עכשיו, דונלד מילר הפעלת תא לייזר המושרה ניוון הרשתית, התחדשות מודל בדג זברה
Summary
דג זברה היא דוגמנית החיות פופולרי לחקור מנגנונים של ניוון רשתית/התחדשות גולגולת. פרוטוקול זה מתאר שיטה לזירוז מקומי פגיעה שיבוש הרשתית החיצונית עם נזק מינימלי הרשתית הפנימי. לאחר מכן, אנחנו מפקחים ויוו המורפולוגיה הרשתית ואת התגובה עכשיו, דונלד מילר ברחבי התחדשות ברשתית.
Abstract
הבדל מרתק בין teleost לבין היונקים הוא הפוטנציאל לכל החיים של הרשתית teleost נוירוג’נסיס ברשתית, חידוש לאחר נזק חמור. חוקרים של מסלולים התחדשות של דג זברה עשוי להביא תובנות חדשות לפיתוח אסטרטגיות חדשניות לטיפול במחלות ניווניות ברשתית אצל יונקים. במסמך זה, התמקדנו אינדוקציה של פגיעה נקודתית אל הרשתית החיצונית בדג זברה למבוגרים באמצעות 532 ננומטר דיודת לייזר. פגיעה מקומי מאפשר לחקור תהליכים ביולוגיים המתרחשים במהלך ניוון הרשתית והתחדשות ישירות על האזור של נזק. באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית פולשני (אוקטובר), היינו מסוגלים להגדיר את המיקום של רגנרציה עוקבות אזור וצג פגום ויוו. אכן, OCT דימות מייצרת תמונות ברזולוציה גבוהה, חתך הרוחב של הרשתית דג זברה, מתן מידע אשר זמינים בעבר רק באמצעות ניתוחים היסטולוגית. על מנת לאשר את הנתונים בזמן אמת OCT, בוצעו מקטעים היסטולוגית, התגובה הרגנרציה לאחר אינדוקציה הפגיעה ברשתית נחקר על ידי אימונוהיסטוכימיה.
Introduction
החזון הוא כנראה תחושת החיוניות ביותר של האדם, ליקוי שלה יש השפעה סוציו-אקונומי גבוה. בעולם המתועש, מחלות ניווניות של הרשתית חשבון עבור הרוב המכריע של אובדן ראייה ועיוורון בקרב אוכלוסיית הבוגרים1. רטיניטיס פיגמנטוזה (RP) הוא הגורם תורשתית השכיחה ביותר לעיוורון בקרב אנשים בין הגילאים 20-60, להשפיע על 1.5 מיליון אנשים ברחבי העולם2,3. זה משפחה הטרוגנית של הפרעות רשתית תורשתיות מאופיין על ידי אובדן הדרגתי של photoreceptors (PRs) ואחריו ניוון של אפיתל הפיגמנט ברשתית, לאחר מכן, gliosis ובניה של נוירונים הפנימית4. הקורס של המחלה יכולה להיות מוסברת על ידי אובדן מצטבר שני סוגי יחסי ציבור תא, מתחיל בדרך כלל עם מוטות, אשר אחראים על חזון אכרומטי אור עמום, קונוסים, המהווה מרכיב חיוני עבור צבע חזון, חדות הראייה5. פגם גנטי יחיד מספיקה לגרום RP. עד כה יותר מ-130 מוטציות בגנים מעל 45 קושרו עם מחלת6. זה מוביל פנוטיפים מחלות בדרגות שונות, היא אחת הסיבות לכך ריפוי גנטי שאינו להכליל ובכך גישה טיפולית מסובכים. לכן, יש צורך דחוף לפתח גישות טיפוליות כללי חדש לטיפול degenerations רשתית במסנוור מחלות.
ניוון הרשתית לעתים קרובות כרוך אובדן יחסי ציבור; לכן, מוות של תאים PR הוא סימן היכר של התהליכים ניווניות הרשתית7. זה כבר הוכח כי מוות של תאים יחסי ציבור מעוררת מולר עכשיו, דונלד תא (MC) הפעלת והתפשטות8. MCs, הסוג של תא גליה הגדולות ב הרשתית חוליות, נחשבו בעבר להיות לא יותר מאשר “דבק” בין הנוירונים ברשתית. בשנים האחרונות, מחקרים רבים הראו כי MCs לפעול כתמיכה יותר מבני גרידא9. בין הפונקציות השונות, MCs להשתתף גם נוירוג’נסיס ותיקון10. אכן, בתגובה גורמים diffusible של הרשתית המתנוונת, MCs להגדיל באופן משמעותי ביטוי חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP). לכן, GFAP תוויות יכול לשמש כסמן להפעלה MC כתגובה משני פגיעה ברשתית, ניוון11.
