マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

1。 細胞培養と安定した細胞の生成 10% 牛胎児血清を添加した最小必須培地で成長 CHO ‐ K1 細胞。37 で 5% CO 2 と加湿のインキュベーターで細胞を維持 ° C C 末端の人間、XRCC1 を含んでいるプラスミッド DNA の 1 μ g に transfect CHO ‐ K1 細胞緑次のメーカー商業トランスフェクション試薬を用いた蛍光蛋白質 (GFP) タグ ' の指示。 選択 CHO ‐ K1 800 μ g/mL ジェネティシンを使用して人間の XRCC1 GFP 融合を安定に発現する細胞し、蛍光セル (FACS) を並べ替えを使用して、XRCC1 GFP 表現する人口を豊かします。 プレート細胞 coverglass 底を有する培養容器でマイクロ照射になり彼ら到達約 75% またはより大きい密度の次の日にします。いくつかの空白セルの間が望ましい、特に場合は、登録を使用して同じイメージ フィールド (セクション 3.2) に戻ります。 2。顕微鏡のセットアップ 選択レーザー走査共焦点顕微鏡マイクロ照射/光の適切なレーザー、光学、および制御ソフトウェアを装備。走査型レーザー共焦点顕微鏡検流計 photoactivation miniscanner ファイバー結合 355 nm レーザーを含むように変更されている実験使用を提示し、メーカーを使用して制御 ' s 制御・解析ソフト。このシステムはマイクロ-照射利益 (率 ROI) のユーザーが指定した地域の photoactivation miniscanner (355 nm レーザー) または標準の共焦点ガルバノ メーター (405 nm レーザー) を使用して実行できます。 マイクロ照射、マイクロ照射光のすべての光学コンポーネントが選択した波長に適していることを確認に使用する波長を選択します 。 メモ: 355 nm マイクロ照射用の UV フィルター キューブとともに 40 × C アポクロマート (開口数 (NA) 1.2) 油浸対物レンズと標準的な共焦点光パスを用いた 20 × C アポクロマート (NA 0.75) 乾燥目的提示システムを使用してください。405 nm マイクロ-照射。セットアップで使用される 20 × 目的は 355 nm 波長のと互換性がありません。したがって我々 用 40 × 355 nm のみ。蛍光プロトコル イマージョン オイルをオフに洗浄せず下流に適用することができます損傷の乾燥系対物レンズを使用して、利用可能な場合この目的理由です。 は、マイクロ照射実験のため顕微鏡を構成します。実験の間の一貫性を維持するためにマイクロ照射の種類ごとに使用する顕微鏡コンポーネントの標準化された構成を指定します。顕微鏡内のプリセットとして設定を保存 ' オペレーティング ・ ソフトウェアで可能であれば s. 注: 提示システムにおけるセル、マイクロ照射、一方向のスキャン、スキャン解像度は、1024 x 1024 ピクセル x スキャン ズーム 1 を使ってイメージ化 8 フレーム/秒 (fps) やピンホールのフレーム レートで 4 に設定約風通しの良い単位 (AU) として488 nm レーザー (69 μ m) に決定。この開いたピンホール設定は低いレーザー力を画像と退色を減らすことの使用を許可する各イメージにキャプチャされた光の量を最大化するために選ばれた。 3。レーザー マイクロ照射 場所準備培養皿、顕微鏡ステージと所定の位置にしっかりとロックに興味のセルが含まれています。 場合は、ステージ上のインキュベーターで腔症スライドを配置、損傷誘導中に 5% CO 2 と 37 ° C で維持します。この手順は、生細胞タイムラプス イメージングまたは長いセッションをイメージングの最も重要です。それ以外の場合、顕微鏡の場所細胞ステージし、室温で照射を行う (〜 25 ° C)、5% CO 2 と 37 ° C で培養する細胞をすばやく戻る。 固定、染色、または他のプロシージャを実行した後、同じ場所に戻ります研究をできるようにイメージ フィールドを登録します。セルの XY 位置のエッチングまたはラベルの付いたグリッドを有する培養 coverglass 容器またはエンコードされた、自動ステージを使用して破損しているフィールドの登録を実行します。 