Optische Überprüfung der neuartige Bakterien-spezifischen Sonden auf Ex Vivo menschlichen Lungengewebe durch konfokale Laser Endomikroskopie
Summary
Dieses Verfahren beschreibt ein effizientes Screening-Verfahren für die Bewertung der Bakterien-spezifische optische Bildgebung Agents in ex Vivo menschlichen Lungengewebe durch geädert konfokale Fluoreszenzmikroskopie für die schnelle Identifizierung von chemischen kleines Molekül Sonde-Kandidaten mit Potenzial übersetzbar.
Abstract
Verbesserung der Geschwindigkeit und Genauigkeit der bakteriellen Erkennung ist wichtig für Patienten Schichtung und die geeignete Verwendung antimikrobieller Mittel sicherzustellen. Zur Erreichung dieses Ziels, die Entwicklung von diagnostischen Techniken, um bakterielle Anwesenheit zu erkennen in Echtzeit am Point-of-Care ist erforderlich. Optische Verfahren zur direkten Identifizierung von Bakterien in den Host ist ein attraktiver Ansatz. Mehrere Versuche, chemische Sonde Design und Validierung wurden untersucht, aber keine noch erfolgreich in der Klinik umgesetzt haben. Hier beschreiben wir eine Methode für die ex-Vivo Validierung von Bakterien-spezifischen Sonden zur Identifizierung von Bakterien innerhalb der distalen Lunge durch geädert konfokale Fluoreszenzmikroskopie (FCFM) abgebildet. Unser Modell verwendet ex Vivo menschlichen Lungengewebe und als klinisch zugelassenen konfokale Laser Endomikroskopie (CLE) Plattform für Bildschirm Roman Bakterien-spezifischen imaging Verbindungen, eng imitiert Image Bedingungen voraussichtlich mit Patienten angetroffen werden. Daher stellt die Abschirmung von Verbindungen durch diese Technik Vertrauen der potenziellen klinischen Lenkbarkeit.
Introduction
Dieses Verfahren beschreibt eine schnelle Screening-Verfahren für die Bewertung der Bakterien-spezifische optische Bildgebung Agents in ex Vivo menschlichen Lungengewebe von CLE mit potenziellen klinischen Nutzens für die Visualisierung von FCFM für die schnelle Identifizierung von Verbindungen Bakterien in der distalen Lunge in Situ.
Es ist eine dringende globale Voraussetzung zu rationieren, antimikrobielle Verschreibung im Zeitalter der steigenden Antibiotikaresistenzen1. Zu diesem Zweck suchte die Entwicklung diagnostischer Methoden welche Akt, bakterielle Infektion mit hoher Spezifität, Sensitivität, und in Echtzeit zu identifizieren sind hoch2. Aktuelle Techniken zur Bestätigung der Diagnose einer Lungenentzündung in kritisch krank Patienten, wie Sie in Intensivstationen (Intensivstationen), verlassen sich oft auf Interpretation von unspezifischen klinischen oder radiologischen Eigenschaften neben Bakterienkultur Techniken aus abgesaugte Flüssigkeiten/Gewebe, die zu Ergebnissen führen bis zu 3 Tage dauern kann. Darüber hinaus Bakterienkultur von Flüssigkeit in die distale Lunge eingeflößt und ist anfällig für Verunreinigungen von mehr proximalen Airways3 und ist oft Kultur negativ durch antimikrobielle Begleittherapie oder schlechte Probenahmetechniken abgerufen. Darüber hinaus sind molekulare Techniken wie Polymerasekettenreaktion überempfindlich auf angesaugten Flüssigkeiten, riskieren Überbehandlung von Patienten verwendet. Ein aufstrebender diagnostischer Ansatz ist molekulare optische Bildgebung machen in Situ molekulare Pathologie der Gewebe eine Möglichkeit; die Entwicklung und Validierung von optischen Bildgebung Verbindungen ist jedoch erforderlich. Dennoch, direkter Visualisierung der Bakterien über aktivierbare Einkoppeloptiken ist potenziell eine sehr leistungsfähige Methode, um die Studie der Präsenz ermöglichen und Entwicklung an einer Lungenentzündung in den Patienten, und wichtiger, könnte verwendet werden, um Wirt-Pathogen Interaktionen in der Studie als Reaktion auf Therapien in Echtzeit- in-situ.
