تحقيقات الفحص البصري للرواية الخاصة بالبكتيريا في أنسجة الرئة البشرية السابقين فيفو بالليزر [كنفوكل] اندوميكروسكوبي
Summary
يصف هذا الأسلوب عملية فحص كفاءة لتقييم عوامل التصوير الضوئية الخاصة بالبكتيريا داخل السابقين فيفو أنسجة الرئة البشرية، بالأسفار [كنفوكل] فيبيريد المجهري للتعرف السريع على جزيء صغير الكيميائية المرشحين التحقيق مع احتمال قابل للترجمة.
Abstract
تحسين سرعة ودقة الكشف عن البكتيرية مهم للمريض التقسيم الطبقي وضمان الاستخدام المناسب لمضادات الميكروبات. ولتحقيق هذا الهدف، على تطوير تقنيات التشخيص الاعتراف بوجود البكتيريا في الوقت الحقيقي في النقطة من الرعاية مطلوب. التصوير الضوئي للتعرف مباشرة على البكتيريا داخل البلد المضيف نهج جذابة. قد حقق عدة محاولات لتصميم المسبار الكيميائية والتحقق من الصحة، ولكن لا شيء بعد بنجاح ترجمت إلى العيادة. هنا يمكننا وصف أسلوب المصادقة السابقين فيفو التحقيقات الخاصة بالبكتيريا للتعرف على البكتيريا داخل الرئة القاصي، تصويرها بالمجهر الأسفار [كنفوكل] فيبيريد (فكفم). استخدام نموذجنا السابقين فيفو أنسجة الرئة البشرية ومنصة اندوميكروسكوبي (كلي) ليزر [كنفوكل] سريرياً معتمدة على الشاشة رواية البكتيريا الخاصة بتصوير المركبات، محاكاة ظروف التصوير ومن المتوقع أن تكون المواجهة مع المرضى عن كثب. ولذلك، وفحص المركبات بهذا الأسلوب يوفر الثقة للمقاييس السريرية المحتملة.
Introduction
يصف هذا الأسلوب عملية فرز سريع لتقييم عوامل التصوير الضوئية الخاصة بالبكتيريا داخل السابقين فيفو أنسجة الرئة البشرية باستخدام فكفم لتحديد سرعة المركبات مع الفائدة السريرية المحتملة لتصور كلي بكتيريا في الرئة القاصي في الموقع.
هناك مطلب عالمي ملح الحصص التموينية التي تفرض مضادات الميكروبات في عصر تزايد مقاومة مضادات الميكروبات1. وتحقيقا لهذه الغاية، سعت تطوير أساليب التشخيص التي تعمل على تحديد العدوى البكتيرية مع عالية الدقة، حساسية، وفي الوقت الحقيقي الغاية2. التقنيات الحالية تأكيد تشخيص الالتهاب الرئوي في المرضى توعك خطيرة، مثل تلك التي تدخل في وحدات العناية المركزة (تعد)، غالباً ما تعتمد على تفسير غير محددة الملامح السريرية أو الإشعاعية جنبا إلى جنب مع تقنيات الاستزراع البكتيري من يستنشق السوائل/الأنسجة، والتي يمكن أن تصل إلى 3 أيام تسفر عن نتائج. وعلاوة على ذلك، ثقافة البكتيرية من السوائل تغرس في الرئة القاصي واسترداد معرضة للتلوث من الدانية أكثر الخطوط الجوية3 وغالباً ثقافة سلبية بسبب ما يصاحب ذلك العلاج بمضادات الميكروبات أو تقنيات أخذ العينات الفقراء. بالإضافة إلى ذلك، التقنيات الجزيئية مثل البلمرة المتسلسل حساسية مفرطة عندما يستخدم في سوائل يستنشق والمخاطرة أوفيرتريتمينت مرضى. نهج تشخيص ناشئة هو التصوير الضوئية الجزيئية، مما يجعل في الموقع الباثولوجيا الجزيئية للأنسجة احتمال؛ ومع ذلك، تطوير والتحقق من صحة من مركبات التصوير الضوئي مطلوب. ومع ذلك، التصور مباشرة للبكتيريا، عن طريق المجسات الضوئية أكتيفاتابل يحتمل أن تكون وسيلة قوية جداً للسماح لهذه الدراسة على وجود وتطور مرض الالتهاب الرئوي في المريض، والأهم من ذلك، يمكن استخدامها لدراسة التفاعلات بين المضيف الممرض في واستجابة للعلاج في الوقت الحقيقي في الموقع.
