Конфокальный флуоресценции микроскопии и лазерной микро облучения предложение инструменты для вызывая повреждение ДНК и контроля ответ ДНК ремонт белков в отдельных югу ядерной областях. Этот метод значительно продвинулась наши знания обнаружения повреждений, сигнализации и вербовки. Эта рукопись демонстрирует эти технологии для изучения одноместные и двухместные стренги перерыв ремонт.
Высоко скоординированных ДНК ремонта пути существуют для обнаружения, акцизов и заменить поврежденные оснований ДНК и координировать ремонт разрывы ДНК пряди. В то время как методы молекулярной биологии уточнили структуры, ферментативные функции и кинетика протеинов ремонта, по-прежнему необходимо понять, как ремонт координируется в ядре. Лазер микро облучения предлагает мощный инструмент мониторинга набор протеинов ремонта и вызывая повреждение ДНК. Индукция повреждений ДНК путем лазерной микро облучение может произойти с диапазоном длин волн, и пользователи могут надежно побудить однорядная перерывы, базовый поражений и двойной стренги порывает с диапазоне доз. Здесь лазер микро облучения используется для изучения ремонт сингл и двойной стренги перерывов, вызванных два общих конфокальных лазерных длин волн, 355 Нм и 405 нм. Кроме того, надлежащее характеристика прикладной лазерной дозы для стимулирования конкретных ущерб смеси описано, так что пользователи могут выполнять можно воспроизвести лазерной микро облучения сбора и анализа данных.
Люминесцентная микроскопия стала мощной техникой для визуализации сотовой архитектуры, изучения белков локализации и отслеживания взаимодействий протеин протеина и белка ДНК. С помощью флуоресцентной микроскопии для изучения ДНК повреждения ответы после применения глобальных ДНК повреждающих агентов, таких как ультрафиолетового (УФ) света, ионизирующего излучения, химического окисления или алкилирующих агентов или химиотерапевтические предоставила новое понимание инициирование, сигнализации и набор ДНК ремонт белки сайты ДНК повреждения1,2. Однако ограничивая эти глобальные и асинхронные события ущерб, если подробную информацию о порядке найма, кинетика ассоциации или диссоциации, и отношения между ключевыми ДНК ремонт белки испрашиваются. К счастью достижениями в лазерного сканирования конфокальные микроскопы, более широкой доступности вызывая повреждение лазерных длин волн, и улучшения в флуоресцентных белков за последние 25 лет предоставили исследователей с усовершенствованные инструменты для изучения этих аспекты ДНК ремонт, через целевые индукции повреждения ДНК.
Облучение клеток с лазерной microbeams с целью изучения клеточном и субклеточном функций является хорошо создан инструмент в ячейке и радиационной биологии3. Применение этой методики изучения репарации ДНК возник при использовании Кремер и коллег-целенаправленных УФ (257 Нм) лазерная система Микролучевой вызвать повреждение ДНК через 0,5 мкм, пятно яичника китайского хомяка (Чо) клетки4 и учредил индукции Photolesions ДНК по этой системе5. Хотя предлагает значительные улучшения по УФ Микролучевой методы в то время, принятие этого повреждения системы была ограничена из-за ее специализированных создали и его неспособность создать двойной нити перерывы (DSBs)6. Последующее расследование различных УФ-B (290-320 нм) и УФ-волн (320-400 Нм) ряда групп показали УФ фотопродуктов, окислительного базы поражений, одинарная ломает рабочего тормоза (РСРТ), и DSBs может быть наведено зависит от длины волны лазера и мощность применяется4,,7–8,9,10 (обзор в 3). Кроме того комбинации этих UV-B и UV-A длин волн с информирование агентов, как псорален, Бромдезоксиуридин (BrdU) и красители Hoechst, найдены также вызвать повреждение ДНК зависит от длины волны, мощность и длительность воздействия, хотя власть необходимо вызвать повреждение часто опускается при наличии эти агенты11,12,13,14,15. Эти усовершенствования расширил использование микро облучения, хотя там были еще технические препятствия для более широкого принятия этих методов необходимо уделить.
