JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

تطبيق الليزر الجزئي-التشعيع لدراسة واحدة ومزدوجة حبلا كسر إصلاح في خلايا الثدييات

Published: September 05, 2017
doi:
10.3791/56265
, ,
1Department of Oncologic Sciences,University of South Alabama Mitchell Cancer Institute

Summary

الأسفار [كنفوكل] مجهرية والليزر أدوات العرض الجزئي-التشعيع لإحداث ضرر الحمض النووي، ورصد الاستجابة للبروتينات إصلاح الحمض النووي في المجالات النووية الفرعي المحدد. هذا الأسلوب قد دفعة قوية لمعرفتنا بالكشف عن الأضرار، والإشارات، والتوظيف. هذه المخطوطة يوضح هذه التكنولوجيات لدراسة إصلاح كسر حبلا مفردة ومزدوجة.

Abstract

وتوجد مسارات إصلاح الحمض النووي درجة عالية من التنسيق لكشف والمكوس واستبدال التالف قواعد الحمض النووي، وتنسيق إصلاح فواصل حبلا الحمض النووي. بينما يكون توضيح تقنيات البيولوجيا الجزيئية هيكل ووظائف الانزيمية والحركية لإصلاح البروتينات، لا تزال هناك حاجة لفهم كيف يتم إصلاح منسقة داخل النواة. الليزر الجزئي-التشعيع يوفر أداة قوية لإحداث أضرار الحمض النووي ورصد تجنيد إصلاح البروتينات. تحريض تلف الحمض النووي بالليزر الجزئي-التشعيع يمكن أن تحدث مع مجموعة من الأطوال الموجية، وموثوق بها يمكن أن يستحث المستخدمين فواصل جديلة واحدة وآفات قاعدة مزدوجة حبلا فواصل مع طائفة من جرعات. هنا، يستخدم الليزر الجزئي-التشعيع لدراسة إصلاح واحد وضعف حبلا فواصل الناجمة عن موجات ليزر [كنفوكل] المشتركة اثنين، 355 نانومتر و 405 نانومتر. ويرد توصيف المزيد والسليم من جرعة الليزر التطبيقية لحفز الخلائط أضرار محددة، حيث يمكن للمستخدمين تنفيذ تكاثر الحصول على البيانات الدقيقة-التشعيع الليزر والتحليل.

Introduction

مجهر فلوري برز كتقنية قوية لتصور البنية الخلوية ودراسة التعريب البروتين، ورصد تفاعلات البروتين البروتين والبروتين-الحمض النووي. استخدام مجهر فلوري لدراسة الردود تلف الحمض النووي بعد تطبيق الحمض النووي العالمي إتلاف عوامل، مثل الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الضوء، الإشعاعات المؤينة، والأكسدة الكيميائية أو وكلاء alkylating، و/أو تشريعات وفرت ثاقبة جديدة بدء، إشارات، والتجنيد للحمض النووي إصلاح البروتينات إلى مواقع الحمض النووي الضرر1،2. ومع ذلك، تحد هذه العالمية والأضرار بأحداث متزامنة إذا معلومات مفصلة حول أمر التعيين، حركية الارتباط أو الانفصال، ويجري البحث عن العلاقات بين البروتينات إصلاح الحمض النووي الرئيسية. لحسن الحظ، التقدم في ليزر المسح مجاهر [كنفوكل]، توفر أوسع نطاقا من موجات الليزر يحفز الضرر، والتحسينات في البروتينات الفلورية على مدى السنوات ال 25 الماضية قدمت الباحثين مع أدوات محسنة لدراسة هذه إصلاح جوانب من الحمض النووي، عن طريق الاستقراء أضرار الحمض النووي المستهدف.

تشعيع الخلايا التي تحتوي على microbeams الليزر من أجل دراسة وظائف الخلايا وسوبسيلولار أداة راسخة في بيولوجيا الإشعاع والخلية3. تطبيق هذه التقنية لدراسة إصلاح الحمض النووي ظهرت عند استخدام الأشعة فوق البنفسجية درجة عالية من التركيز كريمر وزملاء العمل (257 nm) نظام ميكروبيام الليزر للحث على أضرار الحمض النووي أكثر 0.5 ميكرومتر بقعة في الهامستر الصيني المبيض (شو) خلايا4 والمنشأة تحريض الحمض النووي فوتوليسيونس بهذا النظام5. في حين تقدم تحسينات كبيرة على أساليب ميكروبيم الأشعة فوق البنفسجية في الوقت، اعتماد هذا إتلاف النظام كانت محدودة بسبب إعداد متخصصة، وقدرتها على توليد فواصل حبلا مزدوجة (دسبس)6. التحقيق اللاحق لمجموعة متنوعة من الأشعة فوق البنفسجية والأشعة فوق البنفسجية-باء (290-320 nm)-كشف الأطوال موجية (320-400 نانومتر) بعدد من المجموعات أن الأشعة فوق البنفسجية برومة، عنصر مؤكسد قاعدة الآفات، فواصل جديلة واحدة (SSBs)، ويمكن أن يتسبب دسبس تعتمد على الطول الموجي الليزر و تطبق السلطة4،،من78،9،10 (إعادة النظر في 3). علاوة على ذلك، تركيبات من هذه الأشعة فوق البنفسجية-باء وأطوال موجات الأشعة فوق البنفسجية-أ مع توعية وكلاء، مثل سورالين، بروموديوكسيوريديني (بردو)، والأصباغ هويشت، عثر أيضا للحث على أضرار الحمض النووي يعتمد على الطول الموجي، والطاقة، ومدة التعرض، على الرغم من أن السلطة بحاجة إلى حمل غالباً ما يخفض الضرر حضور هذه العوامل12،11،13،،من1415. هذه التطورات بتوسيع نطاق استخدام مايكرو-التشعيع، على الرغم من وجود عقبات فنية لا يزال يتعين معالجتها للتوسع في اعتماد هذه الأساليب.

كريمر وزملاء العمل دفعة قوية لمجال تشعيع الصغرى بالتحديد التركيز ميكروبيم الأشعة فوق البنفسجية لتطبيق الطاقة ضررا كبيرا على منطقة عالية مترجمة في الخلية. كما نظم الليزر ميكروديسيكشن ومجاهر [كنفوكل] متقدمة, الضوء تركيزاً كان موجوداً على نطاق أوسع؛ ومع ذلك، أن اقتران مصادر الأشعة فوق البنفسجية إلى نطاقات والتعامل مع الانحرافات اللونية التي يتسبب فيها أنها لا تزال تحديات كبيرة لمعظم المستخدمين3،،من616. صبغات الأشعة فوق البنفسجية زادت شعبية طوال عقد التسعينات، البصريات قادرة على التركيز والالتقاط fluorescence متحمس الأشعة فوق البنفسجية وأصبحت متاحة على نطاق واسع16، والتحسينات في ليزر المسح عرض المستخدمين القدرة على إنشاء عالية تركز الأشعة فوق البنفسجية البقع الإثارة داخل الخلايا6،17. ومع ذلك، لم يكن حتى أوائل 2000s أن التأثير الحقيقي لهذا المزيج من عوارض تركيزاً مع أعلى كثافة الليزر شعر، عندما ظهرت تقارير عديدة تثبت أن فواصل حبلا الحمض النووي يمكن أن يتسبب مع أو بدون محسسات في نطاق الأشعة فوق البنفسجية-أ6،10،18،،من1920، 405 نانومتر21،،من2223،24، 26من 25،، وحتى في فترة أطول موجات مرئية مثل 488 نانومتر27. هذه التطورات التي تسمح باعتماد تقنية التشعيع الصغرى في عدد من النظم التجارية أكثر انتشارا. وبالتوازي مع هذه التطورات، ظهرت تقنيات اثنين-فوتون أيضا السماح للاستقراء الدقيق من تلف الحمض النووي؛ على الرغم من أن هذه التطورات لن تناقش هنا، هناك عدد من المقالات الاستعراض مناقشة هذه المنهجيات9،28،،من2930.

مع إمكانية الوصول إلى الحالي مجاهر [كنفوكل] القادرة على ضوء الأشعة فوق البنفسجية شديدة التركيز وتوافر البروتينات الفلورية للسماح بتتبع في الوقت الحقيقي من البروتينات إصلاح الحمض النووي على نطاق واسع، قد تطورت تقنيات التشعيع الصغرى أدوات قوية لدراسة مسارات استجابة وإصلاح أضرار الحمض النووي. ومع ذلك، يحتاج المستخدمون إلى يجب أن تدرك أن تعتمد اعتماداً كبيرا على طول موجه الليزر والطاقة المطبقة على المنطقة النووية دون توليد ضرر الحمض النووي. استخدام الأشعة فوق البنفسجية-ج (~ 260 nm) أطوال موجية تسمح مباشرة الحمض النووي الإثارة وانتقائية عالية لاستحثاث الأشعة فوق البنفسجية برومة7،8. الأشعة فوق البنفسجية-باء وأطوال موجات الأشعة فوق البنفسجية-أ إنتاج مخاليط تلف الحمض النووي (الآفة الأساسية و SSBs دسبس)، التي تعتمد على قوة التطبيقية والخلفية الخلوية تستخدم7. الضيائية الذاتية ومستويات مضادات الأكسدة في الخلايا المستهدفة يمكن أن تؤثر الخلائط تلف الحمض النووي التي تنتجها هذه الأطوال الموجية. بالإضافة إلى ذلك، استخدام الضيائية خارجية (بردو، إلخ) يمكن أن تساعد في خفض الطاقة اللازمة لاستحثاث تلف الحمض النووي. ومع ذلك، هذه العوامل يمكن حمل الحمض النووي الضرر بأنفسهم، وأنهم قد يغير دورة الخلية وهيكل الكروماتين، حيث أن استخدامها قد تحدث آثاراً غير مرغوب فيها التي يتعين النظر فيها من قبل المستخدم. ولذلك، قبل استخدام التشعيع الجزئي لدراسة استجابة ضرر الحمض النووي، وإصلاح، النظر بعناية في مسار إصلاح الحمض النووي للفائدة وأطوال موجية متوفرة للاستخدام، والخليط تلف الحمض النووي التي تم إنشاؤها مطلوب.

