Optische Screening van nieuwe bacteriën-specifieke sondes op Ex Vivo menselijke longweefsel door Confocale Laser Endomicroscopy
Summary
Deze techniek beschrijft een efficiënte screeningsproces voor de evaluatie van de bacteriën-specifieke optische beeldvorming agenten binnen ex vivo menselijke longweefsel, door fibered confocal fluorescentie microscopie voor de snelle identificatie van klein molecuul chemische sonde-kandidaten met vertaalbare potentieel.
Abstract
Verbetering van de snelheid en nauwkeurigheid van de detectie van bacteriële is belangrijk voor de patiënt stratificatie en om het juiste gebruik van antimicrobiële stoffen. Om dit te bereiken, de ontwikkeling van diagnostische technieken om te herkennen van de bacteriële aanwezigheid in real-time op de point-of-care is vereist. Optische beeldvorming voor directe identificatie van bacteriën binnen de host is een aantrekkelijke aanpak. Verschillende pogingen om chemische sonde ontwerp en validatie zijn onderzocht, echter geen zijn nog met succes vertaald in de kliniek. Hier beschrijven we een methode voor ex vivo validatie van bacteriën-specifieke sondes voor de identificatie van bacteriën in de distale Long, beeld door fibered confocal fluorescentie microscopie (FCFM). Ons model gebruikt ex vivo menselijke longweefsel en een klinisch goedgekeurde confocale laser endomicroscopy (CLE) platform scherm roman bacteriën-specifieke imaging verbindingen, nauw nabootsen imaging voorwaarden moeten worden geconfronteerd met patiënten. Daarom biedt screenen verbindingen door deze techniek vertrouwen van potentiële klinische werkwillig.
Introduction
Deze techniek beschrijft een snelle screening-proces voor de evaluatie van de bacteriën-specifieke optische beeldvorming agenten binnen ex vivo menselijke longweefsel door gebruik van FCFM voor de snelle identificatie van stoffen met mogelijke klinische nut voor het visualiseren van CLE bacteriën in de distale longkanker in situ.
Er is een dringende globale vereiste om rantsoen antimicrobiële voorschrijven in het tijdperk van stijgende antimicrobiële resistentie1. Te dien einde getracht de ontwikkeling van diagnostische methoden welke handeling voor de identificatie van bacteriële infectie met hoge specificiteit, gevoeligheid, en in real time zijn in hoge mate2. Huidige technieken ter bevestiging van een diagnose van longontsteking bij kritisch onwel patiënten, zoals die binnen de intensive care units (IC’s), afhankelijk vaak van de interpretatie van de aspecifieke klinische en radiologische kenmerken naast bacteriecultuur technieken uit aanzuiging vloeistoffen/weefsels, die kan tot 3 dagen tot resultaten leidt. Bovendien bacteriecultuur aan de vloeistof die de distale Long ingeprent en opgehaald is gevoelig voor besmetting van meer proximale airways3 en vaak cultuur negatief is als gevolg van gelijktijdige antimicrobiële therapie of slechte bemonsteringstechnieken. Daarnaast zijn moleculaire technieken zoals polymerase-kettingreactie overdreven gevoelig wanneer gebruikt op aanzuiging vloeistoffen, riskeren overtreatment van patiënten. Een opkomende diagnostische aanpak is moleculaire optische beeldvorming, maken in situ moleculaire pathologie van weefsels een mogelijkheid; de ontwikkeling en validering van optische beeldvorming verbindingen is echter vereist. Toch directe visualisatie van bacteriën, via gevechts optische sondes is in potentie een zeer krachtige methode om de studie van de aanwezigheid en evolutie van longontsteking in de patiënt, en belangrijker, kan worden gebruikt om te studeren gastheer-pathogeen interacties in reactie op therapieën in real-time in situ.
CLE is een gevestigde investigative procedure in meerdere ziekten4, met inbegrip van binnen het gebied van gastro-enterologie5, oncologie6,7, en voor de raadpleging van de luchtwegen en alveolaire zakjes8, 9. het point-of-care structurele beeldvorming van zieke weefsel met behulp van een vezel imaging bundel, die op zijn beurt via het kanaal van de werken van een klinische endoscoop stelt en formulieren rechtstreeks contact met het oppervlak van het weefsel te worden beeld door confocale microscopie. Een beperking die blijft echter de noodzaak van generieke contrastmiddelen. Daarom kan het gebruik van ziekte specifieke sondes, zoals specifieke bacteriële agenten, enorm uitbreiden van het nut van deze modaliteit door direct visualiseren bacteriën op de site van vermoede infectie. Optische agenten bieden vele voordelen ten opzichte van andere technieken doordat real-time, hoge resolutie beeldvorming met diagnostische mogelijkheden. Bovendien is optische sondes bieden het vooruitzicht van multiplex voor de raadpleging van meerdere doelen, allemaal bereikt tegen een relatief lage prijs. Een aantal optische agenten zijn in ontwikkeling voor dergelijke doeleinden, maar geen nog met succes doorgevoerd binnen de kliniek10. Wij hebben een bibliotheek van klein molecuul chemische sondes gesynthetiseerd met specificiteit naar bacteriën en een snelle, effectieve pijpleiding voor evaluatie van de sonde functie voor het detecteren van bacteriële longontsteking in situ11ontwikkeld.
