Bir Işık Uyaranteslimi Üzerine Kerevit Fotoreseptörlerinin Duyarsızlaştırılması ve İyileştirilmesi
Summary
Kerevit fotoreseptörlerinin sirkadiyen zamanın bir fonksiyonu olarak duyarsızlaştırma ve duyarlılık geri kazanımı için bir protokol sunulmuştur.
Abstract
Kerevit fotoreseptörlerinin duyarsızlaştırılması ve geri kazanımı üzerinde çalışmak için bir yöntem sunulmuştur. İzole göz sapındaki fotoreseptör hücrelerinin hücre içi elektrik kayıtlarını, kesintisiz tek elektrot anahtarlı voltaj-kelepçe konfigürasyonunu kullanarak gerçekleştirdik. İlk olarak, jiletle retinaya ulaşmak için sırt korneasında bir açıklık yaptık. Daha sonra, açıklığa cam bir elektrot yerleştirdik ve negatif bir potansiyelin kaydedildiği gibi bir hücreye delip geçtik. Membran potansiyeli fotoreseptörün dinlenme potansiyeline kenetlendi ve akımları aktive etmek için bir ışık darbesi uygulandı. Son olarak, iki ışık flaş protokolü mevcut duyarsızlaştırma ve kurtarma ölçmek için kullanılmıştır. İlk ışık flaşı, bir gecikme döneminden sonra, transdüksiyon iyonik akımı tetikler, bir tepe genliğine ulaştıktan sonra duyarsız bir duruma doğru çürür; değişen zaman aralıklarında uygulanan ikinci flaş, ışıkla aktive edilen iletkenliğin durumunu değerlendirir. Işık la kaplı akımı karakterize etmek için üç parametre ölçüldü: 1) gecikme süresi (ışık flaşı teslimi ile akımın maksimum değerinin %10’unu elde ettiği an arasında geçen süre); 2) pik akım; ve 3) duyarsızlaştırma süresi sabiti (mevcut bozunma evresinin üstel zaman sabiti). Tüm parametreler ilk nabızdan etkilenir.
Duyarsızlaştırmadan iyileşmeyi ölçmek için, p2/p1 oranı darbeler arasındaki zamana göre kullanılmıştır. p1, ilk ışık darbesinin uyardığı en yüksek akımdır ve p2 ikinci darbenin uyardığı en yüksek akımdır. Bu veriler üstel fonksiyonların toplamına monte edildi. Son olarak, bu ölçümler sirkadiyen zamanın işlevi olarak yapılmıştır.
Introduction
Görsel bir uyarıcı olarak algılanabilmesi için gözlere ulaşan ışığın bir elektrik sinyaline aktarılması gerekir. Bu nedenle, tüm görsel organizmalarda, ışık bir transdüksiyon iyon akımı tetikler, hangi sırayla fotoreseptör hücrelerinin membran potansiyelinde bir değişiklik üretir, sözde reseptör potansiyeli. Bu nedenle, gözün ışık hassasiyeti öncelikle etkinleştirilen veya duyarsızlaştırılabilen ışık aktive iletkeninin durumuna bağlıdır.
Kerevit fotoreseptörlerinde ışık yavaş, geçici, iyonik akım1’itetikler. Aydınlatma üzerine, transdüksiyon akımı maksimum ulaşmadan önce bir gecikme veya gecikme sonra ortaya çıkar; bundan sonra çürür, transdüksiyon kanalları daha fazla ışık uyarıcı tepkisiz olduğu bir duyarsız duruma düşmek gibi2. Yani, ışık, görme sorumlu transdüksiyon akımı aktive ek olarak, aynı zamanda fotoreseptör hücrelerinin duyarlılığı geçici bir artış neden olur. Duyarsızlaştırma yeterli bir uyarıcıaşırı maruz kalma karşı genel bir koruyucu mekanizma temsil edebilir. Transdüksiyon iletkenliği duyarsızlaşmadan sonra iyileştikçe gözün ışığa karşı hassasiyeti geri kazanılır.
Hücre içi kayıt,3,4,5,6,7,8gibi heyecanlı hücrelerin elektriksel aktivitesini ölçmek için kullanışlı bir tekniktir. Hücre içi kayıt yama-kelepçe tekniği9gelişiyle daha az sıklıkta olmasına rağmen, hala uygun bir yaklaşım zaman hücreleri ya izole etmek zor, ya da yama-kelepçe giga-mühürler oluşumunu zorlaştıran bir geometri mevcut(yani,mühürler veya yama elektrot ve membranlar arasında sıkı temas 109ohms sırası elektrik direnci ile). İkinci örnek sperm hücreleri10 ve fotoreseptör hücreleri burada incelenmiştir. Deneyimlerimize göre, Procambarus clarkii fotoreseptörleri izole etmek ve birincil kültürde tutmak zordur; ayrıca, giga-mühür oluşumunu elde etmeyi zorlaştıran ince çubuklardır. Hücre içi kayıtlarda, keskin bir elektrot, çevre doku tarafından yerinde tutulan bir hücreye ilerler. Elektrot amplifikatörün yüksek hızlı anahtarlama devresi ile doğranır, böylece akım gerilim darbeleri arasında örneklenir. Bu mod, kesintisiz tek elektrot voltaj kelepçesi (dSEVC modu)11olarak bilinir. Elektrotun yüksek direnci (küçük açıklık) hücre ve pipet çözeltileri arasındaki difüzyon değişimini engelleyerek hücre içi ortam3’ünen az bozulmasına neden olur. Bu tekniğin potansiyel bir dezavantajı elektrot ekleme non-selektif sızıntı akımı üretebilir; bu nedenle, sızıntı akımının boyutunun amaçlananölçümlerietkileyebilecek hücrelerden kayıt tan kaçınmaya özen, 4,12.