هنا، يتم إجراء الليزر الجزئي-التشعيع عند أطوال موجية استخداماً اثنين، 355 نانومتر و 405 نانومتر، دون محسسات لإثبات الخلائط الحمض النووي الضرر الناجم عن هذه الأطوال الموجية وتأثيرات هذه المخاليط الضرر يكون على دراسة الإصلاحSSBs ودسبس. المستخدمين يجب أن تدرك أن هذه الأطوال الموجية لا تقم بإنشاء نوع واحد من فواصل حبلا أو الآفات الأساسية. كي تميز بين مسارات إصلاح الحمض النووي، المستخدمين يجب بعناية سيطرة القوة المطبقة على منطقة محددة من النواة وتوصيف الأضرار العمدي باستخدام عدة علامات فاصل حبلا والأجسام المضادة للآفة الحمض النووي. إذا أحسن تطبيقها وتتميز، يمكن أن تثري الليزر الجزئي-تشعيع بعض الأنواع من ضرر الحمض النووي، مما يسمح للمستخدمين لتقييم إصلاح قاعدة الآفات و SSBs أو دسبس، مع بعض الخصوصية. ولذلك، فقد وفرنا أسلوب يسمح للمستخدمين بإجراء الليزر الجزئي-التشعيع تكاثر وتوصيف الخلائط تلف الحمض النووي الناجم عن جرعة الليزر التطبيقية، والقيام بتحليل البيانات.