كلي إجراء تحقيق المتبعة في العديد من الأمراض4، بما في ذلك داخل مجالات أمراض الجهاز الهضمي5،6،الأورام7، واستجواب الخطوط الجوية والأكياس السنخية8، 9-فإنه يمكن تصوير نقطة الرعاية الهيكلية من الأنسجة المريضة باستخدام ألياف بصرية التصوير حزمة، الذي يمر من خلال قناة العامل المنظار السريرية وأشكال الاتصال مع سطح النسيج تصويرها بالفحص المجهري [كنفوكل] المباشر. غير حد واحد أن تظل الحاجة إلى عوامل التباين عامة. ولذلك، استخدام المسابير أمراض محددة، مثل عوامل بكتيرية معينة، يمكن إلى حد كبير توسيع الأداة المساعدة هذه الطريقة بمباشرة تصور البكتيريا في موقع الإصابة المشتبه فيها. وكلاء البصرية توفر مزايا عديدة أكثر من غيرها من التقنيات عن طريق تمكين التصوير في الوقت الحقيقي، وارتفاع القرار مع إمكانية التشخيص. وعلاوة على ذلك، توفر المسابر الضوئية إمكانية الإرسال المتعدد لاستجواب أهداف متعددة، حققت جميع بتكلفة منخفضة نسبيا. عدد من وكلاء الضوئية قيد التطوير لهذا غرض، ولكن بلا لها لم تنفذ بنجاح داخل عيادة10. لدينا تجميع مكتبة مجسات الكيميائية جزيء صغير مع خصوصية تجاه البكتيريا ووضع خط أنابيب سريعة وفعالة لتقييم وظيفة التحقيق للكشف عن الالتهاب الرئوي البكتيري في الموقع11.
لتحديد المرشحين التحقيق المناسبة، قد المتطلبات التالية قبل الاستجواب للتحقيق في السابقين فيفو أنسجة الرئة البشرية بواسطة فكفم: القابلية للذوبان في ط) مائي والثاني) خصوصية والانتقائية لسرعة وضع العلامات سريرياً البكتيريا ذات الصلة، وثالثاً) ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء، ورابعاً) مقاومة للتحلل داخل بيئة الرئة. هذا الأخير كان بتقييم للفيسيولوجيا الغسل السائل (بالف) من المرضى الذين يعانون من متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (اردز)، الذي هو شرط أن تتسم ببيئات proteolytic والتهاب في الرئة في وحدة العناية المركزة. وعلاوة على ذلك، كان التحقيقات لمن فلوروفوري مناسبة للكشف عن طريق جهاز كلي تصوير ضوئي سريرياً معتمدة داخل أنسجة الرئة البشرية السنخية.
خط أنابيب لاستجواب كل من هذه المتطلبات على النحو التالي (في كل مرحلة، إلا المسابير التي مرت رحلت إلى التالي): (1) تم تصنيعه مكتبة المسابر يتعين التحقيق فيها؛ (2) كل مسبار تمت إضافة إلى فريق بكتيريا الحية لليزر [كنفوكل] الفحص المجهري (كلسم) لضمان وضع العلامات البكتيرية؛ (3) الانتقائية لوسم البكتيرية على خلايا الثدييات في الثقافات المشتركة مع العَدلات البشرية الأولية قد أنشأها كلسم؛ (4) الاستقرار ووضع العلامات الناجحة من البكتيريا حضور المريض الضائقة بالف مصممة حسب كلسم ومصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز/التأين-وقت الرحلة (استخدام-TOF) “قياس الطيف الكتلي”؛ (5) يتحدد تركيز الأمثل للمرشحين كلسم، كفالة الانتقائية وأبقى على البكتيريا عبر خلايا الثدييات؛ (6) مرشحين تم تصويرها قبل فكفم في تعليق و السابقين فيفو الإنسان التهاب أنسجة الرئة لضمان الاستقرار، وأن كان الإشارة إلى الضوضاء كافية للكشف. يتم وصف الخطوة 6 بالتفصيل ضمن هذا البروتوكول. منهجية للخطوات 1-5 قد ذكر سابقا11.