Burada, gerilim kelepçesi koşullarında fotoreseptör hücrelerinin hücre içi elektrik kayıtlarını gerçekleştirerek ışıkla aktive edilmiş iyon iletkenliğin deyanamasını ve geri kazanımını değerlendirmek için izole kerevit göz dürbünlerini kullanırız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kerevit, doğal olmayan koşullar altında hayatta kalma yeteneği nedeniyle mükemmel bir model olduğu kanıtlanmıştır. In vivo ve in vitro elektrofizyolojik analizlere kolayca ulaşabilirsiniz. Buna ek olarak, kabuklular karşılaştırmalı kronobiyoloji alanında nörobiyolojik araştırmalar için uygun bir gruptur21.
Bu yazıda, kerevit fotoreseptör hücrelerinin ışıkla aktive edilmiş transdüksiyon akımının duyarsızlaştırılması …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma DGAPA-UNAM IN224616-RN224616 hibe tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, Bu makalenin İngilizce versiyonunu düzenlediği için, UAM’deki Facultad de Medicina’daki División de Investigación’dan Bilimsel Makale Çeviri Bölümü Başkanı Bayan Josefina Bolado’ya teşekkür etmek istiyorlar.
Materials
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
| Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
| Clampfit | Axon Instruments Inc | Analysis software linked to pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
| Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
- Barriga-Montoya, C., Gómez-Lagunas, F., Fuentes-Pardo, B. Effect of pigment dispersing hormone on the electrical activity of crayfish visual photoreceptors during the 24-h cycle. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 157 (4), 338-345 (2010).
- Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and recovery of crayfish photoreceptors. Dependency on circadian time, and pigment-dispersing hormone. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 203, 297-303 (2017).
- Wickenden, A. D. Overview of electrophysiological techniques. Curr. protoc. pharmacol. 11, 1-17 (2014).
- Brette, R., Destexhe, A. Intracellular recording. Handbook of Neural Activity Measurement. , 44-91 (2012).
- Cummins, D., Goldsmith, T. H. Cellular identification of the violet receptor in the crayfish eye. J. Comp. Physiol. 142 (2), 199-202 (1981).
- Eguchi, E. Rhabdom structure and receptor potentials in single crayfish retinular cells. J. Cell and Comp. Physiol. 66, 411-430 (1965).
- Nosaki, H. Electrophysiological study of color encoding in the compound eye of crayfish, Procambarus clarkii. Z. vergl. Physiologie. 64 (3), 318-323 (1969).
- Miller, C. S., Glantz, R. M. Visual adaptation modulates a potassium conductance in retinular cells of the crayfish. Vis Neurosci. 17 (3), 353-368 (2000).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
- Lishko, P., Clapham, D. E., Navarro, B., Kirichok, Y. Sperm patch-clamp. Methods Enzymol. 525, 59-79 (2013).
- Finkel, A. Axoclamp-2A microelectrode clamp theory and operation. Axon Instruments, Inc. , (1990).
- Sakmann, B. . Single-channel recording. , (2013).
- Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustacea. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34 (4), 428-432 (1936).
- Oesterle, A. . pipette cookbook. , 97 (2008).
- Fuentes-Pardo, B., Ramos-Carvajal, J. The phase response curve of electroretinographic circadian rhythm of crayfish. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 74 (3), 711-714 (1983).
- Pace-Schott, E. F., Hobson, J. A. The neurobiology of sleep: genetics, cellular physiology and subcortical networks. Nat. Rev. Neurosci. 3 (8), 591-605 (2002).
- Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. On the mechanism of the entrainment of a circadian rhythm by light cycles. Circadian Clocks. , 277-297 (1965).
- Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. Circadian systems: entrainment. Handbook Behavioral Neurobiology Biological Rhythms. , 94-124 (1981).
- Vitaterna, M. H., Takahashi, J. S., Turek, F. W. Overview of circadian rhythms. Alcohol Res. Health. 25 (2), 85-93 (2001).
- Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. 507, (2001).
- Dircksen, H., Strauss, J. Circadian clocks in crustaceans: identified neuronal and cellular systems. Front Biosci. 15, 1040-1074 (2010).
- Terakita, A., Hariyama, T., Tsukahara, Y., Katsukura, Y., Tashiro, H. Interaction of GTP-binding protein Gq with photoactivated rhodopsin in the photoreceptor membranes of crayfish. FEBS Lett. 330, 197-200 (1993).
- Terakita, A., Takahama, H., Hariyama, T., Suzuki, T., Tsukahara, Y. Light regulated localization of the beta-subunit of Gq-type G-protein in the crayfish photoreceptors. J Comp Physiol A. 183 (4), 411-417 (1998).
- Terakita, A., Takahama, H., Tamotsu, S., Suzuki, T., Hariyama, T., Tsukahara, Y. Light-modulated subcellular localization of the alpha-subunit of GTP-binding protein Gq in crayfish photoreceptors. Vis Neurosci. 13 (3), 539-547 (1996).