Protocol

1-“زراعة الخلايا” وتوليد خلايا مستقرة الخلايا تنمو تشو-K1 في المتوسطة الأساسية الحد الأدنى تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين. الحفاظ على الخلايا في حاضنة هوميديفيد مع 5% CO 2 في 37 درجة مئوية. ترانسفيكت شو-K1 الخلايا مع 1 ميكروغرام بلازميد الحمض النووي الذي يحتوي على XRCC1 البشرية مع ج-محطة الأخضر العلامة بروتين فلوري (التجارة والنقل) باستخدام كاشف تعداء تجارية اتباع الشركة المصنعة ' تعليمات s- حدد تشو-K1 خلايا ستابلي معربا عن البشرية الانصهار XRCC1-التجارة والنقل باستخدام 800 ميكروغرام/مل جينيتيسين، وإثراء السكان إذ تعرب عن XRCC1-التجارة والنقل باستخدام fluorescence مساعدة الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)- لوحة خلايا أن يكون المشع الصغرى في الأوعية الثقافة مع قيعان كوفيرجلاس، حيث أنها تصل إلى حوالي 75% أو كونفلوينسي أكبر في اليوم التالي. بعض المسافات بين الخلايا المرغوب فيه، لا سيما إذا كان استخدام التسجيل للعودة إلى نفس حقل الصورة (الموصوفة في المقطع 3.2)- 2. إنشاء مجهر حدد المسح الضوئي الليزر [كنفوكل] مجهر مجهزة بأشعة الليزر مناسبة، والبصريات، وبرنامج حاسوبي لمراقبة للصغير-التشعيع/فوتوستيموليشن. عرض تجارب استخدام ليزر المسح مجهر [كنفوكل] التي تم تعديلها لتشمل ليزر نانومتر 355، إلى جانب الألياف إلى مينيسكانير فوتواكتيفيشن جلفانومتر والتحكم باستخدام الشركة المصنعة ' s برامج المراقبة والتحليل. يمكن تنفيذ هذا النظام الجزئي-التشعيع في منطقة المستخدم المعينة للفائدة (ROI) باستخدام مينيسكانير فوتواكتيفيشن (355 نانومتر الليزر) أو جلفانومتر [كنفوكل] القياسية (405 نانومتر الليزر)- تحديد الطول الموجي لاستخدامها التشعيع الصغرى، ضمان أن جميع المكونات البصرية في لايتباث الصغرى-التشعيع مناسبة للطول الموجي الذي تم اختياره. ملاحظة: يستخدم النظام عرض 40 × ج-أبوتشرومات (الفتحة العددية (غ) 1.2) هدف غمر نفط جنبا إلى جنب مع مكعب تصفية الأشعة فوق البنفسجية ل 355 نانومتر الصغرى-التشعيع و 20 × ج-أبوتشرومات (نا 0.75) هدف جافة باستخدام لايتباث [كنفوكل] القياسية للدقيقة nm 405-التشعيع. الهدف × 20 المستخدمة في الإعداد غير متوافق مع الطول الموجي نانومتر 355؛ ولذلك استخدمنا 40 × 355 نانومتر فقط. استخدام الهدف الجافة لإتلاف تسمح البروتوكولات الفلورة ستطبق المصب دون تنظيف قبالة الغمر النفط، وهو لماذا نستخدم هذا الهدف عندما يكون ذلك ممكناً- تكوين المجهر للتجربة الدقيقة-التشعيع. للحفاظ على التناسق بين التجارب، تعيين تكوين موحد مكونات المجهر لاستخدامها لكل نوع من أنواع الإشعاعات الدقيقة. حفظ هذه الإعدادات كإعداد مسبق داخل المجهر ' s تشغيل البرمجيات، إذا كان ذلك ممكناً- ملاحظة: في النظام، وقدم الخلايا الدقيقة المشع وتصويرها باستخدام المسح الضوئي أحادي الاتجاه ودقة المسح الضوئي 1024 × 1024 بكسل مع 1 x التكبير المسح الضوئي، 8 من الإطارات في الثانية (fps)، ومع الثقب بمعدل إطار تعيين إلى ما يقرب من 4 وحدات مهواة (AU)، كما تحديد 488 نانومتر الليزر (69 ميكرومتر). تم اختيار هذا الإعداد الثقب المفتوحة إلى أقصى حد من كمية الضوء التي استولت في كل صورة، والسماح باستخدام التصوير القوى ليزر أقل والحد من فوتوبليتشينج- 3. الليزر الجزئي-تشعيع المكان الذي أعد الطبق الثقافة، التي تحتوي على خلايا ذات الاهتمام، على مرحلة مجهر وقفل بشكل أمن في مكانة. إذا كان متوفراً، مكان الشريحة غرف في حاضنة مرحلة أعلى والحفاظ على عند 37 درجة مئوية مع 5% CO 2 خلال التعريفي الضرر. هذه الخطوة الأهم بالنسبة لخلية يعيش timelapse التصوير أو التصوير دورات طويلة. وإلا مكان الخلايا في المجهر المرحلة وأداء التشعيع في درجة حرارة الغرفة (~ 25 ˚C)، ثم عد الخلايا بسرعة إلى حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5% CO 2. تسجيل حقول الصورة للسماح للباحث بالعودة إلى نفس الموقع بعد إجراء التثبيت أو تلطيخ أو غيرها من الإجراءات. إجراء تسجيل الحقول التالفة باستخدام مرحلة مجهر المرمزة، الآلي أو خلية ثقافة كوفيرجلاس السفن مع شبكة محفوراً أو مسماة من مواقع س وص. في حالة استخدام برنامج تسجيل الصورة، حدد سمة يمكن التعرف عليه من السفينة الثقافة (أي الزاوية كوفيرجلاس أو حاجز بين الآبار)، وجمع صورة، وتسجيل موقع س وص. هذا سوف يسمح للمحاذاة وتسجيل المواقع س وص للحقول المحددة التالية إعداد عينة- إذا كان استخدام التسجيل اليدوي، سجل الشبكة أو مواقع محفوراً لكل حقل يدوياً، مع الحرص على تسجيل التوجه ووضع الطبق على المسرح- إذا تتوفر لا ميزات تحديد السفن ثقافة الخلية، حدد الحقول التالفة بالفحص البصري مورفولوجيا الخلايا والكثافة. الحرص على تحديد الحقول بميزات متميزة بما فيه الكفاية ليكون التعرف عليها أثناء وبعد التصوير- ملاحظة: هذا يمكن أن يكون مضيعة للوقت لتنفيذ ما لم توجه ومنطقة السفينة الثقافة مقيد بأحكام. حدد حقل التشعيع الصغرى، والتركيز العينة. للتعبير عن البروتينات المسماة فلوريسسينتلي الخلايا، حدد المستوى البؤري مع المقطع العرضي النووية القصوى في قناة الفلورسنت للفائدة. للخلايا لا تعرب عن المسمى البروتينات، أو للذين لا يملكون التعريب النووية واضحة، يمكن استخدام التباين المرحلة أو التدخل التفاضلية التباين (DIC) تصوير للعثور على الطائرة التنسيق الصحيح. ​ ملاحظة: ميزة مفيدة من مرحلة التباين وتصوير DIC هو حقيقة أن المستوى البؤري يتحرك من خلال العينة، يمكن أن تظهر نفس الميزة الضوء أو الظلام تبعاً للمستوى البؤري النسبي. حدد سمة واضحة داخل النواة، مثل نوية، وتحريك المستوى البؤري صعودا وهبوطاً أثناء مراقبة هذا التغيير في مظهر. المستوى البؤري الحقيقي تكمن في الانتقال من الضوء إلى الظلام. لتركيز العينة، حدد المستوى البؤري الذي لديه الميزة المحددة على النقيض أشد. تسجيل موقف مجال الاهتمام. إنشاء مربع 3 × 3 بكسل دوروا داخل برنامج المجهر ومكان هذا العائد على الاستثمار أكثر من نواة خلية أن تتلف وتعيين عائد هذا الاستثمار أن يكون الضرر العائد على الاستثمار- جمع صورة أضرار السابقة، بما في ذلك موقف الضرر العائد على الاستثمار. للتجارب التي لا تستخدم البروتينات الفلورية، واكتساب المرحلة عالي التباين أو الفرق تدخل (DIC) برايتفيلد صورة تباين تحديد وتسجيل الأنوية للضرر- لخلية يعيش تجارب استخدام البروتينات الفلورية، والحصول على صورة تحتوي على برايتفيلد والقناة الأسفار للبروتين للفائدة (أي، الليزر خط 488 نانومتر للإثارة للتجارة والنقل، الليزر خط 561 نانومتر للإثارة لطلب تقديم العروض). في تجارب باستخدام XRCC1 شو-K1-بروتينات فلورية خضراء، جمعت الأسفار متحمس 488 نانومتر الليزر خط في نفس الوقت مع قناة برايتفيلد DIC المنقولة. أضرار الليزر والشروع. في منظومة المقدمة، أمضى مراقبة جرعة الليزر بإجمالي وقت المسح الضرر العائد على الاستثمار. يعمل جلفانومتر الليزر 355 من شمال البحر الأبيض المتوسط بمعدل ثابت المسح الضوئي، جرعة الليزر يتم التحكم بالوقت الذي يقضيه مرارا وتكرارا مسح الأضرار المحددة العائد على الاستثمار: في البيانات المقدمة هنا، تشعيع الصغرى في 355 نانومتر يتم تنفيذ 2 و 10 ثانية. على النقيض من ذلك، التحكم 405 نانومتر جرعة الليزر بتحوير سرعة التفحص وإجراء فحص واحد من الضرر المحدد العائد على الاستثمار. في ف البياناتاستياء هنا، استخدم 8 وفي الثانية 0.5 التشعيع الصغرى في 405 نانومتر. المسح الضوئي بمعدل 8 في الثانية يسلم جرعة ليزر أقل من 0.5 إطارا في الثانية، لأن الليزر