לאחרונה, פיתחנו עיבוד הרומן של פגיעה נקודתית באמצעות לייזר לזירוז ניוון רשתית בדג זברה (רזבורה rerio). פגיעה נקודתית יש יתרון ללימוד תהליכים ביולוגיים מסוימים כגון ההעברה של תאים לתוך האתר פצוע ותזמון מדויק של האירועים המתקיימים במהלך התחדשות ברשתית12. יתר על כן, דג זברה הפך חשוב במחקר חזותי בגלל הדמיון בין מערכת הראייה שלה וגם של בעלי החוליות. תכונות היסטולוגית מורפולוגיים ברוטו של האדם ושל teleost retinae להציג כמה הבדלים. בהתאם, retinae האדם, דג זברה מכילים את אותן הכיתות תא מרכזי שאורגן אותו דפוס בשכבות, איפה אור חישה photoreceptors לכבוש את השכבה החיצונית ביותר, בעוד הנוירונים ברשתית הקרנה, תאי גנגליון, שוכנים לנגדו שכבת עצביים, מקורב על העדשה. את interneurons ברשתית, אמקרין, הפרעה דו קוטבית, תאים אופקיים, להתאים בין קולט אור, גנגליון תא שכבות13. יתר על כן, הרשתית דג זברה הוא נשלט-חרוט, ולכן קרוב יותר הרשתית האנושית מאשר, למשל, הרשתית מכרסמים למד באופן אינטנסיבי. הבדל מרתק בין teleost לבין היונקים הוא נוירוג’נסיס מתמיד דגים רשתית, חידוש ברשתית לאחר נזק. דג זברה, MCs יכול dedifferentiate, לתווך התחדשות רשתית נפצעו14,15. עוף, MCs יש יכולת גם להזין מחדש את מחזור התא, dedifferentiate. בעקבות פגיעה ברשתית בדגים הבוגרים, MCs לאמץ מאפיינים מסוימים של קדמון, תאי גזע, להגר ברשתית הרקמה הפגועה, לייצר נוירונים חדשים16. ג’ין ביטוי פרופיל של MCs יונקים חשף דמיון לא צפוי אבות ברשתית, וגדל ראיות על הפוטנציאל neurogenic מהותי של MCs עוף, מכרסם, רשתית העין האנושית אפילו17. ובכל זאת, למה התגובה משובי ציפורים, יונקים מושווה נמוך עם תגובת חזקים ב דגים הוא לא הבנתם. לכן, הבנת מנגנוני תיקון אנדוגני דג זברה יכול להציע אסטרטגיות עבור התחדשות ברשתית מגרה יונקים ובבני אדם. העסקת מנגנון תיקון אנדוגני של MCs כמכשיר טיפולי לטיפול של חולים עם ניוון הרשתית תהיה השפעה יוצאת דופן בחברה שלנו.
במסמך זה, אנו מספקים את השלבים הנחוצים להפיכת להעסיק את המודל ניוון/התחדשות במחקר אופטלמולוגיות. אנחנו התמקדנו קודם גרימת נזק מוקד ברשתית neurosensory, ואז על ההדמיה של אירועים פיתוח אתר הפציעה, ו סוף סוף להמחיש במעורבות MCs סמוכים. פרוטוקול כללי קל יחסית לבצע ופותח מגוון רחב של אפשרויות להערכת הרשתית לאחר מכן.
Protocol
Representative Results
Discussion
התחדשות/ניוון הרשתית דג זברה נחקר על ידי גישות שונות כגון מוות תא בתיווך cytotoxin22, פגיעה מכנית23פציעה תרמי24. אנחנו מועסקים 532 ננומטר דיודת לייזר לפגיעה ברשתית דג זברה. ובכך, המודל שלנו מציע מספר יתרונות. למשל, במהירות יצרנו אזור מוגדר היטב של פגיעה מקומית…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים מרטין Zinkernagel, MD, PhD, מרים Reisenhofer, PhD לקלט המדעי שלה להקים את הדגם ואת Federica Bisignani לסיוע טכני מעולה שלה.
Materials
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
References
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Berson, E. L. Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).
- Strettoi, E. A Survey of Retinal Remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 494 (2015).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications. Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).
- Pierce, E. A. Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations. BioEssays. 23, 605-618 (2001).
- Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury. Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).
- Newman, E., Reichenbach, A. The Müller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).
- Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates. Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).
- Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats. Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).
- DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).
- Xia, X., Ahmad, I. Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia. Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , 7-38 (2002).
- Riepe, R. E., Norenburg, M. D. Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina. Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).
- Derouiche, A., Rauen, T. Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance. J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).
- Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).
- Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).
- Cameron, D. A., Carney, L. H. Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly. J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev Biol. 6, 36 (2006).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits. Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).
- Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. (2), 223-234 (2008).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J Vis Exp. (80), e51017 (2013).