CLE ist ein etabliertes investigative Verfahren in mehreren Krankheiten4, auch in den Bereichen Gastroenterologie5, Onkologie6,7, sowie für Abfragen Airways und alveoläre Sacs8, 9. ermöglicht es Point-of-Care strukturelle Bildgebung von erkranktem Gewebe mit einer Faser imaging-Bundle, das durch den Arbeitskanal eines klinischen Endoskopes geht und Formen direkter Kontakt mit der Gewebeoberfläche, konfokale Mikroskopie abgebildet werden. Eine Einschränkung, die bleibt ist jedoch die Notwendigkeit einer generischen Kontrastmitteln. Daher könnte die Verwendung von Krankheit spezifischen Sonden, wie bestimmte Bakterien Agents, das Dienstprogramm dieser Modalität erheblich ausweiten, indem direkt visualisiert Bakterien am Ort der vermuteten Infektion. Optische Agenten bieten viele Vorteile gegenüber anderen Techniken, indem Sie in Echtzeit, hochauflösende Bildgebung mit diagnostische Potenzial aktivieren. Darüber hinaus bieten optische Sonden die Perspektive von multiplexing für Verhören mehrere Ziele, alles auf einem relativ niedrigen Kosten erreicht. Eine Reihe von optischen Agenten sind in der Entwicklung für einen solchen Zweck aber keiner noch innerhalb der Klinik10erfolgreich umgesetzt worden sind. Wir haben eine Bibliothek von niedermolekulare chemische Sonden mit Spezifität gegenüber Bakterien synthetisiert und eine schnelle, effektive Pipeline für die Bewertung der Probe-Funktion zur Erkennung von bakteriellen Pneumonie in Situ11entwickelt.
Um geeignete Sonde Kandidaten zu identifizieren, die folgenden Voraussetzungen mussten vor dem Verhör der Sonde auf ex Vivo menschlichen Lungengewebe von FCFM erfüllt werden: (i) wässrige Löslichkeit, Ii) Spezifität und Selektivität für die Beschriftung schnell klinisch relevanten Bakterien, Iii) ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis und iv) Widerstand zu einer Verschlechterung in der Lunge-Umgebung. Letzteres wurde alvéolaire Lavage Fluid (BALF) anhand von Patienten mit akutem Atemnotsyndrom (ARDS), das ist eine Bedingung, die durch proteolytische und entzündlichen Umgebungen in der Lunge auf der Intensivstation auszeichnet. Darüber hinaus mussten die Sonden einen geeigneten Fluorophor für Erkennung durch ein klinisch zugelassenen optischen CLE imaging-Gerät innerhalb von menschlichen alveoläre Lungengewebe.
Die Pipeline, jede dieser Voraussetzungen zu befragen wurde wie folgt (in jeder Phase nur Sonden, die übergeben wurden vorgetragen zum nächsten): (1) eine Bibliothek mit Sonden zu untersuchenden wurde synthetisiert; (2) jede Sonde wurde ein Panel lebender Bakterien für konfokale Laser-scanning-Mikroskopie (CLSM) um zu gewährleisten, bakterielle Kennzeichnung hinzugefügt; (3) die Selektivität der bakterielle Kennzeichnung in Säugetierzellen in Ko-Kulturen mit primären menschlichen Neutrophilen gründete CLSM; (4) Stabilität und erfolgreiche Kennzeichnung von Bakterien im Beisein des ARDS-Patienten BALF wurde durch CLSM und Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisierung-Zeit des Fluges (MALDI-TOF) Mass Spectrometry bestimmt; (5) optimale Konzentration der Kandidaten wurden ermittelt, indem CLSM, Gewährleistung Selektivität für Bakterien in Säugetierzellen wurde beibehalten; (6) Kandidaten wurden von FCFM abgebildet, in der Schwebe und auf ex Vivo menschlichen alveoläre Lungengewebe, Stabilität und das gewährleisten der Signal-Rausch-war ausreichend für den Nachweis. Schritt 6 ist innerhalb dieses Protokoll ausführlich beschrieben. Methodik für die Schritte 1 bis 5 wurde bereits berichtet11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Infektionen der unteren Atemwege entfallen die zweite höchste Krankheitslast weltweit12,13, und ein wesentlicher Anstieg der Zahl der Infektionen antimikrobiell resistenter Bakterien zugeschrieben gemeldeten14wurde. Lungenentzündung ist eine häufige Ursache für Krankenhausaufenthalte. Auf der Intensivstation die Entwicklung einer Lungenentzündung wird durch diagnostische Unsicherheit verstärkt und eine extrem hohe Sterblichkeit Rate15zugeordnet ist. Während der Beginn der Pneumonie vermehren sich Bakterien alveoläre innerhalb der distalen Lunge, ein Gebiet, das relativ steril, mit minimalen Mikrobiota in Gesundheit.