Ter identificatie van geschikte sonde kandidaten, moest de volgende vereisten worden voldaan vóór de ondervraging van de sonde op ex vivo menselijke longweefsel door FCFM: i) waterige oplosbaarheid, ii) specificiteit en selectiviteit voor het labelen van snel klinisch relevante bacteriën, iii) een hoge signaal-ruisverhouding, en iv) weerstand tegen afbraak binnen de omgeving van Long. De laatste werd beoordeeld door bronchoalveolar lavage vloeistof (BALF) van patiënten met acute respiratory distress syndrome (ARDS), die is een aandoening die wordt gekenmerkt door Proteolytische en inflammatoire omgevingen in de longen in de ICU. Bovendien moest de sondes hebben een geschikte fluorophore voor detectie door een klinisch goedgekeurde optische CLE beeldapparaat binnen alveolaire menselijke longweefsel.
De pijpleiding naar het ondervragen van elk van deze voorwaarden was als volgt (in elke fase, alleen de sondes die doorgegeven werden overgedragen naar de volgende): (1) een bibliotheek van sondes worden onderzocht werd gesynthetiseerd; (2) elke sonde is toegevoegd aan een panel van levende bacteriën voor confocale laser scanning microscopie (CLSM) om ervoor te zorgen dat bacteriële etikettering; (3) selectiviteit van bacteriële labeling over zoogdiercellen in co culturen met primaire menselijke neutrofielen werd opgericht door CLSM; (4) stabiliteit en succesvolle labeling van bacteriën in aanwezigheid van de patiënt ARDS BALF werd bepaald door CLSM en Matrix bijgestaan Laser desorptie/ionisatie-tijd van de Spectrometrie van de massa van de vlucht (MALDI-TOF); (5) de optimale concentratie van kandidaten werd bepaald door CLSM, selectiviteit zorgen voor bacteriën over zoogdiercellen werd gehandhaafd; (6) kandidaten waren beeld door FCFM in suspensie en op ex vivo menselijke alveolaire longweefsel om stabiliteit en dat de signal-to-noise volstond voor detectie. Stap 6 is beschreven in detail binnen dit protocol. Methodologie voor stappen 1-5 al eerder gemeld11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Infecties van de lagere luchtwegen rekening voor de tweede hoogste ziektelast wereldwijd12,13, en een aanzienlijke stijging van het aantal van infecties toegeschreven aan antimicrobiële resistente bacteriën geweest gerapporteerde14. Longontsteking blijft een veel voorkomende oorzaak voor hospitalisatie. In de ICU, de ontwikkeling van een longontsteking wordt verergerd door diagnostische onzekerheid en wordt geassocieerd met een zeer hoge sterfte tarief15. Tijdens het begin van longontsteking vermenigvuldigen de bacteriën binnen de alveolaire ruimte van de distale Long, een gebied dat is relatief steriel, met minimale microbiota in gezondheid.
Deze methode beschrijft relatief late stadium ex vivo validatie van bacteriën-specifieke optische beeldvorming sondes11, maar het ontwerp, de synthese en evaluatie van de sonde voorafgaand aan het begin van deze stap van de validatie is absoluut noodzakelijk, als eerder is laten zien11 .
CLE is een opkomende klinische techniek voor het ondervragen van ziekte verklaart in situ in real-time. Het biedt vele voordelen ten opzichte van traditionele technieken voor het onderzoeken van verdachte pulmonaire pathologie, die een biopsie en de collectie van de lavage vloeistof kan veroorzaken. Biopsieën zijn invasief en morbiditeit en mortaliteit bij geventileerde patiënten kunnen veroorzaken, en verzamelde lavage vloeistof is vaak besmet met bacteriën uit de bovenste luchtwegen. Het gebruik van CLE in de opsporing van longontsteking is echter enigszins beperkt door de slechte beschikbaarheid van compatibele imaging sondes die functionele informatie van ziekte, ondanks veel gezamenlijke inspanningen10kan bieden. CLE combineren met optische agenten biedt het vooruitzicht van de diagnose longontsteking sneller en minder gebeurt vergeleken met de huidige standaard praktijk.