ソフトウェア イメージの登録を使用して培養器 (すなわち、coverglass または井戸間の障壁のコーナー) の認識機能を選択、画像を収集、XY 位置を記録します。これにより、配置およびサンプル準備、次の選択したフィールドの XY 位置の登録。 場合は手動登録を使用して、グリッドまたは各フィールドのエッチングの場所を手動で記録、ステージ上方向および皿の配置を記録するように注意しながら. 細胞培養容器の識別機能がない場合は、細胞の形態や密度の目視による破損しているフィールドを識別します。後、イメージング中に認識する十分に明確な機能を持つフィールドを選択する注意してください 。 注: これは方向および培養器の地域は厳しく制限されていない限り、実行に時間がかかるできます。 マイクロ照射用のフィールドを選択し、サンプルに焦点を当てます。蛍光に分類された蛋白質を発現する細胞では、関心の蛍光チャネルで最大の核の断面を持つフォーカル プレーンを選択します。細胞のタンパク質をラベルを表現していないまたは明確な核局在化せず、位相コントラストまたは差動干渉の対照 (DIC) の画像を正しい焦点面を検索する使用できます 。 ​ 注: 位相差顕微鏡および DIC イメージングの有用な特徴であると、焦点面は、サンプルを移動、同じ機能することができます表示されます光や暗い、相対的な焦点面によって。 は、内核、核小体など明確な機能を選択し、外観の変化を観察しながら、焦点面を上下に移動します。真の焦点面は、光から暗いへの移行であるでしょう。サンプルを対象にするため選択したフィーチャーが鮮明なコントラストと、焦点の平面を選択します。 興味の分野の位置を登録します。顕微鏡のソフトウェア内の 3 × 3 ピクセルの正方形の投資収益率を作成、この投資収益率を破損している細胞の核に置きます、この投資収益率 ROI の損害を設定します。 は、ROI の損傷の位置など事前の被害画像を収集します。 蛍光タンパク質を使わない実験を取得位相差、微分干渉対照 (DIC) 明視野画像を確認して被害の核を記録するためです。 生細胞を蛍光タンパクを用いた実験のため明視野と蛍光チャネル (すなわち、レーザー ライン 488 nm の GFP、RFP の励起用レーザー線 561 nm の励起) 興味の蛋白質を含んでいるイメージを取得します。CHO ‐ K1 XRCC1 GFP を用いた実験、488 nm レーザー線励起蛍光同時に送信された DIC 明視野チャネルで収集されたします。 開始レーザー損傷。 提示システムにおける制御時間の合計によってレーザー照射量過ごした損傷 ROI をスキャンします。355 nm レーザーの検流計は、固定のスキャン レートで動作するレーザー照射量によって選択された損傷の投資収益率を繰り返しスキャン時間: データ記載されてここでは、355 でマイクロ照射 nm が 2 と 10 秒間実行されます。 は対照的に、スキャン レートを調節することによって 405 nm レーザー照射量を制御し、選択した破損の投資収益率の 1 つのスキャンを実行します。データ p の405 マイクロ照射 8 と 0.5 fps を使用ここで憤慨、nm。レーザー スキャン中に各ピクセルのより少ない時間を費やしているので、8 fps のスキャン レートは 0.5 fps よりも低いレーザー照射量を提供します。両方のレーザは、100% の力で運営されています。レーザー力の直接測定の手順については、セクション 3.7 を参照してください 。 注: 個々 の顕微鏡システムごと指定された投資収益率、方法に類似した 355 にレーザー出力を配信する方法で異なる場合があります nm、405 nm 異なる提示システム。ユーザーが彼らの顕微鏡システムのこの手順を決定し、レポートの方法セクション内でこれらのパラメーターする必要があります。 生きているセルイメージ投射のため明視野と蛍光チャンネル タイムラプス画像集録を実行します。理想的な実験の時間にわたって被害投資収益率で蛍光タンパク質と解離度の蓄積をキャプチャ データ コレクションを最適化するタイムラプスの期間と頻度を調整します。XRCC1 GFP を用いた実験は、20 分間 30 秒ごと画像を収集します 。 ​ 注: タイムラプス イメージングの周波数は蓄積・解離の分析を複雑な蛍光の退色によって制限されることができます。退色は、タイムラプス中無傷の細胞を観察し、無傷細胞内蛍光信号の損失を最小限に抑えるための買収条件を調整することによって評価できます。