Protocol
Representative Results
Discussion
التهابات الجهاز التنفسي السفلي وتستأثر الثانية أعلى عبء المرض على الصعيد العالمي12،13، وكبيرة في ارتفاع في عدد الإصابات يعزى إلى البكتيريا المقاومة لمضادات الميكروبات تم الإبلاغ عن14. ويظل الالتهاب الرئوي سبب شائع للعلاج في المستشفيات. في وحدة العناية المركزة، وضع الالتهاب الرئوي يتفاقم الشك التشخيص والمقترنة معدل وفيات مرتفعة للغاية15. خلال اندلاع الالتهاب الرئوي، تتكاثر البكتيريا داخل الفضاء السنخية الرئوية البعيدة، منطقة غير معقمة نسبيا، مع الحد الأدنى الحجمية في الصحة.
يصف هذا الأسلوب مرحلة متأخرة نسبيا السابقين فيفو التحقق من الصحة الخاصة بالبكتيريا الضوئية التصوير تحقيقات11، ولكن التصميم، والتوليف، ومسبار التقييم قبل البدء في هذه الخطوة التحقق من صحة أمر حتمي، كما هو موضح سابقا11 .
كلي هو أسلوب سريرية ناشئة لاستجواب المرض الدول في الموقع في الوقت الحقيقي. يوفر العديد من المزايا على التقنيات التقليدية للتحقيق في الاشتباه في علم الأمراض الرئوية، قد تنطوي خزعة وجمع السائل الغسل. الخزعات الغازية ويمكن أن يسبب الاعتلال والوفيات في المرضى التهوية، والسوائل التي تم جمعها الغسل غالباً ملوثة بالبكتيريا من الخطوط الجوية العليا. استخدام كلي في الكشف عن الالتهاب الرئوي إلى حد ما محدودة نظراً لتوافر سوء تصوير متوافقة يسبر التي قد توفر المعلومات الفنية للمرض، وعلى الرغم من العديد من الجهود المتضافرة10. الجمع بين كلي مع وكلاء الضوئية يفتح آفاقاً لتشخيص الالتهاب الرئوي أسرع وأقل إينفاسيفيلي بالمقارنة مع الممارسة القياسية الحالية.
الخطوات الأساسية لهذا البروتوكول في إعداد العينات وإعداد منهاج كلي. الحصول على الأنسجة البشرية ذات الصلة بتطبيق السريرية النهائية أيضا هامة، مثل أنسجة الرئة البشرية كما هو موضح في هذه الدراسة. من الضروري استخدام الأنسجة البشرية نظراً لمدى أوتوفلوريسسينسي الأنسجة يظهر الاختلاف الكبير بين الأنواع، وقد يضلل ذا حساسية البكتيريا-التحقيق يجري تصويرها. بالإضافة إلى ذلك، من الضروري الحصول على الأخلاق لاسترجاع واستخدام أنسجة الرئة البشرية. من التقنية المستوى الصحيح، والتنظيف، مرفق الألياف التصوير التصوير LSU منصة، والمعايرة أمر ضروري لقرار جيد وتصوير متسقة، كما يتمثل في ضمان يتم إضافة أرقام مكافئة من البكتيريا لكل عينة أنسجة الرئة. لتوسيع مدى فائدة هذا الأسلوب لفحص لوحات تحقيقات، الضروري تكرار الإجراء مع طائفة من مسببات الأمراض، مثل تلك التي يحتمل أن تكون العوامل المسببة للالتهاب الرئوي.
