Regenerering af klædt guld Microelectrodes udstyret til en Real-Time celle Analyzer
Summary
Denne protokol beskriver en generel strategi for at regenerere kommercielle klædt guld microelectrodes udstyret til en etiket-gratis celle analyzer sigter besparelse på de høje løbende omkostninger ofmicrochip-baserede assays. Regenereringsprocessen omfatter trypsin fordøjelse, skylning med ethanol og vand og en spinning skridt, som giver mulighed for gentagen brug af mikrochips.
Abstract
Etiket-gratis celle-baserede assay er fordelagtige for biokemisk undersøgelse på grund af det ikke kræver anvendelse af forsøgsdyr. På grund af dens evne til at yde mere dynamiske oplysninger om celler under fysiologiske tilstande end klassisk biokemiske assays, tiltrækker denne etiket-free real-time celle analyse baseret på princippet om elektrisk impedans mere opmærksomhed i løbet af sidste årti. Dens praktiske udnyttelse kan dog begrænset på grund af relativt dyre udgifter til måling af, hvor dyrt forbrugsmaterialer engangs guld mikrochips bruges til celle analysator. I denne protokol, har vi udviklet en generel strategi for at regenerere klædt guld microelectrodes udstyret til en kommerciel etiket-gratis celle analyzer. Regenereringsprocessen omfatter trypsin fordøjelse, skylning med ethanol og vand og en spinning trin. Den foreslåede metode er testet og vist sig at være effektiv for regenerering og gentagen brug af kommercielle elektroniske plader mindst tre gange, som vil hjælpe forskerne med at spare på de høje løbende omkostninger af real-time celle assays.
Introduction
På grund af dens effektive og mindre arbejdskrævende eksperimenterende proces, har etiket-gratis celle-baseret teknologi oplevet hurtige vækst i det sidste årti for såvel analytisk som screening formål, såsom i aspekt af proteomics1,2 , drug delivery3, etc.4,5 sammenlignet med traditionelle biokemiske metoder med henblik på celle analyse, etiket-free real-time celle assay med prototypen udviklet af Giaever og kolleger tidligere6 er baseret på princippet om registrering af elektrisk signal ændringer på overfladen af cellen-attached mikrochips, som tillader en kontinuerlig måling af cellevækst eller migration i en kvantitativ måde. Efter denne strategi, en real-time celle elektroniske sensing (RT-CES) system ved hjælp af elektrisk impedans-baseret detektion princippet blev indført7,8 og mere for nylig et kommercielt real-time celle analyzer (RTCA) blev lanceret for laboratoriet forskning9.
Kommercielle real-time celle analyzer primært læser celler evoked signaler af elektrisk impedans, der skyldes de fysiologiske ændringer af rugede celler herunder celleproliferation, migration, levedygtighed, morfologi og fastholdelse på den overfladen af mikrochips10,11. Elektriske signaler konverteres yderligere af analyzer til en dimensionsløs parameter med navnet celle indeks (CI) til at vurdere celle status. Ændringen af impedans af mikrochips afspejler hovedsagelig den lokale ionisk miljø overdækket celler i grænsefladen elektrode/løsning. Derfor, den analytiske ydeevne af celle analyzer er stærkt afhængig af core sensing enhed, den engangs mikrochips (dvs., såkaldt elektronisk plader, fx, 96/16/8-godt), som er lavet af klædt guld microelectrodes lithographically udskrives i bunden af inkubation brønde. De guld microelectrodes samles i en cirkel-on-line format (figur 1) og dækker det meste af arealet af inkubation wells, som giver mulighed for dynamisk og følsomme påvisning af tilknyttede celler3,12,13 ,14. CI vil øge for flere overfladedækning af celler på chippen og falde når cellerne er udsat for en giftstoffet resulterer i apoptose. Selvom real-time celle analyzer har ofte været brugt til at bestemme cytotoksicitet11 og neurotoksicitet15 og giver flere kinetic oplysninger end klassisk slutpunkter metode, er engangs elektronisk plader de dyreste forbrugsvarer.
Indtil nu har der været nogen tilgængelige metoder til regenerering af den elektroniske plade, som er sandsynligvis skyldes, at barske regenerering betingelser, såsom piranha løsning eller eddikesyre er involveret16,17, 18, som kan ændre den elektriske status af guld mikrochips. En mild og effektiv metode til at fjerne de vedhængende celler og andre stoffer fra overfladen af guld chips vil derfor være ønskeligt for elektroniske plade regenereringsprocessen. Vi har for nylig udviklet en protokol med henblik på regenerering af engangstændere elektronisk plader ved hjælp af ikke-korroderende reagenser og regenereret chips var karakteriseret ved elektrokemiske samt optisk metoder19. Ved hjælp af let tilgængelige og moderat laboratoriereagenser herunder trypsin og ethanol, har vi etableret en generel metode for at regenerere den kommercielle elektroniske plade uden bivirkninger, som er anvendt med succes til at regenerere de to hovedtyper af elektroniske plade (både 16 og L8) bruges til RTCA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi opsummerede flere tilgængelige metoder17,23,24,25,26 for regenererende mikrochips i tabel 1. Dybest set, disse metoder involveret relativt barske eksperimentelle betingelser til at opnå en fuldstændig regenerering af chips på grund af tilstedeværelsen af stærke molekyle-molekyle interaktioner som immun komplekset brugt til SPR chips. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet var støttet af National Natural Science Foundation of China (U1703118), et projekt finansieret af prioriterede akademiske Program udvikling af Jiangsu videregående institutioner (PAPD), Jiangsu Shuangchuang Program, åbne midler fra staten nøgle Laboratorium for kemo/Biosensing og kemometri (2016015) og det nationale laboratorium af Biomacromolecules (2017kf05) og Jiangsu Specially-Appointed Professor projekt, Kina.
Materials
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Stock reagents | reconstitution | Concentration used | Storage |
| Apo-transferrin | 10 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| N-acetyl cysteine | 5 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Sodium selenite | 2.5 mg/mL in H2O | 1:25,000 | -20°C |
| Collagen IV | 200 μg/mL in PBS | 1:100 | -80°C |
| TGF-b2 | 20 μg/mL in PBS | 1:10,000 | -20°C |
| IL-34 | 100 μg/mL in PBS | 1:1,000 | -80°C |
| Ovine wool cholesterol | 1.5 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparan sulfate | 1 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Oleic acid/Gondoic acid | Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparin | 50 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| Solutions | Recipe | Comments | |
| Perfusion Buffer | 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) | Use when ice-cold | |
| Douncing Buffer | 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ | Use when ice-cold | |
| Panning Buffer | 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite | Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. | |
| Collagen IV Coating | MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 | Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 | |
| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid | Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
References
- Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
- Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
- Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
- Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
- Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
- Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
- Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
- Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
- Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
- Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792 (2011).
- Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748 (2014).
- Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
- Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
- Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
- Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
- Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
- Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
- Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
- Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
- McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
- Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
- Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).