ユーザー タイムラプスの各フレームで破損していない細胞に損傷した細胞の蛍光強度を正規化することで信号の損失を補うことがありますので、いくつかの退色は避け、あります。 時間コースを完了すると、細胞の損傷のための新しいフィールドを選択またはセクション 4 で説明されているように、さらに分析、損傷した細胞を修正します。 続行マイクロ照射とタイムラプス イメージング損傷した細胞の必要な数に達するまでします 。 ​ 注: 誘導損傷に応答細胞間の不均一性を評価するために選択した条件ごとの 10-25 セルの合計の損傷をお勧めします。これ紹介、セルの数が多い上ピーク募集時の解析が複雑に千鳥被害開始の時間または解離時間ほとんど共焦点システムは、各マイクロ照射中 1 つ以上のセルの損傷にユーザーをできますが、高速のイベント。一部のシステムで Roi を同時損傷誘導はそれぞれ独立した ROI によって受け取られたレーザーの服用量を減らすことができます。したがって、これらのタイミング/電源の問題は、ユーザーが直接アドレス指定されて、しない限り、それは推奨細胞が個別に破損している。 蛍光抗体法 (IF) によるダメージを実行しで説明するよう、どちらかはすぐにセルを修正セクション 4、または時間 (すなわち、1、5、10 または 20 分) の選択したインクリメントを修復する細胞を許可します。希望の時間が経過すると、修正し、セクション 4 に示すとおり、細胞を染色します。 分析全体的な細胞数を増加、損傷後損傷応答の複数フィールドの時間コースを生成する培養器内にある追加のフィールドを 。各フィールドをし、損傷が発生した時間の XY 位置を記録します。期待どおりの合計後は、修復時間が経過を修正し、以下のとおり細胞を染色します。 選択した用量で蛋白質の募集を観察し、正確に特徴付けると、報告後の目的とレポート レーザー電源レベル後繊維測定レーザー用量。私たち使用コンパクト デジタル パワー メーターと 2 つの異なるダイオード センサー ヘッド;後ファイバー出力を計測するレーザー光ファイバーに直接結合 1 つと他は post-objective の出力を測定する顕微鏡ステージ上に配置します。 レーザー パワーを測定し (後の繊維または post-objective)、目的の構成でセンサーを配置、電源メーターによる測定を記録しながら、上記のようにマイクロ照射を実行 。電源メーターのサンプリング レートは、電源メーターが適用用量を正確に検出することを確認するための実験の複数のイテレーションを実行する必要がありますので、非常に急速なマイクロ照射イベントをキャプチャするのに十分な高速にできない場合がありますに注意してください 。 注: 355 nm レーザーの約 5 mW の後繊維と約 19 μ 後目的の平均ピーク電力を測定しました。電源メーターの 0.01 秒の最大サンプリング レートと 1.5 の平均ピーク力を克服するために 30 の繰り返しのループに 405 nm レーザーのマイクロ照射を行った mW と 2.4 mW 8 と 0.5 フレーム/秒のスキャン速度を測定しました。、それぞれ。すべての電源メーターが違います。ユーザーが操作の波長と彼らの個々 のパワー メーターのサンプリング レートを決定する必要があります。 4。蛍光抗体染色法 場合染色による分析鎖休憩誘導。 3.7% と修正細胞ホルムアルデヒド (注意) リン酸バッファー 10 分吸引ホルムアルデヒド溶液、PBS で 3 回洗浄用生理食塩水 (PBS)。プロトコルは PBS セルの背面に配置することによってここで停止することができ、セルを 1 週間の 4 ° C で保存できます 。 注意: ホルムアルデヒドは有毒で発がん性です。摩耗適切な個人用保護具と制度の環境健康と安全の手順で指示として有害物質の dispose。 0.25% を使用してセルを permeabilize PBS で 3 回常温 (RT)、洗い 10 分 PBS でトリトン X-100。 室温 1% ウシ血清アルブミン (BSA) を含む PBS で 30 分間インキュベートし非特異抗体の結合をブロック ΓH2AX に対してプライマリ monoclonal antibody と 53BP 1 の両方は常温では、1 時間 1 %bsa を含む PBS で 1:750 を希釈し、PBS で 3 回を洗浄に対する主なポリクローナル抗体加温します。 アレクサ 488 ヤギ抗マウスと Alexa 546 ヤギ抗うさぎ加温セル両方 RT で 1 時間 1 %bsa を含む PBS で配分を希釈し、PBS で 3 回を洗浄します。 