وتنفق وقتاً أقل في كل بكسل أثناء الفحص. كلا الليزر تدار بقوة 100%. راجع المقطع 3.7 للحصول على إرشادات حول قياس طاقة الليزر مباشرة. ملاحظة: قد تختلف كل نظام المجهر الفردية في كيفية تسليم السلطة الليزر لعائد معينة، 355 مماثلة إلى كيف نانومتر و 405 نانومتر تختلف في النظام قدم. سيحتاج المستخدمون إلى تحديد هذا الإجراء لنظامهم مجهر وتقرير هذه المعلمات داخل الأقسام أساليب لها. للتصوير الخلية الحية، وتؤدي timelapse الحصول على الصور من قنوات برايتفيلد والأسفار. ضبط مدة وتواتر timelapse لتحسين جمع البيانات والتقاط مثالي تراكم بروتين فلوري في الضرر العائد على الاستثمار، والانفصال عن التجربة على مدى الوقت. تجارب باستخدام XRCC1-التجارة والنقل التي جمعت صور كل 30 ثانية لمدة 20 دقيقة- ​ ملاحظة: تكرار تصوير timelapse يمكن أن تكون محدودة بسبب فوتوبليتشينج فلوروفوري، إلى تعقيد التحليل من تراكم والانفصال. ويمكن تقييم فوتوبليتشينج بمراقبة الخلايا غير التالفة خلال timelapse وضبط شروط اقتناء للتقليل من فقدان إشارة مضيئة في هذه الخلايا غير التالفة. قد تكون بعض فوتوبليتشينج أمرا لا مفر منه، حيث أن المستخدمين قد تعوض عن فقدان إشارة بتطبيع كثافات الفلورسنت من الخلايا التالفة إلى تلك الخلايا غير التالفة في كل إطار من timelapse. بعد اكتمال الدورة الزمنية، حدد حقل جديد من الخلايا للضرر أو إصلاح الخلايا التالفة لمزيد من التحليل، كما هو موضح في القسم 4- المتابعة الدقيقة-التشعيع والتصوير timelapse حتى يتم التوصل إلى العدد المطلوب من الخلايا التالفة. ​ ملاحظة: نوصي بإتلاف مجموعة خلايا 10-25 كل الشرط المحدد بغية تقييم التغايرية خلية إلى استجابة للأضرار العمدي. على الرغم من أن معظم النظم [كنفوكل] تسمح للمستخدمين للضرر أكثر من خلية واحدة خلال كل الصغرى-التشعيع، وهذا يقدم مرات بدء الأضرار متداخلة، التي تؤدي إلى تعقيد تحليل وقت الذروة التوظيف على عدد كبير من الخلايا أو وقت الانفصال للأحداث بسرعة. في بعض النظم، قد تقلل التعريفي الضرر المتزامنة على مدى عدة رويس الجرعة الليزر التي تلقاها كل عائد الاستثمار المستقلة. ذلك، ما لم تعالج هذه القضايا توقيت/السلطة مباشرة قبل المستخدم، فمن المستحسن أن يكون معطوباً خلايا منفردة. لإجراء تحليل حسب الفلورة (إذا كان)، الضرر وأما فورا إصلاح الخلايا، كما هو موضح في القسم 4، أو السماح للخلايا لإصلاح للزيادات المحددة من الوقت (أي، 1، 5، 10 أو 20 دقيقة). بعد انقضاء الوقت المطلوب، إصلاح ووصمة عار في الخلايا، كما هو مفصل في الباب 4. لزيادة عدد الخلايا الشاملة لتحليل إذا، وإتلاف حقول إضافية داخل السفينة الثقافة لتوليد دورة وقت حقول متعددة من رد الأضرار اللاحقة. سجل موقع س وص لكل حقل، والوقت الذي حدث فيه الضرر. بعد العدد الإجمالي المطلوب إصلاح انقضاء الوقت، وإصلاح ووصمة عار الخلايا كما هو مفصل أدناه. بعد مراقبة التوظيف البروتين عند الجرعات المحددة، قياس وتقرير الليزر السلطة مستويات الألياف بعد وبعد الهدف دقة توصيف وتقرير الليزر الجرعات. ونحن نستخدم مقياس طاقة رقمية مدمجة واثنين من رؤساء أجهزة الاستشعار الضوئي المختلفة؛ واحد بالإضافة إلى ألياف الليزر لقياس إنتاج الألياف بعد مباشرة، وأخرى وضعت في مرحلة مجهر لقياس الناتج بوستوبجيكتيفي. لقياس قوة الليزر ووضع أجهزة الاستشعار في التكوين الذي تريده (الألياف بعد أو بوستوبجيكتيفي) وأداء تشعيع الجزئي كما هو موضح أعلاه، أثناء تسجيل القياسات التي أجريت بمقياس الطاقة. انتبه إلى أن معدل أخذ العينات من مقياس الطاقة قد لا تكون سريعة بما يكفي لالتقاط الأحداث الصغرى-التشعيع سريعة جداً، حيث قد يكون من الضروري تشغيل تكرارات متعددة من التجربة إلى التأكد من أن مقياس الطاقة بدقة الكشف عن الجرعة المطبقة. ملاحظة: الليزر 355 من شمال البحر الأبيض المتوسط، قمنا بقياس قوة ذروة متوسط حوالي 5 ميغاواط بعد الألياف وحوالي 19 µW بعد الهدف. الليزر 405 من شمال البحر الأبيض المتوسط، أجرى تشعيع الصغرى في حلقات التكرار 30 للتغلب على معدل 0.01 s العينات الحد الأقصى من مقياس الطاقة، وصلاحيات ذروة متوسط 1.5 ميغاواط و 2.4 ميغاواط كانت تقاس باستخدام المسح الضوئي بسرعة 8 و 0.5 من الإطارات في الثانية الواحدة ، على التوالي. ويختلف كل عداد الطاقة. سوف يحتاج المستخدمون لتحديد الأطوال الموجية التشغيلية ومعدلات أخذ العينات لقوتهم الفردية المتر. 4. الفلورة تلطيخ إجراءات تحليل حبلا كسر التعريفي تلطيخ إذا. الخلايا الإصلاح مع 3.7% فورمالدهايد (تنبيه) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) 10 دقيقة Aspirate فورمالدهايد الحل ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. يمكن إيقاف البروتوكول هنا بوضع برنامج تلفزيوني مرة أخرى على الخلايا، ويمكن تخزينها في الخلايا في 4 ˚C لمدة تصل إلى أسبوع واحد. تنبيه: فورمالدهايد سامة ومسببة للسرطان. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة والتخلص من المواد السامة كتعليمات بالإجراءات الصحية وسلامة البيئة المؤسسية- بيرميبيليزي الخلايا باستخدام 0.25% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) ويغسل ثم 3 مرات مع PBS. كتلة جسم غير محددة ملزمة بحضانة لمدة 30 دقيقة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1% البقري ألبومين المصل (BSA) في الرايت إينكوباتي مع monoclonal antibody الأولية ضد γH2AX وجسم [بولكلونل] الأولية ضد 53BP-1 كلاهما المخفف 1:750 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1% جيش صرب البوسنة ح 1 في RT، ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. الخلايا إينكوباتي مع 488 أليكسا الماعز المضادة الماوس و 546 أليكسا الماعز الأرنب لمكافحة كل المخفف 1:2000 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1% جيش صرب البوسنة ح 1 في الرايت، ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. وصمة عار الحمض النووي مع حل 10 ملغ/مل من DAPI (4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي، الحذر) المخفف بينها في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، أو استخدام الصبغة النووية قابلة للمقارنة ومن ثم أغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. تنبيه: DAPI والمطفرة والسمية. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة والتصرف مادة سامة حسب تعليمات الإجراءات الصحية وسلامة البيئة المؤسسية- أزيد الصوديوم مكان برنامج تلفزيوني أو برنامج تلفزيوني + 0.1% (تحذير) مرة أخرى على الخلايا الملون. يمكن إيقاف البروتوكول هنا والخلايا المخزنة في 4 ˚C لعدة أيام، أو الشروع في الحصول على الصور في القسم 5- ​ تنبيه: أزيد الصوديوم السامة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة والتخلص من المواد السامة حسب تعليمات الإجراءات الصحية وسلامة البيئة المؤسسية- التعريفي تحليل قاعدة الآفات أو الحمض النووي adducts تلطيخ إذا. الإصلاح وبيرميبيليزي الخلايا في الميثانول المثلج (تحذير) لمدة 20 دقيقة في-20 درجة مئوية. تنبيه: الميثانول السامة والقابلة للاشتعال. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة والتصرف مادة سامة حسب تعليمات الإجراءات الصحية وسلامة البيئة المؤسسية- نضح ليثانول والسماح بالعينة لتجف تماما عن 15 دقيقة البروتوكول يمكن أن يتوقف هنا والجاف لمدة تصل إلى 3 أيام للخلايا المخزنة في ˚C-20- ترطيب الخلايا في برنامج تلفزيوني عن 15 دقيقة Denature الحمض النووي باستخدام 2 N HCl (تحذير) لمدة 45 دقيقة في الرايت ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. تنبيه: HCl التآكل. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة والتصرف مادة أكالة حسب تعليمات الإجراءات الصحية وسلامة البيئة المؤسسية- تحييد في pH 50 مم تريس-HCl 8.8 لمدة 5 دقائق ثم يغسل 3 مع برنامج تلفزيوني. خلايا إينكوباتي في المخزن المؤقت لحظر المصنوعة من مصل الماعز العادي 5% و 0.1% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني عن ح 1 في الرايت إينكوباتي مع الأجسام المضادة الأساسي 8-أوكسو-2´-ديوكسيجوانوسيني (أوكسودج-8, 1: 400) أو سيكلوبوتاني بيريميدين ديمر (وثيقة البرنامج القطري، 1:1، 000) في مصل الماعز حظر المخزن المؤقت ح 1 RT، وتغسل ثم 3 مرات مع PBS. احتضان الخلايا مع أليكسا 488 الماعز الماوس المضادة بنسبة 1:2000 في مصل الماعز حظر المخزن المؤقت ح 1 في الرايت، وتغسل 3 مرات مع PBS. وصمة عار الحمض النووي باستخدام بينها DAPI (10 مغ/مل) في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ويغسل 3 مرات مع PBS. في حالة استخدام كوفيرجلاس غرف، وضع برنامج تلفزيوني أو برنامج تلفزيوني + أزيد الصوديوم 0.1% يعيدوه الخلايا الملون. يمكن إيقاف البروتوكول هنا والخلايا المخزنة في 4 ˚C لعدة أيام، أو الشروع في الحصول على الصور في القسم 5- وبدلاً من ذلك، جبل الخلايا في وسط تصاعد المفضل، إذا كان كوفيرجلاس إضافية يمكن أن توضع على رأس سفينة الثقافة. وبمجرد الشفاء، يمكن تخزين الخلايا المحملة في 4 ˚C لفترات طويلة من الوقت. 5. التقاط صور لتجارب الفلورة تنظيف الجزء السفلي كوفيرجلاس السفينة الثقافة مع الإيثانول ووضعه مرة أخرى في مرحلة مجهر [كنفوكل]. التأكد من أن يتوافق مع الاتجاه وموضع السفينة في المرحلة بالتوجه وتسجيل الموقف عندما كان الناجمة عن الأضرار. تأمين ثقافة السفينة لضمان التسجيل الأمثل والتصوير- تحديد موقع سبق تصويرها الحقول باستخدام تقنية التسجيل المحدد (الموصوفة في 3.2). للتسجيل اليدوي باستخدام كوفيرجلاس مع شبكة محفوراً، إحضار الشبكة إلى التركيز وإيجاد تحديد علامات. ثم سجلت استخدام إحداثيات س وص لتحديد موقع الخلايا التالفة. التسجيل الآلي القائم على الصورة، حدد موقع سمة هيكلية تستخدم كمرجع في خطوة 3.2.1، ومحاذاة ثم رأي المجهر العيش الحالي عن كثب للصورة المسجلة قدر الإمكان. بمجرد الانحياز، قياس س وص مجهر مرحلة الموقع الحالي ومقارنته بموقع س وص الصورة المرجعية. وتعرف المسافة الخطية بين الموقعين الإزاحة X و Y. تنطبق هذه الإزاحة لكل موقع مسجل س وص لتحديد الحقول الصورة الذي يحتوي على الخلية المشع. هذه الدالة المقابلة قد تكون الآلي في برامج التحكم مجهر أو تنفيذ يدوياً. إذا كان يمكن تحديد لا نقاط التسجيل المناسب، يدوياً تحديد موقع الخلايا بمسح الشريحة وتحديد ملامح الخلية التي تم تحديدها سابقا. الحصول على الصور باستخدام إعدادات مجهر المناسبة لجمع الملون جميع الأهداف، بما في ذلك صورة برايتفيلد (الإعداد في الفرع 2-3 والتركيز في القسم 3.3). في التجارب المعروضة، جمعت صور متعددة باستخدام خطوط الليزر الإثارة و fluorophores التالية: 405 نانومتر (DAPI)، 488 نانومتر (488 أليكسا والمنقولة DIC برايتفيلد)، و 561 نانومتر (أليكسا 546). جميع أجهزة الليزر تمر من خلال عامل تصفية الانضباطي أكوستو بصري واحد السيطرة على انتقال كل من الطول الموجي الليزر والطاقة- 6. يعيش خلية تحليل الصور التجنيد للبروتينات الفلورية إلى المواقع الدقيقة المشع حصلت فتح الصور في تطبيق تحليل صورة (أي عناصر شيكل أو إيماجيج). إذا لزم الأمر، تجمع بين الصورة قبل التشعيع مع الصور timelapse لإنشاء تسلسل صورة واحدة من تحريض الضرر ما قبل وما بعد. المستخدمين يمكن إظهار التوظيف بقياس التغيرات في شدة الفلورسنت فوق منطقة المشع النسبي لشدة الأسفار قياسها عبر نواة كاملة (انظر نتائج الممثل الرقم 1 ب. ). لكل خلية يمكن قياسها، أولاً إنشاء مرجع عائد الاستثمار الذي يمثل النواة. استخدام خوارزمية عتبة على إشارة الفلورسنت التي تحتوي على وحدات البكسل التي تشكل النواة ومن ثم تحويل هذه المنطقة إلى عائد. إذا لزم الأمر، يمكن استخلاص دوروا يدوياً باستخدام برايتفيلد كمرجع. ضبط دوروا على مدار الساعة لضمان دقة مشمولة في المجال النووي العائد على الاستثمار، وتبلغ كثافة fluorescence يعني إشارة مضيئة داخل هذا العائد على الاستثمار لكل إطار. لكل خلية قياس إنشاء 6 × 6 بكسل دوروا ووضعه على مدى الضرر العائد على الاستثمار لكل إطار الدورة الزمنية. هذا العائد على الاستثمار أكبر الآن الضرر العائد على الاستثمار للتحليل. تقرير متوسط كثافة fluorescence العائد على الاستثمار لكل إطار. ملاحظة: برنامج تحليل الصور التجارية الأكثر يحتوي على وحدات لتعقب كائن ثنائي الأبعاد، وهناك عدد من وحدات الماكرو المستخدم المتقدمة إيماجيج أو فيجي لتيسير سير العمل أسرع وأعلى من الناتج (انظر https://imagej.nih.gov/ij/plugins/). تطبيع كثافة fluorescence دوروا يعني الأضرار بمرجع المقابلة العائد على الاستثمار في كل إطار من timelapse. هنا، يستخدم كثافة fluorescence النووية يعني كمرجع عائد الاستثمار (انظر نتائج الممثل في الشكل 1). يمكن أن يؤديها تطبيع طرح مرجع متوسط كثافة ومضان دوروا من الوسط الضرر كثافة ومضان دوروا، أو الأضرار بقسمة المتوسط عائد الاستثمار كثافة الأسفار بالإشارة يعني كثافة ومضان دوروا. ملاحظة: التطبيع بشعبة يمكن أن تسفر عن نتائج لا يمكن التنبؤ بها، إذا ما استخدمت في حالات مع قيم الكثافة إشارة منخفضة جداً- كرر لكافة الخلايا التالفة، وكذلك لمراقبة اثنين على الأقل، الخلايا غير التالفة. يمكن استخدام نتائج الخلية التحكم لمزيد من التطبيع، إذا لزم الأمر. تطبيع الرسم البياني قيم الكثافة على مر الزمن لإظهار التغيرات في ديناميات التوظيف كدالة للعلاج التجريبي. 7. صورة التحليل لتعيين البروتين الكشف عنها بواسطة الفلورة فتح الصور قبل وبعد الضرر في تطبيق تحليل صورة. الصور الأضرار قبل احتواء الأضرار ROI(s) المستخدمة التشعيع الصغرى. ROI(s) نسخ ولصق في الصور الأضرار اللاحقة تحديد الخلايا المستهدفة. تولد بكسل 6 × 6 عائد الاستثمار لتحليل البروتين التجنيد ومكان هذا العائد على الاستثمار في الموقع للضرر العائد على الاستثمار. هذا العائد على الاستثمار أكبر الآن الضرر العائد على الاستثمار للتحليل. تقرير الضرر متوسط كثافة ومضان دوروا. تطبيع كثافة fluorescence دوروا يعني الأضرار بمرجع المقابلة العائد على الاستثمار. هنا، يستخدم كثافة fluorescence النووية يعني الخلية التالفة كمرجع عائد الاستثمار (انظر نتائج الممثل في الشكل 1). توليد الإشارة العائد على الاستثمار باستخدام خوارزمية عتبة في إشارة DAPI لتعريف النواة، ومن ثم تحويل هذه المنطقة إلى عائد. تقرير مرجع متوسط كثافة fluorescence العائد على الاستثمار. التطبيع يمكن أن يؤديها بطرح الإشارة يعني كثافة ومضان دوروا من الضرر يعني كثافة fluorescence العائد على الاستثمار، أو بتقسيم الضرر متوسط كثافة ومضان دوروا مرجع متوسط كثافة ومضان دوروا. ملاحظة: التطبيع بشعبة يمكن أن تسفر عن نتائج لا يمكن التنبؤ بها، إذا ما استخدمت في حالات مع قيم الكثافة إشارة منخفضة جداً- كرر كافة الخلايا التالفة، وإجراء التحليل نفسه على الخلايا التحكم اثنين على الأقل، كما هو موضح أعلاه. الرسم البياني تطبيع قيم الكثافة لكل قياس الحدث الصغير-التشعيع ضد الوقت لإظهار التغييرات في تجنيد البروتين أو نوع من تلف الحمض النووي كدالة للعلاج التجريبي.