الحد الأكبر من هذا الأسلوب أن الجهاز كلي سريرياً المعتمدة ليزر واحد فقط (488 نانومتر). ولذلك، اختيار فلوروفوري لتصميم المسبار حاليا محدودة للاستخدام مع هذا النظام، ولو وافق سريرياً لون واحد توجد الأجهزة مع أطوال موجية الإثارة 660 نانومتر والقريبة من الأشعة تحت الحمراء. مرغوب فيه للغاية أن يكون خط ليزر ثاني تنفذ داخل نفس الجهاز لتمكين تحقيق توضع مع fluorophore طيفيا متميزة لتحسين حساسية البكتيريا مسبار فوق مستوى أوتوفلوريسسينسي الأنسجة. بينما اللون المزدوج كلي الأجهزة قيد التطوير، أما إقرارها لا سريرياً و/أو تكاليفها هو كبير16.
كلي في المختبر باستخدام البكتيريا المسببة للأمراض و السابقين فيفو أنسجة الرئة البشرية إلى تحقيقات محتملة الشاشة يسد الفجوة بين التقنيات التقليدية في المختبر مثل التدفق الخلوي وكلسم وجدوى وفائدة سريرية. يتيح هذه الخطوة الثقة عند اختيار مركبات واعدة للمضي قدما أن تقترن بكلي السريرية التصوير؛ وسوف توفر إشارة إلى ما إذا كان التحقيق تم اختبارها يحافظ على خصوصية المستهدفة، أو يوضح أي خارج الهدف وضع العلامات، مثل ربط مباشرة إلى الأنسجة، أو يظهر عدم الاستقرار مع المضيف الإنزيمات بروتيوليتيك. أنه سيكون من المناسب لإضافة كل من المسابر أكتيفاتابلي مباشرة إلى عينات من أنسجة الرئة البشرية بالإضافة إلى البكتيريا، لتوصيف كامل سرعة المسبار ملزمة والتنشيط في الوقت الحقيقي.
ونحن نعتقد أن لدينا خط أنابيب لسرعة فحص رواية المجسات الخاصة بالبكتيريا لتقييم إمكانياتها لتصوير داخل الرئة القاصي من المرضى سيؤدي إلى الترجمة أسرع بكثير للعيادة. هذا إلى حد كبير لأنه يمكن أن يتم تسليم التحقيق الخاصة بالبكتيريا محلياً داخل الرئة عن طريق قسطرة إدراجه أسفل قناة العامل الفحص، بمعنى أن ميكرودوسي (< 100 ميكروغرام) يمكن أن يتم تسليم المبالغ. ولذلك، تقديم المنهجية وبيوديستريبوشن في المجمع ليست مصدر قلق، كما الحال بالنسبة للعديد من الأهداف العدوى الأخرى داخل الجسم، أو مع التصوير النووي. وعلاوة على ذلك، تقديم التحقيق التصوير في جرعة صغيرة يقلل من خطر السمية المتعلقة بالمضاعفات (على الرغم من أن الفحص سمية سيكون مطلوباً للترجمة). بعد تقطير للتحقيق، يمكن استبدال القسطرة ثم بالألياف فكفم والمنطقة نفسها في الرئة استجوبهم كلي، بنفس الطريقة وقد أجرينا ضمن هذا الأسلوب. ينبغي أن يجري تصوير سريعاً بعد التثبيت للتحقيق قبل التحقيق يجرف بتركيزات غير قابلة للكشف.
من المهم أيضا أن نلاحظ أن الفحص لتحديد المرض لا ينبغي أن تقتصر على العوامل البكتيرية-تصوير تحقيقات بهذا الأسلوب، ولكن يمكن أن يمتد أيضا إلى التحقق من إجراء تحقيقات مع أهداف بديلة، مثل التهاب. ينبغي أن يكون هذا النهج أيضا قابلة للتكيف لمواقع أخرى المرض داخل الجسم حيث جائز تصوير عن طريق فكفم.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الهندسة ومجلس بحوث العلوم الفيزيائية (EPSRC، المملكة المتحدة) التعاون في ميدان البحوث المتعددة التخصصات منحة الجيش الشعبي/K03197X/1، وزارة الصحة ومؤسسة ويلكوم ترست عن طريق صندوق تحدي الابتكار الصحة (هيكف) . الرقم المرجعي للتمويل: 0510-069.