Кремер и коллег значительно расширенные поля микро облучения фокусируясь именно УФ Микролучевой наносить значительный ущерб энергии очень локализованной области в ячейке. Конфокальные микроскопы и лазерных систем microdissection расширенное, плотно сосредоточены свет был более широко доступными; Однако муфты источников УФ областей и дело с хроматические аберрации, которые они по-прежнему вызванной представлены значительные проблемы для большинства пользователей3,6,16. УФ краски возросла популярность на протяжении 90-х годов, оптика способна сосредоточения и захвата УФ возбужденных флуоресценции стал более широко доступны16, и улучшения в лазерного сканирования предлагает пользователям возможность создания очень сосредоточены УФ возбуждения пятна в пределах клетки6,17. Однако, он не был до начала 2000-х что истинное влияние этой комбинации плотно сосредоточены балок с более высокой интенсивности лазеры чувствовал, когда появились многочисленные сообщения, демонстрируя, что разрывы ДНК пряди могут быть вызваны с и без сенсибилизаторов в UV-A диапазон6,10,18,19,20, 405 нм21,,2223,24, 25,26и даже больше в видимых длинах волн как 488 нм27. Эти усовершенствования позволили для более широкого внедрения метода микро облучения на ряд коммерческих систем. Параллельно с этими событиями два Фотон методы также выяснилось, что позволило точно индукция повреждений ДНК; Хотя эти достижения не будут обсуждаться здесь, есть целый ряд обзорных статей, обсуждая эти методологии9,28,29,30.
С текущей доступности конфокальные микроскопы, способных доставлять узкоспециализированных ультрафиолетового света и широкое наличие флуоресцентных белков, чтобы позволить слежение в реальном времени ремонта белков, ДНК микро облучения методы превратились в мощные инструменты для анализа ДНК повреждения ответ и ремонт пути. Однако пользователи должны знать, что поколение повреждения ДНК сильно зависит волны и мощности, применяется к югу ядерной региона. Использование УФ-C (~ 260 Нм) длинах волн позволяют прямого возбуждения ДНК и высокой селективностью для индукции УФ фотопродуктов7,8. УФ-B и UV-A волны производят смеси повреждения ДНК (базовый поражением рабочего тормоза РСРТ и DSBs), зависит от прикладной питания и сотовые фоновый используются7. Эндогенные фотосенсибилизаторов и анти-оксидантов уровней в целевые клетки могут влиять смеси повреждения ДНК, производимые этими длин волн. Кроме того Использование экзогенных фотосенсибилизаторов (BrdU и т.д.) может помочь в снижении энергии, необходимой для индукции повреждения ДНК. Однако эти агенты могут вызвать повреждение ДНК, сами, и они могут изменить клеточного цикла и структура хроматина, поэтому их использование может производить побочные эффекты, которые должны рассматриваться пользователем. Таким образом перед использованием микро облучения для изучения реакции повреждения ДНК и ремонт, требуется тщательное рассмотрение ДНК ремонт пути интерес, волн, доступных для использования и ДНК повреждения смесь создана.
Здесь, лазер микро облучение проводится на два часто используемых длинах волн, 355 Нм и 405 нм, без сенсибилизаторов продемонстрировать смеси повреждения ДНК под воздействием этих волн и влияний, эти повреждения смеси имеют на изучении ремонтРабочего тормоза РСРТ и DSBs. пользователи должны осознавать, что эти волны не создают один видов нити перерывы или базовый поражения. Для того, чтобы различать ДНК ремонт пути, пользователи должны тщательно контролировать прикладной власть над конкретного региона ядра и характеризуют индуцированных повреждений, используя несколько маркеров перерыв прядь и антител поражения ДНК. Если надлежащим образом применяться и характеризуется, лазер микро облучение может обогатить некоторых видов повреждения ДНК, позволяя пользователям оценить ремонт базовых поражений и рабочего тормоза РСРТ или DSBs, с некоторыми специфичности. Таким образом мы создали метод, позволяя пользователям можно воспроизвести выполнения лазерной микро облучения, характеризуют смеси повреждения ДНК, индуцированных прикладной лазерной дозы и выполнять анализ данных.
