In Vivo Tracking der menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen in einem Rattenmodell Knie Arthrose mit fluoreszierenden lipophile Membran Farbstoff
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Möglichkeit zur Überwachung der Zelle Persistenz und Bioverteilung des menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen (HaMSCs) durch dunkelrote Fluoreszenz Kennzeichnung in einem Rattenmodell Knie Arthrose (KOA) durch intraartikuläre Injektion (IA).
Abstract
Um die klinische Anwendung der menschlichen Fettgewebe gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (HaMSC) Therapie für Knie-Arthrose (KOA) zu unterstützen, haben wir die Wirksamkeit der Zelle Persistenz und Bioverteilung des HaMSCs in Tiermodellen untersucht. Wir zeigten eine Methode um die Zellmembran der HaMSCs mit lipophilen Fluoreszenzfarbstoff zu beschriften. Anschließend wurde intraartikuläre Injektion der markierten Zellen bei Ratten mit chirurgisch induzierten KOA dynamisch durch ein in-Vivo imaging-System überwacht. Wir beschäftigten die lipophilen Carbocyanines haben (DilC18 (5)), eine dunkelrote fluoreszierende Dil (Dialkylcarbocyanines) Analog, die einen roten Laser zur Anregung der natürlichen grünen Autofluoreszenz vom umgebenden Gewebe zu vermeiden verwendet. Darüber hinaus rot-verschoben Emissionsspektren der zulässige tiefen Gewebe Bildgebung mit lebenden Tieren und die Kennzeichnung Verfahren keine zytotoxischen Effekte oder funktionellen Schaden HaMSCs verursacht. Dieser Ansatz hat sich gezeigt, um eine effiziente Überwachungsmethode für HaMSCs in einem Rattenmodell KOA werden. Die Anwendung dieser Methode könnte auch verwendet werden, um die optimale Verwaltung Weg und Dosierung von MSCs aus anderen Quellen in präklinischen Studien bestimmen.
Introduction
Knie-Arthrose (KOA) ist eine degenerative Erkrankung, die durch Verlust von Gelenkknorpel und fortschreitende Entzündung, die eine große chronische Erkrankung bei älteren Menschen rund um die Welt1geworden ist. Aktuelle Therapien mit Anti-inflammatory Drogen, körperliche Ergänzungen und chirurgische Eingriffe können jedoch nur vorübergehende Linderung für symptomatische Schmerzen2vorsehen.
Menschlichen Fettgewebe mesenchymaler Stammzellen (HaMSCs) sind eine vielversprechende regenerative Heilmittel für Knie-Arthrose, aufgrund ihrer multipotenten Differenzierungspotenzial für Knorpelregeneration und immunmodulatorische Eigenschaften3geworden, 4. Im Vergleich mit pharmakologischen Routen, Mechanismen der Aktion in Vivozu untersuchen, ist das tracking live HaMSCs in kleiner KOA Tiermodelle derzeit lehrreich, die Begründung und die Machbarkeit der HaMSC Therapie vor der klinischen Anwendung zu etablieren. Für präklinische Tests, destabilisiert mediale Meniscectomy (MM) die mechanische Belastung des Gelenks zu induzieren KOA in Ratten, bietet ein relativ machbar Modell mit konsistenten Reproduzierbarkeit5. Das Auftreten von KOA induziert durch MM ist älter als Durchtrennung des vorderen Kreuzbandes allein oder in Kombination mit partiellen medialen Meniscectomy6. Daher sind die langfristigen Wechselwirkungen zwischen eingespritzte HaMSCs mit der pathologischen Mikroumgebung von KOA oft bei Ratten induziert durch MM7,8bewertet.
Obwohl die therapeutische Wirksamkeit des HaMSCs wurde ausführlich berichtet, relevante Kenntnisse auf ist die in-Vivo -Persistenz von implantierten HaMSCs durch intraartikuläre Injektion (IA) knapp9,10. Daher sind verschiedene zelluläre Kennzeichnung Methoden entwickelt worden, einschließlich der Immunhistologie11, Luciferase12, grün fluoreszierendes Protein13 Transfektion Eisenoxid labeling für Magnetresonanz-Bildgebung (MRI)14, , und zahlreiche fluoreszierende Zelle Farbstoffe8,15,16. Verglichen mit arbeitsintensiven Histologie Analysen, beschäftigt in Vivo nicht-invasive Bildgebung optische Geräte, die Echtzeit-Verteilung und Dynamik der Zellen beschriftet mit fluoreszierenden Signale10,17zu erkennen. Für funktionelle live Cell Imaging ist Cytocompatible fluoreszierenden Kennzeichnung eine anspruchsvolle radioaktiven kostenlose Tracking-Technik, um zelluläre Aktivitäten nach Stammzell-Transplantation18zu offenbaren. Darüber hinaus besitzen multicolor lipophile Fluoreszenzfarbstoffen Vorteile gegenüber amino-Reaktivfarbstoffe hydrophil oder fluoreszierende Proteine, einschließlich ihrer Zelle verbesserte Durchlässigkeit und verstärkten Fluoreszenz Quantum Erträge19.
So nutzen die Protokolle enthalten hier eine rote Laser beschriftet mit lipophilen Carbocyanines Zellen erregen haben (DilC18(5)), ist eine dunkelrote fluoreszierende Dil (Dialkylcarbocyanines) analog20. Die rot-verschoben Anregung und Emission Spektren von vermeidet Autofluorescent Störungen und tiefen Gewebe über einen langen Zeitraum hinweg in lebenden Tieren8Bildgebung ermöglicht. Diese Methode des Trackings Zellen in Vivo mit beschriftet habe ist gültig für die Überwachung der transplantierten Stammzellen, wie HaMSCs, in Tiermodellen, das zum Verständnis und zur Verbesserung der aktuellen regenerative Stammzelltherapie wesentlich ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sicherheitsstandards und Bioverteilung Studien der Stammzell-Therapie sind dringend notwendig, bevor wir regenerative Stammzell-Therapie für KOA von der Bank ans Bett zu bringen. Die pathologische Umfeld der Krankheit spielt jedoch eine wichtige Rolle in der Ausdauer und der Bioverteilung des transplantierten HaMSCs10. Unsere Fraktion nachweislich vor kurzem intraartikulären Injektion von HaMSCs mehr in einer pathologischen KOA Umgebung beibehalten, als Injektionen unter normalen Bedingungen<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die aktuelle Studie wurde unterstützt durch Shanghai Innovationsförderung (1402 H 294300) gesponsert von der Wissenschaft und Technologie Kommission von Shanghai Gemeinde (CN), Dr. Wen Wang. Wir möchten danken Dr. Guangdong Zhou (National Tissue Engineering Center of China) für seine technische Unterstützung und wissenschaftliche Beratung für diese Handschrift. Wir auch möchte Herr Huitang Xia (Shanghai neunten Volks Krankenhaus) danken für seine Hilfe im Bereich des Tierschutzes.
Materials
| Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
| 4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
| Razor | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
| 0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
| Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
| 0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
| Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
| Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |
References
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