Representative Results

وصف المستحثة تلف الحمض النوويتحريض من آفات قاعدة وفواصل حبلا اعتماداً على جرعة الليزر يطبق على المنطقة النووية المحددة والمكرويه الخلوية نموذج الخلية المستخدمة7. البروتينات الفلورية تنصهر لإصلاح البروتينات، مثل XRCC1، 53BP1، Ku70، أو Rad51، وتوفير واحدة مفيدة ومزدوجة حبلا علامات فاصل لوضع الطاقة الحد الأدنى المطلوبة لرؤية تراكم بروتين فلوري في ضرر دوروا أعلاه خلفية fluorescence9،،من1931. حالما يتم العثور على الظروف التي تحفز استجابة، من المهم لتوصيف الخليط الضرر الناجم عن هذا الطول الموجي المحددة والجرعة. تخفيف الجرعة والمدة في الطول الموجي المستخدمة يمكن أن تسمح للمستخدم بالتقليل من تشكيل خلائط معقدة الأضرار. لقد ثبت جرعات منخفضة ليزر في نطاق الأشعة فوق البنفسجية-أ لإنتاج الغالب SSBs وكمية صغيرة من آفات قاعدة مناسبة لدراسة صبر والبر مسارات10،28. زيادة الجرعة يخلق آفات قاعدة أكثر تعقيداً، الأكسدة والناجم عن الأشعة فوق البنفسجية، ويدفع أعدادا كبيرة أكثر من7،دسبس10. بينما الاستقراء من نوع واحد من تلف الحمض النووي أمر مرغوب فيه للنظر في سبل إصلاح الحمض النووي محددة، فمن المحتمل أكثر أن المستخدمين هم حمل خليط آفات الحمض النووي، مع آفة محددة مثل SSBs ويجري أكثر تواترا من آفات قاعدة أو دسبس. وهذا مشابه للحمض النووي الخلائط الضرر الناجم عن المواد الكيميائية مثل بيروكسيد الهيدروجين (حاء2يا2) أو الميثيل ميثانيسولفوناتي (MMS)32. المستخدمين بحاجة إلى أن تكون على علم عندما كانوا في تقرير يمكن أن تحدث نتائج تضر المخاليط، وتوصيف دقيق للجرعة والآفات في موقع الأضرار العمدي ضرورية لضمان إمكانية تكرار نتائج وقابليتها للمقارنة النتائج. في الدراسات الصغيرة-التشعيع، كثيرا ما يستخدم XRCC1-التجارة والنقل كعلامة لتحريض من آفات قاعدة و9،SSBs28. XRCC1 هو بروتين سقالة أن يلعب دوراً هاما في إصلاح تضمين أحادي الجانب (سبر) والختان قاعدة إصلاح (البر)، وتشارك أيضا في مسارات الإصلاح الأخرى، مثل النوكليوتيدات الختان إصلاح (NER)33،34،35 . أنه يلعب دوراً تنسيقيا هاما في إصلاح الحمض النووي، والتفاعل مع عدد من البروتينات الرئيسية، بما في ذلك poly(ADP-ribose) بوليميراز 1 (نشطت-1)، β بوليميريز الحمض النووي (بول β)، والحمض النووي ليجاسى الثالث. يمكننا الاستفادة من XRCC1-التجارة والنقل ستابلي المعرب عنها في الخلايا تشو-K1 لتحديد جرعات الليزر اللازمة لتوليد SSBs ودسبس. وقد حددنا أولاً الجرعة الدنيا المطلوبة للحث توظيف يمكن ملاحظتها من XRCC1-التجارة والنقل لكل طول موجي (الشكل 1). للطول الموجي نانومتر 355، وقت يسكن s 2 على مدى الضرر الذي لحق المعرفة المتولدة دوروا إشارة فلورسنت المتزايد داخل هذا العائد على الاستثمار، مما يشير إلى استحثاث تلف الحمض النووي التي تم كشفها على الخلفية (الشكل 1أ). ل 405 شمال البحر الأبيض المتوسط، بمعدل مسح 8 fps ضروري لتوليد تعيين يمكن ملاحظتها للضرر العائد على الاستثمار (الشكل 1أ). ثم زاد الجرعة (10 ق 355 شمال البحر الأبيض المتوسط وفي الثانية 0.5 ل 405 نانومتر) لإنشاء أكثر كثافة الضرر العائد على الاستثمار (الشكل 1أ). ثم تم رصد توظيف واستبقاء XRCC1-التجارة والنقل في الموقع للأضرار العمدي بتصوير timelapse. الاحتفاظ بالبروتين في موقع تلف الحمض النووي قد يشير إلى إصلاح الحمض النووي مستمرة، بينما تفكك البروتين من الموقع للأضرار العمدي غالباً ما تعتبر علامة للانتهاء من البر أو صبر. ومع ذلك، كان هناك أي دليل واضح يربط بين الانفصال XRCC1 من مواقع تلف الحمض النووي المستحثة بالليزر مع انتهاء إصلاح. توظيف البروتين إلى موقع الضرر يقاس بالإبلاغ عن متوسط كثافة إشارة مضيئة داخل دوروا التالفة على إشارة الفلورسنت يعني قياس لنواة أسرة (الشكل 1ب). يساعد هذا النوع من التطبيع عنوان شدة التقلبات في إشارة النووية، على الرغم من أن يمكن أن تستخدم تقنيات أخرى تطبيع اعتماداً على توزيع الخلوية من بروتين الفائدة. هنا، يتم ترجمة XRCC1 في حجرة النووية، حيث التطبيع في المجال النووي تدابير إعادة توزيع للإشارة إلى الضرر العائد على الاستثمار. ثم يتم تسجيل شدة الفلورسنت متوسط العائد على الاستثمار لكل صورة في timelapse، بما في ذلك الصورة قبل التلف، ورسوم بيانية كدالة للزمن (الشكل 1ج). ثم أننا تتميز زيادة الأضرار الناجمة عن جرعتين الليزر المحدد لبحث تشكيل الآفات قاعدة الحمض النووي. أولاً، تشكيل وثيقة البرنامج القطري، آفة المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية ذات الحجم الكبير، كان سبر طريق الفلورة كعلامة نير نوع الآفات (الشكل 2أ). ثم، كان سبر قاعدة المستحث أوكسيداتيفيلي lesion8-أوكسودج كعلامة للبر نوع الآفات (الشكل 2ب). لم يلاحظ أي زيادة كبيرة في الآفات وثيقة البرنامج القطري في التعرض لجرعة منخفضة لكل الأطوال الموجية (2 s 355 شمال البحر الأبيض المتوسط وفي الثانية 8 ل 405 نانومتر)، في حين أن الارتفاع جرعة العلاج في كل الأطوال الموجية (10 ق 355 شمال البحر الأبيض المتوسط وفي الثانية 0.5 ل 405 nm) تظهر زيادة كبيرة في فلوري إشارة لاحظ ضمن الضرر العائد على الاستثمار (الشكل 2أ). مؤامرة مبعثر دوروا وثيقة البرنامج القطري يعني كثافة لكل الخلايا التالفة يظهر التباين في تشكيل الضرر وكشف الأطوال الموجية والجرعات، مما يشير إلى أن مستوى منخفض من آفات وثيقة البرنامج القطري قد تكون موجودة في الجرعات المنخفضة، ولكن قد لا يكون الحمل إلى حد كبير تم الكشف عن حتى يتم تطبيق جرعة أعلى. كما تقترح سكاتيربلوت أن عدم الكفاءة في الكشف عن الأجسام المضادة التي قد تحد من دقة التحديد الكمي للخلائط الضرر. وهذا هو كذلك أبرز في الكشف عن الآفات الحمض النووي المستحث أوكسيداتيفيلي علامة 8-أوكسودج. لا زيادة واضحة في إشارة مضيئة داخل الأضرار التي لوحظ دوروا ل 8-أوكسودج في الليزر الطول الموجي أو الجرعة المستخدمة (الشكل 2ب). الأجسام المضادة التي تستخدم لهذا العمل ويتسق مع السابقة منشورات9،،من1036؛ ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن يمكن أن تكون هناك قيود في الاحتفال بتشكيل 8-أوكسودج مع الأجسام المضادة37،38. كما ينصح تأكيد عدم وجود آفات أوكسيداتيفيلي المستحث بعلامة ثانية، مثل التجنيد للانزيم المسؤول عن إزالة 8-أوكسودج من الحمض الخلوي الصبغي108-أوكسوجوانيني DNA Glycosylase (OGG1)،. ونحن لم تراع تجنيد OGG1 لمواقعنا تلف الحمض النووي؛ ومع ذلك، تشكيل مستويات منخفضة من تلف الحمض النووي المستحث أوكسيداتيفيلي ليس مستبعداً تماما. وأخيراً، قمنا بدراسة تشكيل دسبس استخدام علامات اثنين، γH2AX و 53BP-1، اختيارهمالليزر د جرعات الفلورة (الشكل 3 & 4). ΓH2AX يستخدم عادة كعلامة فاصل ستراند، لكن خصوصيته دسبس قد شكك في عدد من التقارير39،40. بالإضافة إلى ذلك، هو حدث الفسفرة التي تنتشر من موقع فاصل ستراند، حتى يمكن أن تكون الترجمة للإشارة إلى فاصل حبلا محدودة بسبب هذا النشر إشارة. ولذلك، الجمع بين γH2AX 53BP-1 يسمح بتقييم أكثر دقة لتشكيل هيئة تسوية المنازعات داخل الضرر العائد على الاستثمار. استجابة γH2AX و 53BP-1 التشعيع الصغرى هو الطول الموجي وتعتمد الجرعة. جرعة منخفضة (2 s) التحفيز في 355 نانومتر يتسبب أي رد في 5 و 20 دقيقة، واستجابة ضعيفة ومتغير 10 دقيقة بعد تشعيع (الشكل 3أ) لكل علامات. الجرعة العالية (10 ق) 355 نانومتر الصغرى-تشعيع يستحث إشارة فلورسنت زيادة نطاق الضرر العائد على الاستثمار في 5 و 10 و 20 دقيقة بعد التشعيع أن ينخفض إلى 40 دقيقة (الشكل 3ب). تشير هذه النتائج إلى عناية أن معايرة الجرعة نانومتر 355 مطلوب لتقليل التحفيز عبر مسارات الإصلاح، كما يتضح من الكشف عن انخفاض γH2AX ماركر فاصل حبلا مزدوجة في نقاط الوقت المبكر (< 20 دقيقة) في الجرعات المنخفضة تطبيق. أجريت تجارب مماثلة باستخدام منخفضة (8fps) والجرعة العالية (0.5 fps) 405 نانومتر الليزر التحفيز (الشكل 4). وعند هذا الطول الموجي لوحظ تراكم كبير من شدة الفلورسنت ضمن الضرر العائد على الاستثمار لكل من 53BP-1 و γH2AX بغض النظر عن الجرعة المطبقة، مما يشير إلى أن هذه الجرعات توليد خليط معقد من فواصل حبلا مفردة ومزدوجة تقريبا فورا بعد تنصيب تلف الحمض النووي (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك، جرعات عالية من 405 نانومتر تظهر زيادة في تلطيخ γH2AX عموم النووية داخل 10 دقيقة التعريفي الضرر (الشكل 4ب، أسفل) التي يصعب الكشف عن الضرر العائد على الاستثمار للتقرير، بينما تراكم 53BP-1 أكثر الواردة ضمن الضرر العائد على الاستثمار. هذه النتائج تبين بوضوح أن 405 نانومتر الصغرى-التشعيع ليست مناسبة لرصد صبر أو البر، وينبغي استخدامها أن عدة علامات للحمض النووي adducts وحبلا فواصل تماما وصف الآفات المستحث والردود إصلاح الحمض النووي. الجرعة تعتمد على التغيير في توظيف واستبقاء XRCC1-بروتينات فلورية خضراءمرة واحدة قد اتسم الأضرار العمدي الحمض النووي، يمكن أن يكون الليزر الجزئي-التشعيع منصة مثالية لدراسة ديناميات البروتينات إصلاح الحمض النووي. يظهر حركية الاستبقاء وتفكك من XRCC1-بروتينات فلورية خضراء تبعية جرعة (الشكل 1)، التي ليست غير متوقعة نظراً لتحريض الخلائط أضرار مختلفة بكل طول موجي. إظهار جرعات الإشعاع أعلى (10 ق وفي الثانية 0.5) تجنيد XRCC1-التجارة والنقل بالنسبة لجرعات أقل كثافة أعلى وأطول الاحتفاظ XRCC1-بروتينات فلورية خضراء في موقع الضرر على مدار الوقت 20 دقيقة (الشكل 1ج). يشير هذا إلى أن الأضرار الحمض النووي التي تم إنشاؤها في الجرعات العالية لكلا 355 و 405 نانومتر من المحتمل لم تحل خلال فترة التجربة، وما يتسق مع مظهر والاحتفاظ بعلامات جهاز تسوية المنازعات، و γH2AX، و 53BP-1 (الأرقام 3 & 4 ). من المثير للاهتمام، جرعات أقل الأضرار (s 2 و 8 في الثانية) إظهار التوظيف السريع من XRCC1-التجارة والنقل إلى مواقع الأضرار وتفكك XRCC1-التجارة والنقل على مدى الوقت التجريبي إلى مستويات ما قبل التشعيع (الشكل 1ج). دون توصيف كاملة من خليط الضرر، قد يؤدي هذا إلى الاستنتاج بأن SSBs وآفات قاعدة يتم حلها تماما استخدام هذه الظروف الضارة. ومع ذلك، وجود γH2AX و 53BP-1 في 40 دقيقة ل 355 شمال البحر الأبيض المتوسط وعلى 5 دقائق 405 نانومتر قد يؤدي إلى تفسيرات مختلفة. للجرعة s nm 2 355، خليط الضرر قد يكون الغالب SSBs، حتى ظهور علامات جهاز تسوية المنازعات في 40 دقيقة قد يشير إلى أن بعض الآفات التي لم يتم إصلاحها يمكن أن تؤدي إلى دسبس أو أن يتم إصلاح دسبس التي تم إنشاؤها بواسطة هذه الطاقة على فترة زمنية أطول. الوقت مقياس الاختلافات بين إصلاح سبر وجهاز تسوية المنازعات قد ذكر سابقا28،،من4142. وبالمثل، الانفصال 405 من الجرعات المنخفضة (8 fps) شمال البحر الأبيض المتوسط قد تشير إلى مستوى منخفض من SSBs أو تجميع SSBs هي سرعة تحويلها إلى دسبس، الذي ذكر لارتفاع تلف الحمض النووي الصغير-التشعيع وأخرى ضارة وكلاء سابقا43، 44 , 45. معا هذه النتائج الضوء على أهمية تميز الخلائط الأضرار العمدي واستخدام الحمض النووي عدة إصلاح البروتينات وعلامات لتفسير توظيف واستبقاء للحمض النووي إصلاح البروتينات في مواقع الأضرار العمدي. الشكل 1 . الليزر الجزئي-التشعيع الحث على توظيف XRCC1-التجارة والنقل. (A) خلايا تشو-K1 ستابلي معربا عن التجارة والنقل XRCC1 المشع وتصويرها قبل وبعد التعريفي أضرار مباشرة. تشير الأسهم إلى الموقع للجرعات الصغيرة-التشعيع وهو شريط مقياس 10 ميكرون. (ب) التعيين ويقاس بتحديد شدة الفلورسنت يعني ضمن الضرر العائد على الاستثمار، وتطبيع لشدة الفلورسنت يعني نواة أسرة. ويمكن قياس (ج) ديناميات التوظيف لكل صورة timelapse. تمثل الرسوم البيانية تجربتين مستقلة مع أشرطة الخطأ تمثل وزارة شؤون المرأة (ن = 24). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 2 . الليزر الجزئي-التشعيع يدفع الضرر النوكليوتيدات. الخلايا تشو-K1 تعرضوا تشعيع الجزئي بالليزر وثابت فورا بعد التعريفي الضرر. وأجرى الفلورة للكشف عن وثيقة البرنامج القطري وأدوكتس 8-أوكسودج. (أ) أعلى، مؤامرة مبعثر من الأسفار يعني دوروا لاحظت كثافة في تلف الخلايا بعد تلطيخ وثيقة البرنامج القطري. أسفل، صور الممثل لتلطيخ وثيقة البرنامج القطري. تشير الأسهم إلى موقع مايكرو-التشعيع وهو شريط مقياس 10 ميكرون (n = 12). (ب) ممثل من الصور لتلطيخ 8-أوكسودج. الأسهمتشير إلى موقع مايكرو-التشعيع وهو شريط مقياس 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3 . علامات فاصل مزدوج حبلا الحمض النووي الرد على 355 نانومتر الصغرى-التشعيع بطريقة تعتمد جرعة. خلايا تشو-K1 تعرضوا للصغير-التشعيع وثابتة في الوقت نقاط التحفيز المشار إليها بعد. وقد أجرى الفلورة لجهاز تسوية المنازعات علامات γH2AX و 53BP-1. (أ) مبعثر مؤامرة تطبيع الأضرار يعني دوروا كثافات fluorescence قياس للخلايا غير التالفة والمعطوبة. أشرطة الخطأ ممثل وزارة شؤون المرأة (n = 12). (ب) ممثل من الصور γH2AX وتلطيخ 53BP-1. تشير الأسهم إلى موقع مايكرو-التشعيع وهو شريط مقياس 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 4. علامات فاصل مزدوج حبلا الحمض النووي قوة الاستجابة إلى 405 نانومتر الصغرى-التشعيع.خلايا تشو-K1 تعرضوا للصغير-التشعيع وثابتة في تحفيز الوظيفة المشار إليها النقاط الزمنية. الفلورة لجهاز تسوية المنازعات علامات γH2AX و 53BP-1. (أ) مبعثر مؤامرة تطبيع الأضرار يعني دوروا كثافات fluorescence قياس للخلايا غير التالفة والمعطوبة. أشرطة الخطأ ممثل وزارة شؤون المرأة (n = 12). (ب) ممثل من الصور γH2AX وتلطيخ 53BP-1. تشير الأسهم إلى موقع مايكرو-التشعيع وهو شريط مقياس 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

