הקרנת אופטי של הרומן חיידקים ספציפיים רגשים על לשעבר Vivo רקמת הריאה האנושית על ידי לייזר קונפוקלי Endomicroscopy

כל רקמת הריאה האנושי הושג בעקבות הסכמה מדעת, המחקר אושרה על ידי ועדת האתיקה אזוריים. 1. הכנת דגימות ביולוגיות הכנה של הגששים להמציא פתרון מניות 1 מ מ של כל בדיקה (למשל, Calcein AM, UBI-3, UBI-10, וכו) dH סטרילי2O, באמצעות איזון עדין לשקול את הליחה בדיקה מורכבת11. חישוב הנפח של dH2O להוספת בהתבסס על מסה שנשקל משקל מולקולרי של המכשיר. הכנת תרביות חיידקיםהערה: עבור שיטה זו, Staphylococcus aureus שימש המתח המיתר. ניתן לבחור כל זן חיידקי המתאים. ניתן לבחור כל צבע מסחרי שמתייג חיידקים המתאימים עירור, ספקטרום הפליטה לתייג באופן חיובי את החיידקים. בחר מושבה בודדת של זן חיידקי הרצוי מתוך צלחת אגר Lysogeny מרק (LB) טריים באמצעות לולאה סטרילי. לחסן את המושבה לתוך 10 מ”ל של ק ג בשפופרת צנטרפוגה 50 מ ל בטבילת סוף הלולאה לתוך תרבות התקשורת. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 250 סל”ד עבור 16 h (או לילה). לקבוע את יתר595 של התרבות לילה על-ידי הוספת 100 µL של התרבות לילה µL 900 ק ג ב cuvette 1 מ”ל. למדוד OD-595 nm (באמצעות cuvette של 1 מ ל LB ריקים) בספקטרופוטומטר. הכפל OD שהושג ב- 10 כדי להשיג OD לתרבות לילה. תת-תרבות התרבות בין לילה. עושים זאת על ידי התאמת הצפיפות האופטית-595 nm (OD595) עד 0.1 ב 10 מ”ל של טרי LB. לחשב את הנפח הנדרש של תרבות לילה להוסיף 10 מ ל LB טריים כדי להתאים את יתר595 ל 0.1. דגירה התרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 250 סל”ד עד התרבות מגיע שלב אמצע יומן (OD-595 0.6 – 0.8) כ- 4 שעות. מודדים את צפיפות אופטית תרבות (שלב 1.2.2) והמושבה קציר 1 x 108 ויוצרים יחידות (CFU) (OD595 ~ 1-1 x 108 CFU/mL) של התרבות חיידקים לתוך 1.5 mL microtube (למשל, אם התרבות חיידקי OD595 0.6, לאסוף מ ל 1.67). Centrifuge התרבות ב g x 10,000 בטמפרטורת החדר במשך 1 דקה הצניפה החיידקים. לשטוף גלולה פעמיים בפוספט buffered תמיסת מלח (PBS) על ידי resuspending (pipetting למעלה ולמטה בזהירות) בגדר 1 מ”ל PBS, צריך שתוציאו לעיל, השמטת את תגובת שיקוע ו חוזרות. . שמור על עצמך לא להוציא בגדר חיידקי בעת הסרת את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר הסופי ב 1 מ”ל PBS.הערה: להכין דוגמאות רבות כנדרש עבור כל פרוצדורה תיוג. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה לשעה עד ואחריו שלב 1.2.5.1, 1.2.5.2 או 1.2.5.3. צביעת חיידקי להוספת תווית החיידקים עם Calcein AM, להוסיף לצבוע ריכוז סופי של 1 מיקרומטר לתוך התרבות חיידקי שטף. דגירה התרבות למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-300 סל ד. לשטוף את המתלים חיידקי counterstained PBS 3 פעמים על ידי צנטריפוגה כמו שלב 1.2.4 כדי להסיר צבע עודף. Resuspend ב 1 מ”ל PBS, לדלל 100 µL 1:1 ב- PBS כדי לקבל 200 µL של יתר595 0.5 Calcein אני מוכתם חיידקים. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה עבור עד 1 h. להוספת תווית החיידקים עם מבחן רגשים (למשל, UBI-3 או UBI-10), לדלל 100 µL של התרבות חיידקי 1:1 ב- PBS להשיג OD-595 -0.5 ב 200-µL PBS. הוסף שבאחת הגששים כדי ריכוז סופי של 10 מיקרומטר. להפוך את microtube מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב יסודי של החיידק, החללית.הערה: הדמיה צריכה להתבצע מיד לאחר התוספת של המכשיר כדי לחקות את התרחיש קליניים. כדי להכין את הפקד דגימות בקטריאליות וללא רבב, שתדללו 100 µL של תרבות 1:1 עם PBS כדי לקבל 200 µL של וללא רבב כמנת מדגם595 0.5. הכנה של ex-vivo רקמת הריאה אנושיהערה: דגימות רקמה אמבריולוגיה, התקבלו חולים שעברו כריתה כירורגית עבור קרצינומה של הריאה. כל רקמה המשמש הדמיה הושג מדגימות של רקמת הריאה נורמלי מן הגידול הסרטני. דוגמאות שצולמו טריים מן התיאטרון ההפעלה ומאוחסנים צינורות microtubes או צנטריפוגה ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש. מיד לפני הדמיה, הסר את דגימת רקמה אמבריולוגיה מהמקפיא בקרח יבש. בטמפרטורת החדר, לאפשר את הרקמה להפשיר מעט; רק מספיק כדי להיות פרוס עם איזמל למקטעים2 1 x 4 מ מ.הערה: רמת מפשיר חשובה; גם קפוא הרקמה לא יחתוך ללא סתתים, גם הקרת ואת הרקמה רכה מדי לחתוך. באמצעות מלקחיים, למקם את רקמת הריאה האנושי הפרוס בארות של צלחת תרביות רקמה 96-ובכן ברור שטוח התחתונה. לחזור כל רקמה מהריאה אנושיים שאינם בשימוש מיד למכולה והמקום בקרח יבש למשלוח חזרה אל המקרר-80 ° C. להוסיף 100 µL PBS כל מדגם רקמת הריאה עם פיפטה. שימוש בקצה פיפטה כדי להבטיח כל הרקמה הוא מכוסה מגניב (וגם לא תקועות דפנות הבאר). הרקמה יתנפח מעט ואני יכול לעוף. להשאיר את PBS המדגם לכמה דקות לאפשר דם תסנן מן הרקמות אל הפתרון. להסיר כמה שיותר טוב, מגניב. הרקמה עלול לחסום את הסוף של קצה פיפטה; לנסות זווית הצבת צלחת/טיפ על מנת למנוע זאת. פיפטה µL 100 של וללא רבב, Calcein אני עם התווית או מבחן-בדיקה שכותרתו לחיידקים כל טוב המכיל רקמת הריאה. גם להגדיר את הפקדים עם רקמת הריאה, 100 µL PBS. כדי שליטה הבארות הללו ניתן להוסיף הגששים ללא חיידקים כדי למדוד כל גידול פלורסצנטיות רקע ו/או שאינם ספציפיים ההפעלה של המכשיר על ידי רקמת הריאה לבד. טוב עם רקמת הריאה, PBS גם צריך להיות כלול. 2. הדמיה עם המכשיר לנקות עם FCFM להגדיר את המכשיר לנקותהערה: להכין את המערכת לנקות 20 דקות לפני הכיול כדי לאפשר את הלייזר להתחמם. הקש את מתג הפעלה/כיבוי על הגב של השנאי של המערכת, הפעל את המחשב המיועד. לחץ על לחצן הפעלה/כיבוי על החלק הקדמי של הלייזר סריקה יחידה (LSU). לאשר את המראה של אור ירוק, המציין כי היחידה פעילה. לחץ פעמיים על סמל התוכנה לנקות. הזן את פרטי ולחכות LSU לאתחל (10-30 s). לשימוש FCFM חדש הדמיה סיבים, הכרחי התקנה עם התקליטור שסופקו. להכניס את תקליטור ההתקנה לכונן התקליטורים של המחשב, בצע את ההוראות שעל-גבי המסך. נקה FCFM הדמיה סיבים מחבר היחידה עם בד נקי יותר. לשפשף את המחבר ברצועת הכלים ניקוי בתנועה קדימה כדי להסיר אבק/לכלוך. הסר את המכסה המגן צהוב בחזית LSU. הכן את הרכזת LSU על ידי בעדינות סיבוב נגד כיוון השעון הרכזת כסף עד לעצירתו. הכנס את מחבר סיבים הדמיה FCFM לתוך ה-hub עם הצד השטוח של המחבר כלפי מעלה. מחזיקים הסיבים במקומו וסובב הרכזת כסף עם כיוון השעון עד שתינעל פעמיים. להשלים את החיבור על-ידי סיבוב בכיוון השעון הרכזת כסף מאת נוספת 45°.