De kritische stappen bij dit protocol zijn in de bereiding van de monsters en de installatie van de CLE-platform. Verkrijgen van menselijke weefsels die relevant zijn voor het uiteindelijke klinische toepassing is ook belangrijk, zoals menselijke longweefsel zoals aangetoond in deze studie. Het is noodzakelijk om het gebruik van menselijk weefsel, omdat de omvang van weefsel autofluorescence grote variatie tussen soorten toont, en kan daarom het misleiden van de gevoeligheid van de bacteriën-sonde image wordt gemaakt. Bovendien, het verkrijgen van ethiek voor ophalen en het gebruik van menselijke longweefsel is essentieel. Bij een technische niveau, juiste reiniging is bevestiging van de beeldvorming vezel aan de beeldvorming LSU platform, en de kalibratie essentieel voor goede resolutie en consequente beeldvorming, zoals is het waarborgen van gelijke aantallen bacteriën worden toegevoegd aan elk monster Long weefsel. Om verdere uitbreiding van het nut van deze methode voor het screenen van de panelen van sondes, is het noodzakelijk het procédé met allerlei ziekteverwekkers, zoals die kunnen worden van de causatieve agenten van longontsteking.
De grootste beperking van deze techniek is dat het klinisch goedgekeurde CLE apparaat slechts één laser heeft (488 nm). Dus, de selectie van fluorophore voor sonde ontwerp is momenteel beperkt voor gebruik met dit systeem, hoewel klinisch goedgekeurd één kleur apparaten bestaan met excitatie golflengten van 660 nm en nabij-infrarood. Het is zeer wenselijk dat een tweede laser regel uitgevoerd binnen hetzelfde apparaat om een sonde met een spectraal verschillende fluorophore om de gevoeligheid van bacteriën-sonde over het niveau van weefsel autofluorescence worden ontwikkeld. Terwijl dual-kleur CLE apparaten onder ontwikkeling zijn, ze zijn ofwel niet klinisch goedgekeurd en/of hun kosten is aanzienlijke16.
Overbrugt de kloof tussen conventionele in vitro technieken zoals stroom cytometry en CLSM, en klinische nut CLE in vitro met behulp van pathogene bacteriën en ex vivo menselijke longweefsel te scherm potentiële sondes. Deze stap biedt vertrouwen bij het selecteren van veelbelovende verbindingen voort te zetten om te worden gecombineerd met klinisch CLE imaging; en geeft een indicatie of de geteste sonde onderhoudt doel specificiteit, toont af-target labelen, zoals binding rechtstreeks aan weefsel, of toont instabiliteit met host Proteolytische enzymen. Het zou ook relevant zijn voor elk van de gevechts sondes rechtstreeks toevoegen aan monsters van menselijke longweefsel plus bacteriën, de snelheid van de sonde bindende en activering in real-time volledig te karakteriseren.
Wij zijn van mening dat onze pijpleiding voor het snel screenen nieuwe bacteriën-specifieke sondes voor de beoordeling van hun potentieel voor imaging binnen de distale Long van patiënten in veel sneller vertaling naar de kliniek resulteren zal. Dit is grotendeels omdat de bacteriën-specifieke sonde kan lokaal worden afgeleverd binnen de longen via een katheter ingevoegd neer het kanaal van de werken van een bronchoscope, wat betekent dat microdose (< 100 µg) bedragen kunnen worden geleverd. Daarom, systemische leverings- en ook van de stof is niet een punt van zorg, zoals het geval is voor vele andere infectie doelen binnen het lichaam, of met nucleaire beeldvorming. Bovendien leveren de imaging sonde in zo'n een kleine dosis vermindert het risico van toxiciteit gerelateerde complicaties (hoewel toxiciteit screening voor vertaling nodig zijn zou). Na toediening van de sonde, de katheter kan vervolgens worden vervangen door de FCFM vezel en dezelfde regio van de Long ondervraagd door CLE, veel de zelfde manier wij hebben uitgevoerd binnen deze methode. Imaging moet snel na de installatie van de sonde voordat de sonde undetectable concentraties wegspoelt worden uitgevoerd.
Het is ook belangrijk op te merken dat screening van ziekte-identificerende sondes door deze techniek moet niet beperkt blijven tot bacteriële-imaging agenten, maar kan zich ook uitstrekken tot de validatie van sondes met alternatieve doelen, zoals ontsteking. Deze aanpak moet ook worden aangepast naar andere locaties van de ziekte in het lichaam waar imaging via FCFM toegestaan is.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zouden graag willen bedanken Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC, Verenigd Koninkrijk) interdisciplinaire samenwerking op onderzoeksgebied subsidie EP/K03197X/1, het ministerie van volksgezondheid en de Wellcome Trust via de gezondheid innovatie Challenge Fund (HICF) . Financiering referentienummer: 0510-069.