استخدام الشروط الموضحة هنا، أي مجهر [كنفوكل] مع الأشعة فوق البنفسجية-أ أو 405 نانومتر الليزر، أما المتكاملة حسب الشركة المصنعة أو إضافتها بواسطة المستخدم النهائي، يمكن أن تحفز تلف الحمض النووي داخل نواة الخلية والسماح بتجنيد البروتينات إصلاح الحمض النووي إلى موقع الناجم عن تلف الحمض النووي التي يتعين رصدها. ومع ذلك، كما ذكر في البروتوكول والنتائج التمثيلية، واختيار الطول الموجي، تطبق السلطة، وتوصيف الأضرار جميعها بأهمية المسائل التي يجب معالجتها أولاً قبل المستخدم من أجل دراسة الحمض النووي خاصة إصلاح الطريق. بالإضافة إلى ذلك، هناك اعتبارات أخرى في تصميم التجارب التي يجب أن تنظر أيضا إلى المستخدمين.

بغية مراقبة السلوك للبروتين في وظيفة الخلايا الحية الدقيقة-التشعيع، بروتين مسمى فلوريسسينتلي يجب إنشاء. توفر مجموعة واسعة من البروتينات الفلورية التي يمكن فصلها طيفيا يوفر أدوات لخلق اندماج البروتين التي يمكن استخدامها لوصف الاستجابات الخلوية لاستحثاث تلف الحمض النووي. تعداء عابرة من البروتينات الفلورية ذات الاهتمام يسمح للفحص السريع لظروف ضارة، والطفرات، أو حتى مثبطات، بينما تقدم ستابلي transfected الخلايا المزيد من السيطرة على مستويات التعبير والسماح للكيمياء الحيوية الأخرى الأوصاف التي يمكن القيام بها، التحقق من صحة النتائج الدقيقة-التشعيع. يمكن أيضا الاستفادة من البروتينات الفلورية طيفيا متميزة في نفس الخلية لرصد التفاعلات بين البروتينات داخل المسار نفسه، أو في مسارات مختلفة. البروتينات الفلورية أيضا القضاء على الحاجة إلى أجسام مضادة محددة لكل البروتين من الفائدة والسماح بخلية حية رصد السلوك البروتين لفترات طويلة من الزمن بعد التعريفي للضرر.

ومع ذلك، قد استخدام البروتينات الفلورية أيضا عيوب. دون الخلفيات الوراثية ناقصة في protein(s) للفائدة، سوف تتنافس البروتينات الذاتية مع البروتينات المعلمة فلوريسسينتلي. تصريف علامة مضيئة للمحطة N أو ج من البروتين قد يغير طي البروتين، ويعوق تفاعلات البروتين البروتين الرئيسية، أو منع إشارات إزفاء؛ تغيير الدالة ويحتمل أن تؤثر على ديناميات التوظيف. أثبتت هذه الآثار في عدد من التقارير تلطيخ إيممونوفلوريسسينت أثبت فيها توظيف مختلفة إلى حد كبير ومرات الاحتفاظ للبروتينات الذاتية في موقع الضرر28. استخدام تعداء عابرة أو استنساخ مستقرة أيضا تغيير الاستجابة لاحظ، عادة من خلال التغيرات في مستويات التعبير البروتين. علاوة على ذلك، استخدام البروتينات الفلورية متعددة في تجربة واحدة قد تغير أيضا القوى المحركة للتوظيف، إذا لم يتم اكويليبراتيد مستويات البروتين جيد أو إذا كان توظيف البروتين فلوريسسينتلي معلم أكبر يمنع تجنيد البروتينات الأخرى . وأخيراً، يمكن أن تعمل البروتينات الفلورية كعوامل التوعية ضعيفة، وتزايد تشكيل الأنواع الأكسجين التفاعلية، واحتمال تغيير الحمض النووي الضرر الخلائط المستحث46،47. وعلى الرغم من هذه العيوب، توفر البروتينات الفلورية إصلاح عدد من مزايا واضحة في دراسة الحمض النووي مع التشعيع الصغرى، وإذا كان المستخدمين إدراج عناصر التحكم المناسبة، مثل وصف الضرر الموصوف هنا، أنها يمكن أن تقدم نظرة جديدة إلى تلف التفاعلات استجابة والبروتين-بروتين3.

إذا كان غير مطلوب تصوير الخلايا الحية، يمكن استخدام الفلورة لرصد الاستجابة للأضرار العمدي. عن طريق تحديد الخلايا في أوقات محددة بعد التعريفي الأضرار وتلطيخ مع الأجسام المضادة المحددة للبروتينات وآفات الفائدة، ولقطات ثابتة من الضرر التعريفي والتوظيف والاحتفاظ بإصلاح يمكن أن يبني البروتينات. يمكن استخدام الأجسام المضادة لرصد تجنيد البروتينات متعددة الفوائد و/أو التعديلات بوستترانسلاشونال الناجمة عن الاستجابة تلف الحمض النووي. استخدام الفلورة يلغي الحاجة للبروتينات الفلورية، ويسمح للسلوك البروتين الذاتية لفحصها. ومع ذلك، هذا الأسلوب أيضا عيوبها. ضرورية أجسام مضادة محددة للغاية، وبيرميبيليزيشن وإجراءات حظر بحاجة إلى أن يكون الأمثل للسماح للكشف عن التوظيف بكثافة إشارة كافية. تحديد إجراءات ليست لحظية، ويحد هذا القيد المادي القرار الزماني لهذا النهج. تعيين موقع التعريفي الضرر حتى يمكن أن تكون الخلايا إعادة يقع بعد تلطيخ يمكن أيضا تحديات كبيرة. المجهر [كنفوكل] المستخدمة في هذا العمل يسمح للتسجيل المستندة إلى الصور كما هو موضح أعلاه، حيث يمكن نقل الخلايا التالفة بدقة عالية. إذا كانت مرحلة التسجيل أو محفوراً كوفيرجلاس غير متوفرة، وقت الاستثمار تشارك في نقل الخلايا دون تسجيل المرحلة، مقترنة بالتأخير المتأصلة بين الضرر التعريفي وتجنيد المصورة، قد جعل الفلورة غير جذابة لبعض المستخدمين. ومع ذلك، سيتضمن التصاميم التجريبية الصغيرة-التشعيع الأكثر دقة واكتمال هذه الأنواع من نهج بالتوازي مع استخدام البروتينات الفلورية، كما هو موضح في البروتوكول المقدم.

هنا، يستخدم تصوير الخلايا الحية والفلوره لإثبات جدوى الليزر الجزئي-التشعيع. تلوين إيممونوفلوريسسينت يسمح لنا ببحث دقيق خليط تلف الحمض النووي التي تم إنشاؤها وتجنيد البروتينات التي يتسبب فيها بكل قوة الليزر، التي تسمح لنا بشكل أفضل تفسير التعديلات الملحوظة في التوظيف والاحتفاظ XRCC1-التجارة والنقل. وبناء على هذه النتائج، ينبغي استخدام 405 نانومتر الليزر المحدودة لدراسة البروتينات البر وسبر. علاوة على ذلك، أفضل تصميم تجريبية تشمل قياسات الطاقة بعد الهدف، وتوصيف خليط الضرر الكامل لكل خط الخلية المستخدمة، والتحقق من التوظيف واستبقاء الملاحظ في فلوريسسينتلي معلم البروتينات مع الفلورة. ومن الواضح أن المعدات والوقت، واعتبارات التكلفة قد يجعل هذه التصاميم التجريبية الأمثل المستحيل لبعض المستخدمين. بيد أن أهمية كل عنصر من هذه العناصر تتجلى هنا والمستخدمين يجب أن نأخذ هذه الاعتبارات في الاعتبار عندما تبدأ التجارب الصغرى-التشعيع.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

الكتاب يود أن يشكر الدكتور صمويل حاء ويلسون في “الوطنية معهد لعلوم الصحة البيئية” لخطوط الخلايا المستخدمة في هذا العمل.