Использование условий, описанных здесь, любой Конфокальный микроскоп с UV-A или 405 нм лазер, интегрированные изготовителем или добавлены конечным пользователем, могут вызвать повреждения ДНК в ядре клетки и позволяют набор ДНК ремонт белков на сайт индуцированных повреждений ДНК контролироваться. Однако, как отмечено в протоколе и представитель результаты, выбор длины волны, применяется сила, и квалификация ущерба все важные вопросы, которые должны быть решены прежде пользователем с целью изучения конкретных ДНК ремонт пути. Кроме того существуют другие соображения в экспериментальный дизайн, который также должен быть рассмотрен пользователей.
Для того, чтобы контролировать поведение белка в живые клетки пост микро облучения, дневно обозначенные белков должен быть создан. Наличие широкого круга флуоресцентных белков, которые могут быть разделены спектрально предлагает инструменты для создания протеин сплавливания, которые могут быть использованы для характеризующие клеточных реакций к индукции повреждения ДНК. Переходных трансфекции флуоресцентных белков интерес позволяет для быстрого скрининга пагубных условий, мутации или даже ингибиторов, в то время как стабильно transfected клеток предлагают больший контроль над уровни выражения и позволяют для других биохимических составы должны быть выполнены, проверка результатов микро облучения. Спектрально собственный флуоресцентные белки также могут быть использованы в той же ячейке для отслеживания взаимодействия белков внутри же пути или в разных пути. Флуоресцентные белки также устранить необходимость для специфических антител для каждого протеина интереса и позволяют живой клетки мониторинг поведения белок для длительных периодов времени после индукции повреждения.
Однако использование флуоресцентных белков также имеет недостатки. Без генетических особенностей несовершенными в белки интерес эндогенного белки будут конкурировать с дневно тегами белков. Спряжение флуоресцентные тега N или C конечной белка может изменять сворачивание белков, препятствуют ключевой белок белковых взаимодействий или блокировать транслокации сигналов; изменение функции и потенциально влияющих на динамику найма. Эти эффекты были продемонстрированы в ряде докладов, где immunofluorescent окрашивание продемонстрировали резко различных набора и удержания раза эндогенного белка в ущерб сайт28. Использование переходных трансфекции или стабильной клонов может также изменить ответ, наблюдается, обычно через изменения в уровнях выражения протеина. Кроме того использование нескольких флуоресцентных белков в одном эксперименте также может изменить динамику найма, если не являются хорошо достижение равновесного уровня уровни белка или найма большего дневно тегами белка блокирует вербовки других белков . Наконец флуоресцентные белки могут выступать в качестве слабой информированности агентов, увеличивая формирования реактивнооксигенных видов и потенциально изменяя ДНК повреждения смеси индуцированных46,47. Несмотря на эти недостатки флуоресцентные белки предлагают целый ряд отличительных преимуществ в изучении ДНК ремонт с микро облучения, и если пользователи включать соответствующие элементы управления, такие как характеристика повреждений, описанных здесь, они могут обеспечить новое понимание в ущерб ответ и белок белковых взаимодействий3.