Diese Methode beschreibt relativ späten Stadium ex Vivo Validierung von Bakterien-spezifische optische bildgebende Sonden11, aber das Design, Synthese und Sonde Bewertung vor Beginn dieser Überprüfungsschritt ist zwingend erforderlich, als bisher gezeigte11 .
CLE ist eine aufstrebende klinische Technik für Verhören Krankheit in Situ in Echtzeit. Es bietet viele Vorteile gegenüber traditionellen Techniken für die Untersuchung von mutmaßlichen pulmonale Pathologie, die eine Biopsie und Ansammlung der Lavage-Flüssigkeit mit einbeziehen kann. Biopsien sind invasiv und Morbidität und Mortalität bei beatmeten Patienten verursachen können, und gesammelten Lavage-Flüssigkeit ist oft verseucht mit Bakterien aus den oberen Atemwegen. Die Verwendung von CLE bei der Erfassung der Lungenentzündung ist allerdings etwas begrenzt verfügbar, wegen der schlechten Verfügbarkeit von kompatiblen Bildgebung Sonden die Krankheit trotz viele gemeinsame Anstrengungen10funktionelle informieren kann. Kombination von CLE mit optischen Mitteln bietet die Aussicht auf eine Diagnose von Pneumonie schneller und weniger invasiv im Vergleich zu aktuellen gängige Praxis.
Die entscheidenden Schritte zu diesem Protokoll sind in die Vorbereitung der Probe und das Setup der CLE-Plattform. Erlangung von menschlichem Gewebe für die endgültige klinische Anwendung relevant ist auch wichtig, wie menschliche Lungengewebe wie im Rahmen dieser Studie gezeigt. Es ist notwendig, menschliches Gewebe zu verwenden, weil das Ausmaß der Gewebe Autofluoreszenz große Inter-Spezies-Variation zeigt, und kann daher in die Irre führen die Empfindlichkeit der Bakterien-Sonde wird abgebildet. Darüber hinaus ist es wichtig, Ethik für Abruf und Nutzung von menschlichen Lungengewebe zu erhalten. Aus einer technischen Ebene, korrekte Reinigung ist die Befestigung der bildgebenden Faser an der LSU Bildgebungsplattform und Kalibrierung wichtig für gute Auflösung und konsequente Bildgebung, da sichergestellt ist, dass jede Lunge Gewebeprobe gleichwertigen Anzahl von Bakterien hinzugefügt werden. Um das Dienstprogramm dieser Methode für das screening von Platten der Sonden zu erweitern, ist es notwendig, wiederholen das Verfahren mit einer Reihe von Krankheitserregern, wie die Erreger von Lungenentzündung voraussichtlich.
Die größte Einschränkung dieser Technik ist, dass die klinisch zugelassene CLE-Gerät nur einen Laser hat (488 nm). Daher beschränkt sich derzeit, die Auswahl der Fluorophor für Sonde Design für den Einsatz mit diesem System, obwohl klinisch Einzelfarbe zugelassen, was mit Erregung Wellenlängen von 660 nm und Nah-Infrarot-Geräte vorhanden sind. Es ist höchst wünschenswert, eine zweite Laserlinie innerhalb des gleichen Gerätes ermöglichen eine Sonde mit einem spektral unterschiedliche Fluorophor Verbesserung der Empfindlichkeit der Bakterien-Sonde über die Höhe der Gewebe Autofluoreszenz entwickelt werden umgesetzt haben. Während zwei-Farben-CLE-Geräte in der Entwicklungsphase befinden, sie sind entweder nicht klinisch zugelassen und/oder ihre Kosten sind bedeutende16.
CLE in Vitro mit pathogenen Bakterien und ex Vivo menschlichen Lungengewebe zu potenziellen Sonden Bildschirm schließt die Lücke zwischen herkömmlichen in-vitro- Techniken wie Durchflusszytometrie und CLSM und klinischen Nutzen. Dieser Schritt bietet Vertrauen bei der Auswahl der vielversprechender Verbindungen, voranzutreiben, um Verbindung mit klinischen CLE imaging; und geben Hinweis darauf, ob die getestete Sonde unterhält Ziel Spezifität oder zeigt Ziel-Kennzeichnung, z. B. Bindung direkt an Gewebe, oder zeigt Instabilität mit proteolytische Enzymen. Es wäre auch für jede der aktivierbare Sonden direkt Proben menschlichen Lungengewebe sowie Bakterien, zur vollständigen Charakterisierung die Geschwindigkeit der Sonde Bindung und Aktivierung in Echtzeit hinzufügen.
Wir glauben, dass unsere Pipeline für das screening von rasch neue Bakterien-spezifischen Sonden um ihr Potenzial für die Bildgebung in der distalen Lunge des Patienten beurteilen viel schneller Übersetzung in die Klinik führt. Dies ist vor allem, weil die Bakterien-spezifischen Sonde innerhalb der Lunge durch Katheter nach unten den Arbeitskanal des ein Bronchoskop, was bedeutet, dass Microdose lokal zugestellt werden konnte (< 100 µg) Mengen geliefert werden könnte. Daher ist systemische Liefer- und Bioverteilung der Verbindung kein Anliegen, wie für viele andere Ziele Infektion innerhalb des Körpers oder mit nuklearen Bildgebung der Fall ist. Darüber hinaus liefert die bildgebende Sonde in eine kleine Dosis verringert das Risiko von Toxizität im Zusammenhang mit Komplikationen (obwohl Toxizität Screening für Übersetzung erforderlich wäre). Nach Instillation von der Sonde könnte der Katheter dann ersetzt werden, von FCFM Faser und der gleichen Region der Lunge verhört von CLE, viel die gleiche Weise, die wir innerhalb dieser Methode ausgeführt haben. Bildgebung sollte schnell nach Einbau der Sonde, bevor die Sonde nicht nachweisbare Konzentrationen wäscht durchgeführt werden.
Es ist auch wichtig zu beachten, dass Screening der Identifizierung von Krankheiten Sonden durch diese Technik sollte nicht auf bakterielle-Bildgebung Agenten beschränkt sein, sondern könnte erstreckt sich auch auf die Validierung der Sonden mit alternative Ziele, wie z. B. Entzündung. Dieser Ansatz muss auch an andernorts Krankheit innerhalb des Körpers angepasst werden wo Bildgebung über FCFM zulässig ist.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten danken Engineering und interdisziplinären Forschungszusammenarbeit Physical Sciences Research Council (EPSRC, Vereinigtes Königreich) Zuschuss EP/K03197X/1, das Department of Health und Wellcome Trust durch Health Innovation Challenge Fund (HICF) . Finanzierung Referenznummer: 0510-069.
Materials
| 1-14 Microfuge | SciQuip | 90616 | Small benchtop microcentrifuge |
| 96-well plate | Corning | 3370 | Assay plate |
| Calcein AM | Sigma Aldrich | 17783 | Commercial fluorescent dye |
| Cellvizio 488 nm Research CLE | Mauna Kea Technologies | LC-0001-488 | Confocal laser endomicroscopy device |
| Cletop-S | Cletop | 14110601 | Fibre cleaner |
| Eppendorf (1.5 mL) | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microfuge tube |
| Eppendorf Research Plus Pipettes | Fisher Scientific | 11568663 | Micro pipettes |
| Falcon tube (50 mL) | Scientific Lab Supplies | 352070 | 50 ml centrifugation tube |
| Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PBS – wash media |
| IC-Viewer | Mauna Kea Technologies | LW-0001 | Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system |
| Incu-Shake midi | Sciquip | SQ-4020 | Floor standing shaking incubator |
| Lysogeny Broth | Sigma Aldrich (Miller) | L3522 | LB Growth media for S. aureus |
| non-standard research AlveoFlex 488 nm | Mauna Kea Technologies | MP-0002-AF3 | Fibred confocal fluorescence microscopy fibre |
| Quanti Kit 488 nm | Mauna Kea Technologies | LQ-0005 | Calibration kit for the CellVizio 488 system |
| S. aureus ATCC 25923 | ATCC | 25923 | Bacterial strain used in this study |
| Semi-micro spectrophotometry cuvette | Sigma Aldrich | C5416-100EA | For spectrophotometry |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 41102422 | Benchtop heater with shaking |
| UV 1101 Biotech photometer | Biochrom WPA | Spectrophotometer |
References
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