Materials

Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope Nikon
NIS Elements software Nikon
355 nm laser PicoQuant VisUV Radiation source
Galvanometer photoactivation miniscanner Bruker
Microscope slide photodiode power sensor THORLabs S170C
Fiber photodiode power sensor THORLabs S150C
Digital handheld optical power and energy meter THORLabs PM100D
CHO-K1 From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS
Minimal essential media Hyclone SH3026501
Fetal bovine serum Atlanta biologicals S11550
XRCC1-GFP Origene RG204952
Jetprime Polyplus transfection 11407
Geneticin ThermoFisher 10131035
4 chambered coverglass ThermoFisher 155382
8 chambered coverglass ThermoFisher 155409
Anti 53BP-1 Novus NB100304
Anti-phospho-histone H2AX  Millipore 05-636-I
Anti cyclobutane pyrimidine dimer Cosmo Bio clone CAC-NM-DND-001
Anti 8-oxo-2´-deoxyguanosine  Trevigen 4354-MC-050
Alexa 488 goat anti-mouse ThermoFisher A11029
Alexa 546 goat anti-rabbit ThermoFisher A11010
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) ThermoFisher R37606 Caution toxic!
Phosphate buffered saline ThermoFisher 0780
Normal goat serum ThermoFisher 31873
Bovine serum albumin (BSA) Jackson Immuno Research 001-000-162
37% Formaldehyde ThermoFisher 9311 Caution toxic!
Ethanol Decon Labs 2716
Methanol VWR BDH1135 Caution toxic!
HCl Fisher SA49
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Caution toxic!
Tris Hydrochloride Amresco O234
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luijsterburg, M. S., et al. Stochastic and reversible assembly of a multiprotein DNA repair complex ensures accurate target site recognition and efficient repair. J Cell Biol. 189 (3), 445-463 (2010).
  2. Vermeulen, W. Dynamics of mammalian NER proteins. DNA Repair (Amst). 10 (7), 760-771 (2011).
  3. Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
  4. Cremer, C., Cremer, T., Zorn, C., Schoeller, L. Effects of laser uv-microirradiation (lambda = 2573 A) on proliferation of Chinese hamster cells. Radiat Res. 66 (1), 106-121 (1976).
  5. Cremer, C., Cremer, T., Fukuda, M., Nakanishi, K. Detection of laser–UV microirradiation-induced DNA photolesions by immunofluorescent staining. Hum Genet. 54 (1), 107-110 (1980).
  6. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J Microsc. 209, 71-75 (2003).
  7. Kielbassa, C., Roza, L., Epe, B. Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light. Carcinogenesis. 18 (4), 811-816 (1997).
  8. Kielbassa, C., Epe, B. DNA damage induced by ultraviolet and visible light and its wavelength dependence. Methods Enzymol. 319, 436-445 (2000).
  9. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), 68 (2009).
  10. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  11. Krasin, F., Hutchinson, F. Strand breaks and alkali-labile bonds induced by ultraviolet light in DNA with 5-bromouracil in vivo. Biophys J. 24 (3), 657-664 (1978).
  12. Krasin, F., Hutchinson, F. Double-strand breaks from single photochemical events in DNA containing 5-bromouracil. Biophys J. 24 (3), 645-656 (1978).
  13. Rosenstein, B. S., Setlow, R. B., Ahmed, F. E. Use of the dye Hoechst 33258 in a modification of the bromodeoxyuridine photolysis technique for the analysis of DNA repair. Photochem Photobiol. 31 (3), 215-222 (1980).
  14. Cremer, T., Peterson, S. P., Cremer, C., Berns, M. W. Laser microirradiation of Chinese hamster cells at wavelength 365 nm: effects of psoralen and caffeine. Radiat Res. 85 (3), 529-543 (1981).
  15. Limoli, C. L., Ward, J. F. A new method for introducing double-strand breaks into cellular DNA. Radiat Res. 134 (2), 160-169 (1993).
  16. Carlsson, K., Mossberg, K., Helm, P. J., Philip, J. Use of UV excitation in confocal laser scanning fluorescence microscopy. Micron and Microscopica Acta. 23 (4), 413-428 (1992).
  17. Stelzer, E. H. K., Haar, F. -. M. Confocal Microscopy: Recent Developments. Advances in Imaging and Electron Physics. 106, 293-345 (1999).
  18. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).
  19. Tashiro, S., Walter, J., Shinohara, A., Kamada, N., Cremer, T. Rad51 accumulation at sites of DNA damage and in postreplicative chromatin. J Cell Biol. 150 (2), 283-291 (2000).
  20. Gassman, N. R., Stefanick, D. F., Kedar, P. S., Horton, J. K., Wilson, S. H. Hyperactivation of PARP triggers nonhomologous end-joining in repair-deficient mouse fibroblasts. PLoS One. 7 (11), 49301 (2012).
  21. Bolin, C., et al. The impact of cyclin-dependent kinase 5 depletion on poly(ADP-ribose) polymerase activity and responses to radiation. Cell Mol Life Sci. 69 (6), 951-962 (2012).
  22. Godon, C., et al. PARP inhibition versus PARP-1 silencing: different outcomes in terms of single-strand break repair and radiation susceptibility. Nucleic Acids Res. 36 (13), 4454-4464 (2008).
  23. Hanssen-Bauer, A., et al. XRCC1 coordinates disparate responses and multiprotein repair complexes depending on the nature and context of the DNA damage. Environ Mol Mutagen. 52 (8), 623-635 (2011).
  24. Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Res. 35 (22), 7665-7675 (2007).
  25. Mortusewicz, O., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Spatiotemporal dynamics of regulatory protein recruitment at DNA damage sites. J Cell Biochem. 104 (5), 1562-1569 (2008).
  26. Mortusewicz, O., Rothbauer, U., Cardoso, M. C., Leonhardt, H. Differential recruitment of DNA Ligase I and III to DNA repair sites. Nucleic Acids Res. 34 (12), 3523-3532 (2006).
  27. Solarczyk, K. J., Zarębski, M., Dobrucki, J. W. Inducing local DNA damage by visible light to study chromatin repair. DNA Repair (Amst). 11 (12), 996-1002 (2012).
  28. Gassman, N. R., Wilson, S. H. Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair. DNA Repair (Amst). 31, 52-63 (2015).
  29. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O’Neill, P. Use of near infrared femtosecond lasers as sub-micron radiation microbeam for cell DNA damage and repair studies. Mutat Res. 704 (1-3), 38-44 (2010).
  30. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
  31. Lan, L., et al. Accumulation of Werner protein at DNA double-strand breaks in human cells. J Cell Sci. 118, 4153-4162 (2005).
  32. Salmon, T. B., Evert, B. A., Song, B., Doetsch, P. W. Biological consequences of oxidative stress-induced DNA damage in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 32 (12), 3712-3723 (2004).
  33. Caldecott, K. W. DNA single-strand break repair. Exp Cell Res. 329 (1), 2-8 (2014).
  34. London, R. E. The structural basis of XRCC1-mediated DNA repair. DNA Repair (Amst). 30, 90-103 (2015).
  35. Moser, J., et al. Sealing of chromosomal DNA nicks during nucleotide excision repair requires XRCC1 and DNA ligase III alpha in a cell-cycle-specific manner. Mol Cell. 27 (2), 311-323 (2007).
  36. Campalans, A., et al. Distinct spatiotemporal patterns and PARP dependence of XRCC1 recruitment to single-strand break and base excision repair. Nucleic Acids Res. 41 (5), 3115-3129 (2013).
  37. Cooke, M. S., Lunec, J. . Immunochemical detection of oxidative DNA damage. Vol. I. , 275-293 (2003).
  38. Rossner, P., Sram, R. J. Immunochemical detection of oxidatively damaged DNA. Free Radic Res. 46 (4), 492-522 (2012).
  39. Cleaver, J. E., Feeney, L., Revet, I. Phosphorylated H2Ax is not an unambiguous marker for DNA double-strand breaks. Cell Cycle. 10 (19), 3223-3224 (2011).
  40. Rybak, P., et al. Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (γH2AX) is not associated with DNA double-strand breaks. Oncotarget. 7 (31), 49574-49587 (2016).
  41. Haince, J. F., et al. PARP1-dependent kinetics of recruitment of MRE11 and NBS1 proteins to multiple DNA damage sites. J Biol Chem. 283 (2), 1197-1208 (2008).
  42. Caldecott, K. W. Single-strand break repair and genetic disease. Nat Rev Genet. 9 (8), 619-631 (2008).
  43. Lomax, M. E., Gulston, M. K., O’Neill, P. Chemical aspects of clustered DNA damage induction by ionising radiation. Radiat Prot Dosimetry. 99 (1-4), 63-68 (2002).
  44. Ma, W., Westmoreland, J. W., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. Alkylation base damage is converted into repairable double-strand breaks and complex intermediates in G2 cells lacking AP endonuclease. PLoS Genet. 7 (4), 1002059 (2011).
  45. Siddiqi, M. A., Bothe, E. Single- and double-strand break formation in DNA irradiated in aqueous solution: dependence on dose and OH radical scavenger concentration. Radiat Res. 112 (3), 449-463 (1987).
  46. Sano, Y., Watanabe, W., Matsunaga, S. Chromophore-assisted laser inactivation–towards a spatiotemporal-functional analysis of proteins, and the ablation of chromatin, organelle and cell function. J Cell Sci. 127, 1621-1629 (2014).
  47. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biol. 2, 368-376 (2014).

Tags

Laser Micro-irradiationDNA DamageDNA RepairSingle And Double Strand BreaksProtein RecruitmentReal-time VisualizationFluorescent MicroscopyAutomated Microscope StageFocal PlaneRegion Of Interest (ROI)405-nanometer Laser

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (127), e56265, doi:10.3791/56265 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image