הערה: אם הסיבים אינו מזוהה, בדוק כי FCFM הדמיה סיבים הותקנה והיתה מחובר לכיוון הנכון. בצע את ההוראות כי מוקפץ להשלמת את FCFM הדמיה סיבים כיול. יש 3 שלבים: (1) FCFM הדמיה סיבים מבחן (שלבים 2.1.7 – 2.1.8 תגובה על), (2) רקע רכישה (שלב 2.1.9), (3) סיבים זיהוי (שלב 2.1.10). לחץ על לחצן ‘התחל לייזר’ על המסך. הלייזר יהיה מרכז. בחר בקבוקונים טריים (צהוב: לכייל; אדום: לנקות; כחול: שטיפה) מ הכיול ערכת ובצע את ההוראות שעל-גבי המסך: מקום בקצה הדיסטלי של FCFM הדמיה סיבים לתוך הבקבוקון צהוב, לצפות לגידול זריחה על הצג ולאחר מכן מקם עצה סיבים לתוך הבקבוקון אדום (ללא ערבוב). המתן קרינה פלואורסצנטית (כפי שמוצג על מסך המחשב) להיעלם. סוף סוף יש לשטוף את הטיפ סיבים בבקבוקון כחול.הערה: אם ידי קרינה פלואורסצנטית אינה נעלמת, לנקות FCFM סיבים הדמיה עם 8% H2O2 ו עדשה ניקוי רקמות ולהתחיל שוב. חזור על התהליך עד תוצאות משביעות רצון מתקבלים (איכות התמונה לא ברורה, אין סימני לכלוך ניכרים). מניחים את FCFM הדמיה סיבים לתוך הבקבוקון כחול. לחץ על “התחל לייזר” ואחריו “לחשב” הזה הופך אופציה. מניחים את FCFM הדמיה סיבים לתוך הבקבוקון צהוב. לחץ על “התחל לייזר” ואחריו “לחשב” הזה הופך אופציה. במהלך הכיול האוטומטי, נקה בקצה הדיסטלי של FCFM הדמיה סיבים על-ידי הצבת בבקבוקון אדום עבור > 10 s, ואחריו את המבחנה כחול עבור > 4 s, כמצוין על-ידי התוכנה. איסוף הנתונים עם דוד לאחר ההתקנה, יפתח חלון לבחירת מיקום האחסון של קובץ קידומת. בחר את התיקיה הרצויה עבור אחסון הנתונים, ותנו שם את הקידומת בהתאם. המקום דוושות רגל על כך שהם ניתן לגשת בקלות על ידי המפעיל. הדוושה השמאלית: לייזר/ביטול; מרכז הדוושה: להשהות; נכון פדלים: שיא/הפסק.הערה: הפקדים לייזר ניתן גם לגשת באמצעות הפקדים על-גבי המסך. לחץ על ‘התחל’ על המסך או לחץ על הדוושה כף הרגל השמאלית כדי להפעיל את הלייזר. זה להתחיל רכישה ולקבל תמונות באמצעות עוצמת הלייזר 100% וקצב 12 מסגרות לשנייה (הגדרות ברירת המחדל).הערה: עבור יישומים אחרים, הגדרות אלה ניתן לשנות על המסך במידת הצורך, בהתאם לסוג הדגימה. תמונה כל הדגימות ההשעיה חיידקי. הכנס בקצה הדיסטלי של סיבים הדמיה FCFM ולהעביר סיבים באיטיות דרך ההשעיה לחקור את הדגימה. להקליט קטעי וידאו בכל אורך (עד 10 דקות) על-ידי לחיצה על דוושת רגל ימין או בחירת רשומה הפקדים על-גבי המסך, כמו הסיבים נע לאט סביב המדגם. נקה הסוף דיסטלי של סיבי FCFM הדמיה עם 8% H2O2 ו עדשה ניקוי רקמות בין הדגימות.הערה: אורכי וידאו אופייני של 10-30 s מספיקים עבור הדמיה במבחנה . תמונה כל הדגימות רקמת הריאה. הכנס בקצה הדיסטלי של FCFM הדמיה סיבים לתוך הדגימה, כדי להבטיח כי נוצר קשר ישיר בין הסוף של סיבי הרקמה. להניע בעדינות את הקצה של סיבים הדמיה סביב לחקור את הדגימה.הערה: הרמת הסוף של סיבי מן הרקמה יהיה להסיר את הרקמה מהמטוס מוקד; עם זאת, זה עשוי לשמש לשיקוף שכותרתו חיידקים, כי הם לא דבקו הרקמה. להקליט קטעי וידאו בכל אורך (עד 10 דקות) על-ידי לחיצה על דוושת רגל ימין או בחירת רשומה הפקדים על-גבי המסך, כמו הסיבים נע לאט סביב המדגם.