染色 DAPI の 10 mg/mL の溶液と核 DNA (4 '、6-Diamidino-2-Phenylindole、注意) 5 分または使用と同等の原子力染料の PBS で 1: 5000 に希釈と、PBS で 3 回洗って 。 注意: DAPI は毒性および変異原性です。適切な個人用保護具を着用し、制度環境健康と安全の手順の指示に従って、有害物質を処分します。 場所 PBS または PBS + 0.1% アジ化ナトリウム (注意) は染色の細胞に戻る。プロトコルはここで停止することができます、セル数日間 4 ° C で保存またはセクション 5 で画像取り込みに進みます 。 ​ 注意: アジ化ナトリウムは毒性が強い。適切な個人用保護具を着用し、制度環境健康と安全の手順の指示に従って、有害物質を処分します。 基本病変または DNA の分析誘導場合染色による付加します。 修正-20 で 20 分間氷冷メタノール (注意) でセルを permeabilize と ° C 注意: メタノールは有毒、可燃性です。適切な個人用保護具を着用し、制度環境健康と安全の手順の指示に従って、有害物質を処分します。 は、私を吸引します。thanol 15 分プロトコルに完全に乾燥するサンプルはここで停止することができ、-20 ° C で保存されているセルを 3 日間乾燥を許可するとします。 15 分のための PBS のセルを水分補給 Denature RT と PBS で 3 回洗浄の 45 分の 2 N HCl (注意) を用いた DNA 。 注意: 塩酸は腐食性です。適切な個人用保護具を着用し、制度環境健康と安全の手順の指示に従って、腐食性物質を処分します。 PBS の 3 洗浄が続く 5 分 50 mM トリス塩酸 ph 8.8 Neutralize。 室温 1 時間 PBS のトリトン X-100 5% ヤギ血清と 0.1% で作られた加温ブロック バッファー内セル PBS で 3 回 8-オキソ-2´-デオキシグアノシン (8 切断・酸化損傷、1: 400) またはシクロブタン ピリミジン二量体 (CPD、1:1, 000) RT で洗い 1 時間ヤギ血清ブロック バッファー内の一次抗体を加温します。 RT で 1 h 用ヤギ血清のブロック バッファーの配分比率でアレクサ 488 ヤギ抗マウスでセルをインキュベートし、PBS 洗浄 3 回。 PBS で 1: 5000 DAPI (10 mg/mL) を使用して、5 分間核 DNA を染色し、PBS 洗浄 3 回。 使用して場合カバーグラスチェンバー、配置 PBS または PBS + 0.1% アジ化ナトリウム染色の細胞に戻る。プロトコルはここで停止することができます、セル数日間 4 ° C で保存またはセクション 5 で画像取り込みに進みます。 はまた、追加 coverglass は培養器の上に配置できる場合最寄りの実装中に細胞をマウントします。硬化後長期間で、4 ° C でのマウントされた細胞を保存ことができます。 5。画像蛍光実験のため取得 エタノール文化容器の coverglass の底をきれいにし、共焦点顕微鏡ステージの背面に配置。ステージ上の容器の位置や方向の向きに対応位置記録損傷が誘導されたことを確認します。最適な登録および画像処理を確保するための培養器をセキュリティで保護します。 登録法を用いた 以前をイメージ検索フィールドは、(に記載されている 3.2) を選択しました。 の手動登録、coverglass を用いたエッチング グリッド フォーカスと識別マークを見つけるにグリッドをもたらします。使用し、損傷した細胞の XY 座標を記録した。 イメージ ベースの自動登録、ステップ、3.2.1 の参照として使用される構造機能を見つけて、可能な限り記録された画像と密接に現在のライブ顕微鏡ビューを配置します。かつて整列、現在 XY 顕微鏡ステージ位置を測定し、参照画像の XY 位置にそれを比較します。2 つの場所間の直線距離は、X および Y のオフセットを定義します。照射セルを含むイメージ フィールドを識別するために各記録された XY 位置にこのオフセットを適用されます。このオフセット機能を顕微鏡制御ソフトウエアで自動または手動で実行可能性があります。 適切な登録ポイントが識別されなかった場合は手動でスライドをスキャンし、以前に識別されたセル機能の検索によってセルを検索します。 (セクション 2.3 で設定とセクション 3.3 に焦点を当てて) 明視野画像を含め、すべてステンド グラスの対象を収集する適切な顕微鏡の設定を使用して画像を取得します。提示実験マルチ チャンネル画像は次の励起レーザー ラインとの同時を使用して収集された: 405 nm (DAPI) 488 nm (アレクサ 488 や透過 DIC 明視野)、561 nm (Alexa 546)。すべてのレーザーはレーザー波長と消費電力の両方の伝送を制御する単一の音響光学可変フィルターを通過します。 6。ライブ サイトのマイクロ照射する蛍光タンパク質の募集の細胞イメージ解析 オープン (NIS 要素や ImageJ) 画像解析アプリケーションで画像を取得します。必要に応じて、予備照射の画像と事前・事後の損傷誘導の単一のイメージのシーケンスを生成するタイムラプス画像を組み合わせます。ユーザーできます表示募集照射領域に蛍光強度の変更の測定によって全体の核の間で測定した蛍光強度を基準 (代表の結果は、 図 1 を参照してください B。). 測定する各セルの最初に核を表す投資収益率の参照を生成します。核を構成するピクセルが含まれている蛍光信号の閾値処理アルゴリズムを使用して、投資収益率にこの領域を変換します。必要に応じて、参照として、明視野観察を使用して投資収益率を手動で描画できます。核面積正確に、ROI によって覆われていることを確認する時間にわたって投資収益率を調整し、フレームごとにこの ROI 内の蛍光信号の平均蛍光強度を報告します。 測定する各セル 6 x 6 ピクセルの投資収益率を作成し、経過の各フレームの損傷の投資収益率の上に置きます。この大きな ROI は今損傷 ROI 分析のためです。各フレームの平均投資収益率の蛍光強度を報告します 。 注: ほとんどの市販の画像解析ソフトには 2 D 物体追跡のためのモジュールが含まれます、ワークフローのスピードアップと高いスループット (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ を参照) を容易にするユーザー開発の ImageJ やフィジーのマクロの数があります。 は、タイムラプスの各フレームに対応する参照 ROI の平均被害 ROI の蛍光強度を標準化します。投資収益率の参照として平均核蛍光強度を使用するここでは、(代表の結果は、 図 1 を参照). 平均から平均参照 ROI の蛍光強度を差し引くことによって正規化を実行できますROI の蛍光強度の損傷または平均を割って損傷投資収益率 ROI の蛍光強度の平均の参照によって蛍光強度 。 注: 分割による正規化は、非常に低い基準強度値との状況で使用する場合、予期しない結果を生じることができます。 は、少なくとも 2 つのコントロールは、無傷の細胞だけでなく、すべての損傷した細胞を繰り返します。必要な場合は、さらに正規化の制御細胞の結果を使用できます。 グラフは実験的な治療の機能として募集のダイナミクスの変化が表示に時間をかけて強度値を正規化します。 7。画像解析, 蛍光抗体法によって検出される蛋白質募集 オープン前と後の被害画像画像解析アプリケーション。前損傷画像には、ROI(s) 使用マイクロ照射損傷が含まれています。標的細胞を識別する後損傷画像に、ROI(s) をコピーして貼り付けます。 のタンパク質募集分析の 6 x 6 ピクセルの投資収益率を生成し、ROI の損傷の場所でこの投資収益率。この大きな ROI は今損傷 ROI 分析のためです。投資収益率の蛍光強度の平均の破損を報告します。 は、対応する参照 ROI の平均被害 ROI の蛍光強度を標準化します。投資収益率の参照として傷つけられた細胞の平均の核の蛍光強度を使用するここでは、(代表の結果は、 図 1 を参照)。DAPI 信号閾値アルゴリズムを使用して、核を定義する参照の投資収益率を生成し、この地域を投資収益率に変換します。平均参照 ROI の蛍光強度を報告します。正規化 ROI の蛍光強度の平均の被害から平均参照 ROI の蛍光強度を差し引くことによってまたは平均被害 ROI 蛍光強度で割って平均参照 ROI 蛍光強度によって実行できます 。 注: 分割による正規化は、非常に低い基準強度値との状況で使用する場合、予期しない結果を生じることができます。 すべての損傷した細胞に繰り返し、前述のように少なくとも 2 つの制御細胞の同じ分析を実行します。 グラフは実験的な治療の機能として募集蛋白質または DNA 損傷の種類の変更を表示する時間に対してマイクロ照射イベントを測定各強度値を正規化します。