Materials
| 1-14 Microfuge | SciQuip | 90616 | Small benchtop microcentrifuge |
| 96-well plate | Corning | 3370 | Assay plate |
| Calcein AM | Sigma Aldrich | 17783 | Commercial fluorescent dye |
| Cellvizio 488 nm Research CLE | Mauna Kea Technologies | LC-0001-488 | Confocal laser endomicroscopy device |
| Cletop-S | Cletop | 14110601 | Fibre cleaner |
| Eppendorf (1.5 mL) | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microfuge tube |
| Eppendorf Research Plus Pipettes | Fisher Scientific | 11568663 | Micro pipettes |
| Falcon tube (50 mL) | Scientific Lab Supplies | 352070 | 50 ml centrifugation tube |
| Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PBS – wash media |
| IC-Viewer | Mauna Kea Technologies | LW-0001 | Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system |
| Incu-Shake midi | Sciquip | SQ-4020 | Floor standing shaking incubator |
| Lysogeny Broth | Sigma Aldrich (Miller) | L3522 | LB Growth media for S. aureus |
| non-standard research AlveoFlex 488 nm | Mauna Kea Technologies | MP-0002-AF3 | Fibred confocal fluorescence microscopy fibre |
| Quanti Kit 488 nm | Mauna Kea Technologies | LQ-0005 | Calibration kit for the CellVizio 488 system |
| S. aureus ATCC 25923 | ATCC | 25923 | Bacterial strain used in this study |
| Semi-micro spectrophotometry cuvette | Sigma Aldrich | C5416-100EA | For spectrophotometry |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 41102422 | Benchtop heater with shaking |
| UV 1101 Biotech photometer | Biochrom WPA | Spectrophotometer |
References
- Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. London: H M Government/Wellcome Trust Available from: https://amr-review.org/sites/default/files/160518_Final%20paper_with%20cover.pdf (2016)
- Caliendo, A. M., et al. Better Tests, Better Care: Improved Diagnostics for Infectious Diseases. Clin. Infect. Dis. 57, 139-170 (2013).
- Zumla, A., et al. Rapid point of care diagnostic tests for viral and bacterial respiratory tract infections-needs, advances, and future prospects. Lancet Infect. Dis. 14 (11), 1123-1135 (2014).
- Neumann, H., Kiesslich, R. . Yamada’s Textbook of Gastroent. , 2944-2949 (2015).
- Chauhan, S. S., et al. Confocal laser endomicroscopy. Gastrointest Endosc. 80 (6), 928-938 (2014).
- Goetz, M., Malek, N. P., Kiesslich, R. Microscopic imaging in endoscopy: endomicroscopy and endocytoscopy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11 (1), 11-18 (2014).
- Abbaci, M., et al. Confocal laser endomicroscopy for non-invasive head and neck cancer imaging: A comprehensive review. Oral Oncol. 50 (8), 711-716 (2014).
- Thiberville, L., et al. Human in vivo fluorescence microimaging of the alveolar ducts and sacs during bronchoscopy. Eur Respir J. 33, (2009).
- Thiberville, L., et al. Confocal fluorescence endomicroscopy of the human airways. Proc Am Thorac Soc. 6 (5), 444-449 (2009).
- Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical imaging of bacterial infections. Clin. Transl. Imaging. 4 (3), 163-174 (2016).
- Akram, A. R., et al. A labelled-ubiquicidin antimicrobial peptide for immediate in situ optical detection of live bacteria in human alveolar lung tissue. Chem. Sci. 6 (12), 6971-6979 (2015).
- Dickson, R. P., Erb-Downward, J. R., Huffnagle, G. B. Towards an ecology of the lung: new conceptual models of pulmonary microbiology and pneumonia pathogenesis. Lancet Respir Med. 2 (3), 238-246 (2014).
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Magiorakos, A. P., et al. The rise of carbapenem resistance in Europe: just the tip of the iceberg. Antimicrob Resist Infect Control. 2 (1), 6 (2013).
- Chastre, J., Fagon, J. -. Y. Ventilator-associated Pneumonia. Am. J. Respir Crit Care Med. 165 (7), 867-903 (2002).
- Krstajić, N., et al. Two-color widefield fluorescence microendoscopy enables multiplexed molecular imaging in the alveolar space of human lung tissue. J Biomed Opt. 21 (4), 046009-046009 (2016).
