Ativação de células da Müller Glia em um modelo de regeneração no Zebrafish e degeneração retiniana induzida por Laser
Summary
O peixe-zebra é um popular modelo animal para estudar os mecanismos da degeneração/regeneração da retina em vertebrados. Este protocolo descreve um método para induzir lesões localizadas perturbar a retina exterior com danos mínimos à retina interna. Posteriormente, acompanhamos na vivo a morfologia da retina e a resposta de glia Müller em toda a regeneração da retina.
Abstract
Uma fascinante diferença entre teleósteos e mamíferos é o potencial ao longo da vida da retina teleósteos para retina neurogênese e regeneração após danos graves. Investigar os caminhos de regeneração no zebrafish pode trazer novas perspectivas para desenvolver estratégias inovadoras para o tratamento de doenças degenerativas da retina em mamíferos. Neste documento, enfocamos a indução de uma lesão focal da retina exterior no zebrafish adulto por meio de um laser de díodo 532 nm. Uma lesão localizada permite investigar os processos biológicos que ocorrem durante a degeneração da retina e regeneração diretamente na área de danos. Usando a tomografia de coerência óptica não-invasiva (OCT), fomos capazes de definir a localização da regeneração subsequente danificada área e monitor in vivo. Com efeito, imagens OCT produz imagens de alta resolução, transversais da retina zebrafish, fornecendo informações que anteriormente só existiam disponíveis com análise histológica. A fim de confirmar os dados de outubro em tempo real, realizaram-se cortes histológicos e resposta regenerativa após a indução da lesão da retina foi investigada por imuno-histoquímica.
Introduction
Visão é, provavelmente, o sentido mais essencial do ser humano e sua deficiência tem um alto impacto sócio-económico. No mundo industrializado, doenças degenerativas da retina representam a maioria da perda de visão e cegueira entre a população adulta de1. Retinite pigmentosa (RP) é a causa herdada mais comum de cegueira em pessoas entre as idades de 20 e 60, afetando aproximadamente 1,5 milhões de pessoas em todo o mundo2,3. É uma família heterogénea de desordens hereditárias da retina, caracterizada por perda progressiva dos FOTORRECEPTORES (PRs) seguido de degeneração do epitélio pigmentar da retina e, posteriormente, gliose e remodelação de neurônios interna4. O curso da doença pode ser explicado pela perda incremental a dois tipos de células PR, geralmente começando com as hastes, que são responsáveis pela visão acromática na penumbra e os cones, que são essenciais para cor visão e acuidade visual5. Um defeito único gene é suficiente para causar a RP. Até agora mais de 130 mutações em mais de 45 genes têm sido associadas com a doença6. Isto leva a diferentes fenótipos de doença e é uma razão que a terapia genética é não-generalizáveis e, portanto, uma abordagem terapêutica intrincada. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver novas abordagens terapêuticas gerais para tratar os degenerations retinais em cegueira doenças.
Degeneração da retina, muitas vezes envolve a perda do PR; Portanto, a morte celular de PR é uma característica dos processos degenerativos na retina7. Já foi demonstrado que a morte de célula PR estimula Müller glia célula (MC) ativação e proliferação8. MCs, o tipo de célula glial principais na retina vertebrado, foram considerados uma vez como nada mais do que uma “cola” entre os neurônios da retina. Nos últimos anos, muitos estudos têm mostrado que os MCs agir como mais do que mera estrutural suportam9. Entre as diferentes funções, MCs também participem neurogênese e reparar10. Com efeito, em resposta a fatores diffusible da retina degeneração, MCs aumentam significativamente a expressão de proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Portanto, GFAP rotulagem pode ser usado como um marcador para ativação de MC como uma resposta secundária a lesão da retina e degeneração11.
Recentemente, nós desenvolvemos uma adaptação do romance de lesões focais, usando um laser para induzir a degeneração da retina no peixe-zebra (Danio rerio). Lesão focal é vantajoso para o estudo de certos processos biológicos, como a migração de células no local da ferida e o momento exato de eventos que ocorrem durante a regeneração da retina12. Além disso, o zebrafish tornou-se importante na pesquisa visual por causa das semelhanças entre o seu sistema visual e o dos outros vertebrados. Brutas características morfológicas e histológicas de humanos e teleósteos retinae exibem algumas diferenças. Por conseguinte, humanos e zebrafish retinae contêm as mesmas classes de célula principais organizadas no mesmo padrão em camadas, onde sensor de luz fotorreceptores ocupam a camada mais externa, enquanto os neurônios de projeção da retina, as células ganglionares, residem nas intimidades camada neuronal, proximal à lente. Os interneurônios da retina, o amacrine, bipolar e células horizontais, localizar-se entre o fotoreceptor e gânglio célula camadas13. Além disso, a zebrafish retina é cone-dominado e, portanto, mais próximo da retina humana que, por exemplo, a retina de roedor intensivamente estudada. Uma fascinante diferença entre teleósteos e mamíferos é a neurogênese persistente na retina de peixe e regeneração da retina após danos. No zebrafish, MCs podem dedifferentiate e mediar a regeneração em retina lesada14,15. Frango, MCs têm alguma capacidade também para re-introduzir o ciclo celular e dedifferentiate. Após lesão da retina em peixes adultos, MCs adoptarem certas características do progenitor e células-tronco, migram para o tecido danificado da retina e produzem novos neurônios16. Gene expressão perfilação de mamíferos MCs revelou inesperadas semelhanças com progenitores da retina, e evidência de potencial neurogênica intrínseca de MCs no frango, roedores e retina humana está crescendo17. No entanto, porque a resposta regenerativa em aves e mamíferos é menor comparada com a resposta robusta em peixes não é ainda compreendida. Portanto, compreender os mecanismos de reparação endógena no zebrafish pode sugerir estratégias para estimular regeneração da retina em mamíferos e seres humanos. Empregar o mecanismo de reparação endógena de MCs como uma ferramenta terapêutica para o tratamento de pacientes com degeneração da retina teria um impacto notável para a nossa sociedade.
Neste documento, nós fornecemos as etapas necessárias para empregar o modelo de degeneração/regeneração em pesquisa oftálmica. Primeiro enfocamos induzindo focal danos na retina marcante, em seguida, sobre as imagens dos eventos, desenvolvendo-se no local da lesão e finalmente revelador envolvimento dos MCs adjacentes. O protocolo geral é relativamente fácil de executar e abre uma grande variedade de possibilidades para avaliar a retina depois.
Protocol
Representative Results
Discussion
Regeneração/degeneração da retina no zebrafish foi investigada por abordagens diferentes, como de morte celular mediada por cytotoxin22, lesão mecânica23e lesões térmicas24. Utilizamos um laser de díodo 532 nm para danificar a retina do zebrafish. Desse modo, nosso modelo oferece várias vantagens. Por exemplo, rapidamente criamos uma área bem definida de lesões localizadas na retina exterior, especificamente na camada de fotorreceptores. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Martin Zinkernagel, MD, PhD e Miriam Reisenhofer, PhD pela sua entrada de científica no que estabelece o modelo e Federica Bisignani pela sua excelente assistência técnica.
Materials
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
References
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