すぐデータ キャプチャ ソフトウェアと外付けの USB デバイスに保存されているファイルをコピーします。コンピューターをシャット ダウンし、3 のフロント パネル I/O を押して LSU デバイスをオフに緑色の光が消えるまで s。 ひと肺組織や地域の規制によると細菌の処分します。 3. データ分析 ソフトウェアを開き、ソフトウェア ダッシュ ボード上の ‘に行く’ アイコンをコンピューター上の適切なディレクトリを選択して分析用のファイルをインポートします。または、ファイルをドラッグして、ソフトウェアのダッシュ ボードにドロップすることができます。 それらを開いて各ビデオ ファイルをダブルクリックします。動画が自動的に最適化されたカラー ルックアップ テーブル (LUT) の再生し、カラー テーブルを調整します。自動の強度強度スケール バー上の杖ボタンをクリックして、拡大/縮小を無効にします。ボタンの周囲に黒い影が無い場合、この機能は無効です。注: は自動輝度のスケールを比較して同じデータ セットからのビデオを分析することは不可能、各ビデオを通して継続的なコントラスト強調を防ぐために無効にしなければなりません。 最高のコントラストを与えるに最小値と最大のバーを移動することによってスケーリング目的の強度を選択します。広いダイナミック レンジを確保するためスケーリング強度の選択がキャプチャされるヒストグラム ツールを使用します。メモ: ダイナミック レンジが画像が飽和していないようにことを確認 (つまり彩度を示す、イメージの白い領域を制限する)、低強度機能が逃されないように。 目的の拡大/縮小が達成される「デフォルト (緑)」として記載されているドロップ ダウン メニューのボタン上で右しますクリック。LUT を保存するオプションを選択します。LUT を目的の場所に保存します。 お互いにデータ セット内でビデオ、「デフォルト (緑)」ドロップ ダウン メニューをクリック右し同じ LUT を適用し、’ 負荷 LUT’ を選択します。一貫した強度、データセット内のすべてのビデオにスケーリングを適用する適切なファイルを選択します。 加工動画をエクスポートするには、’映画リール’ ボタンをクリックします。適切なビデオ形式、例えば「プレゼンテーション用」、を選択する .mpg ファイルが生成されます。’エクスポート’ を押し、ビデオのファイルを保存するファイルの場所を選択します。’カメラ’ ボタンをクリックして、単一のフレームのスナップショットをエクスポートできます。.Jpg、.bmp、.png ファイルを保存することが可能です。ファイルのデスティネーションを選択し、保存を押します。注: ビデオは、プレゼンテーションやさらに定量化の準備のための任意のソフトウェアに、インポートできます。ラベル付けされた細菌は、ビデオで緑の ” が点滅ドットとして視覚化されます。肺ティッシュの構造は黒表示肺胞腔と順序付けられた蛍光ストランドとして明らかになります。