Materials
| 1-14 Microfuge | SciQuip | 90616 | Small benchtop microcentrifuge |
| 96-well plate | Corning | 3370 | Assay plate |
| Calcein AM | Sigma Aldrich | 17783 | Commercial fluorescent dye |
| Cellvizio 488 nm Research CLE | Mauna Kea Technologies | LC-0001-488 | Confocal laser endomicroscopy device |
| Cletop-S | Cletop | 14110601 | Fibre cleaner |
| Eppendorf (1.5 mL) | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microfuge tube |
| Eppendorf Research Plus Pipettes | Fisher Scientific | 11568663 | Micro pipettes |
| Falcon tube (50 mL) | Scientific Lab Supplies | 352070 | 50 ml centrifugation tube |
| Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PBS – wash media |
| IC-Viewer | Mauna Kea Technologies | LW-0001 | Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system |
| Incu-Shake midi | Sciquip | SQ-4020 | Floor standing shaking incubator |
| Lysogeny Broth | Sigma Aldrich (Miller) | L3522 | LB Growth media for S. aureus |
| non-standard research AlveoFlex 488 nm | Mauna Kea Technologies | MP-0002-AF3 | Fibred confocal fluorescence microscopy fibre |
| Quanti Kit 488 nm | Mauna Kea Technologies | LQ-0005 | Calibration kit for the CellVizio 488 system |
| S. aureus ATCC 25923 | ATCC | 25923 | Bacterial strain used in this study |
| Semi-micro spectrophotometry cuvette | Sigma Aldrich | C5416-100EA | For spectrophotometry |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 41102422 | Benchtop heater with shaking |
| UV 1101 Biotech photometer | Biochrom WPA | Spectrophotometer |
References
- Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. London: H M Government/Wellcome Trust Available from: https://amr-review.org/sites/default/files/160518_Final%20paper_with%20cover.pdf (2016)
- Caliendo, A. M., et al. Better Tests, Better Care: Improved Diagnostics for Infectious Diseases. Clin. Infect. Dis. 57, 139-170 (2013).
- Zumla, A., et al. Rapid point of care diagnostic tests for viral and bacterial respiratory tract infections-needs, advances, and future prospects. Lancet Infect. Dis. 14 (11), 1123-1135 (2014).
- Neumann, H., Kiesslich, R. . Yamada’s Textbook of Gastroent. , 2944-2949 (2015).
- Chauhan, S. S., et al. Confocal laser endomicroscopy. Gastrointest Endosc. 80 (6), 928-938 (2014).
- Goetz, M., Malek, N. P., Kiesslich, R. Microscopic imaging in endoscopy: endomicroscopy and endocytoscopy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11 (1), 11-18 (2014).
- Abbaci, M., et al. Confocal laser endomicroscopy for non-invasive head and neck cancer imaging: A comprehensive review. Oral Oncol. 50 (8), 711-716 (2014).
- Thiberville, L., et al. Human in vivo fluorescence microimaging of the alveolar ducts and sacs during bronchoscopy. Eur Respir J. 33, (2009).
- Thiberville, L., et al. Confocal fluorescence endomicroscopy of the human airways. Proc Am Thorac Soc. 6 (5), 444-449 (2009).
- Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical imaging of bacterial infections. Clin. Transl. Imaging. 4 (3), 163-174 (2016).
- Akram, A. R., et al. A labelled-ubiquicidin antimicrobial peptide for immediate in situ optical detection of live bacteria in human alveolar lung tissue. Chem. Sci. 6 (12), 6971-6979 (2015).
- Dickson, R. P., Erb-Downward, J. R., Huffnagle, G. B. Towards an ecology of the lung: new conceptual models of pulmonary microbiology and pneumonia pathogenesis. Lancet Respir Med. 2 (3), 238-246 (2014).
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Magiorakos, A. P., et al. The rise of carbapenem resistance in Europe: just the tip of the iceberg. Antimicrob Resist Infect Control. 2 (1), 6 (2013).
- Chastre, J., Fagon, J. -. Y. Ventilator-associated Pneumonia. Am. J. Respir Crit Care Med. 165 (7), 867-903 (2002).
- Krstajić, N., et al. Two-color widefield fluorescence microendoscopy enables multiplexed molecular imaging in the alveolar space of human lung tissue. J Biomed Opt. 21 (4), 046009-046009 (2016).