הערה: בדרך כלל, וידאו אורך 30 s מספיקים עבור ex-vivo הדמיה על רקמות. נקה בקצה הדיסטלי של סיבים הדמיה FCFM עם עדשה ניקוי רקמות ו- 8% H2O2 בין הדגימות. כיבוי המערכת כבה את הלייזר. על-ידי לחיצה על דוושת רגל שמאל או על-ידי לחיצה כפתור על המסך. נתק סיבים הדמיה FCFM לנקות את המכשיר על-ידי הפעלת ה-hub LSU כסף התרחקותו עד לעצירתו. הסר את FCFM הדמיה סיבים מהרכזת LSU על ידי משיכה עדינה המחבר סיב מ LSU. לנקות ולחטא סיבים הדמיה FCFM עם 8% H2O2 ו עדשה ניקוי רקמות. להחזיר את כובעי מגן סוף סיבים הדמיה FCFM הפרוקסימלית של החלק הקדמי של יחידת LSU. מקום הסיבים בעדינות תיבת אחסון. סגור הנתונים ללכוד התוכנה והעתק קבצים שנשמרו אל התקן USB חיצוני. כבה את המחשב וכבה את המכשיר LSU על ידי לחיצה על הלוח הקדמי קלט/פלט עבור 3 s עד האור הירוק נעלם. תשליך רקמת הריאה האנושי וחיידקים על פי תקנות מקומיות. 3. ניתוח נתונים לפתוח את התוכנה וייבא את הקבצים עבור ניתוח על-ידי בחירת הספריה המתאימה במחשב דרך הסמל ‘ללכת’ על לוח המחוונים בתוכנה. לחלופין, קבצים יכולים להיות הנגררת ומשוחררת לתוך לוח המחוונים בתוכנה. לחץ פעמיים על כל קובץ וידאו כדי לפתוח אותם. קטעי וידאו יופעלו באופן אוטומטי עם טבלת בדיקת מידע צבע ממוטב (LUT) ולהתאים טבלת צבע. בטל את עוצמת אוטומטי שינוי קנה מידה, על ידי לחיצה על לחצן שרביט מעל סרגל קנה מידה בעוצמה. התכונה אינה זמינה כאשר אין צל שחור סביב הלחצן.הערה: שינוי גודל אוטומטי בעוצמה לבטלו כדי למנוע שיפור ניגודיות רציפה לאורך כל וידאו, ואי אפשר להשוות ולנתח את קטעי וידאו מ מאותה ערכת נתונים. בחר את העוצמה הרצויה שינוי גודל על-ידי הזזת פסי מינימום ומקסימום לתת את הניגודיות הטובה ביותר. הכלי היסטוגרמה בעת בחירת עוצמת שינוי קנה מידה כדי להבטיח את הטווח הדינמי הרחב ביותר הוא נתפס.הערה: ודא כי הטווח הדינמי הוא כזה כי התמונות לא רוויים (דהיינו להגביל את האזורים הלבנים של התמונה, אשר מצביעים על רוויה), כך תכונות בעצימות נמוכה הם לא החמיצו. לאחר שינוי הגודל הרצוי השיגה, הימני, לחץ על לחצן התפריט הנפתח מופיע בתור ‘ברירת מחדל (ירוק)’. בחר באפשרות כדי לשמור על פבואר. שמור את LUT במיקום הרצוי. אחד לשני הסרטונים בתוך ערכת הנתונים, להחיל את LUT אותו על ידי לחיצה ימנית על התפריט הנפתח ‘ברירת מחדל (ירוק)’, בחר “טען LUT”. בחר את הקובץ המתאים כדי להחיל בעוצמה עקבי דרוג כל וידאו בתוך dataset. ייצוא וידאו מעובד על-ידי לחיצה על לחצן ‘קטע סרט’. בחר תבנית הווידאו הרצוי, למשל ‘למטרות מצגת’, אשר יהיה לייצר קובץ במקרים רבים. לחצו על ‘ייצוא’ ובחרת מיקום הקובץ כדי לשמור את קובץ הווידאו. ניתן לייצא תמונות של מסגרות יחיד על-ידי לחיצה על לחצן ‘מצלמה’. זה אפשרי לשמור קובץ. png, bmp או. jpg. בחר את מיקום היעד של הקובץ ולחץ על שמור.הערה: סרטונים ואז ניתן לייבא לתוך תוכנה הכנת מצגות או יותר כמת. חיידקים שכותרתו הם דמיינו כנקודות ירוק ‘מהבהב’ וידאו. מבנה רקמת הריאה יהיו לכאורה כמו גדילי פלורסנט מסודרות, עם שטח מכתשי המופיעים שחור.