Если не требуется живых клеток, иммунофлюоресценции может использоваться для наблюдения за ответ индуцированных повреждений. Фиксируя клетки в определенное время после повреждения индукции и окрашивание с антител специфических для белков и поражения интерес, статические снимки повреждения индукции и набора и удержания ремонта, что белки могут быть построены. Антител может использоваться для наблюдения за набор нескольких протеинов интереса и/или столб-поступательные изменения, вызванные ответ повреждения ДНК. Использование иммунофлюоресценции устраняет необходимость для флуоресцентных белков и позволяет эндогенного белка поведение, чтобы быть изучены. Однако этот метод тоже имеет свои недостатки. Весьма специфические антитела являются необходимыми, и permeabilization и блокировки процедуры должны быть оптимизированы, чтобы разрешить для обнаружения набора с достаточной интенсивностью сигнала. Фиксирующие процедуры не мгновенно, а это физическое ограничение ограничивает временное разрешение этого подхода. Отображение на сайте повреждения индукции поэтому клетки могут быть повторно расположен после окрашивания также может представлять серьезные проблемы. Конфокальный микроскоп, используемые в этой работе позволяет для регистрации на основе образа, как описано выше, поэтому поврежденные клетки могут быть перемещены с высокой точностью. Если этап регистрации или травления coverglass не доступен, время инвестиций, занимающихся перемещения клетки без стадии регистрации, в сочетании с присущие задержка между ущерб индукции и фотосъемка вербовки, может сделать иммунофлуоресценции непривлекательным для некоторых пользователей. Однако наиболее точных и полных микро облучения экспериментальные проекты будут включать эти виды подходов параллельно с использованием флуоресцентных белков, как описано в представленных протокол.
Здесь как живых клеток, так и иммунофлюоресценции используется для демонстрации полезности лазерной микро облучения. Immunofluorescent окрашивание позволяет нам точно проанализировать смесь создан повреждения ДНК и набор белков, вызванных каждой мощности лазера, которые позволяют нам лучше интерпретировать наблюдаемые изменения в набор и удержание XRCC1-GFP. На основе этих результатов, использование 405 нм лазеры должно быть ограничено для изучения белков Бер и SSBR. Кроме того оптимальный экспериментальный дизайн будет включать измерения мощности после цели, полный урон смесь характеристик для каждой ячейки строки используется и проверки набора и удержания, наблюдается в дневно отмеченных белки с иммунофлюоресценции. Очевидно оборудование, время и стоимость соображений может сделать эти оптимальные экспериментальные проекты невозможным для некоторых пользователей. Однако это демонстрирует важность каждого из этих элементов, а пользователи должны иметь эти соображения в виду при начале экспериментов микро облучения.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Samuel H. Wilson в Национальный институт окружающей среды медицинских наук для клеточных линий, используемых в этой работе.
Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope | Nikon | ||
NIS Elements software | Nikon | ||
355 nm laser | PicoQuant VisUV | Radiation source | |
Galvanometer photoactivation miniscanner | Bruker | ||
Microscope slide photodiode power sensor | THORLabs | S170C | |
Fiber photodiode power sensor | THORLabs | S150C | |
Digital handheld optical power and energy meter | THORLabs | PM100D | |
CHO-K1 | From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS | ||
Minimal essential media | Hyclone | SH3026501 | |
Fetal bovine serum | Atlanta biologicals | S11550 | |
XRCC1-GFP | Origene | RG204952 | |
Jetprime | Polyplus transfection | 11407 | |
Geneticin | ThermoFisher | 10131035 | |
4 chambered coverglass | ThermoFisher | 155382 | |
8 chambered coverglass | ThermoFisher | 155409 | |
Anti 53BP-1 | Novus | NB100304 | |
Anti-phospho-histone H2AX | Millipore | 05-636-I | |
Anti cyclobutane pyrimidine dimer | Cosmo Bio clone | CAC-NM-DND-001 | |
Anti 8-oxo-2´-deoxyguanosine | Trevigen | 4354-MC-050 | |
Alexa 488 goat anti-mouse | ThermoFisher | A11029 | |
Alexa 546 goat anti-rabbit | ThermoFisher | A11010 | |
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | R37606 | Caution toxic! |
Phosphate buffered saline | ThermoFisher | 0780 | |
Normal goat serum | ThermoFisher | 31873 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
37% Formaldehyde | ThermoFisher | 9311 | Caution toxic! |
Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
Methanol | VWR | BDH1135 | Caution toxic! |
HCl | Fisher | SA49 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Caution toxic! |
Tris Hydrochloride | Amresco | O234 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |