Establecimiento de pez cebra Larval como modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidad En Vivo

los siguientes protocolos fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso Comité de Los Andes Universidad (CICUAL). Nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) directrices deben seguirse estrictamente para evitar la contaminación con el patógeno T. cruzi. Nota: mantenimiento y cuidado de los animales: pez cebra Casper, una cepa genéticamente modificada de pez cebra (Danio rerio) se utiliza en el presente Protocolo debido a su transparencia óptica valiosa en todas las etapas del desarrollo. Peces son manipulados con atención óptima condiciones para la especie 14, en un 14 h luz-10 h oscuro ciclo a 28 ± 1 ° C, en un pH (7.0-7.4) controladas múltiples tanque recirculación agua sistema. Animales son alimentados dos veces al día con vivo Artemia (Artemia salina) y enriquecidos con alimento de cría. Todos los protocolos fueron aprobados por CICUAL en Universidad de los Andes (C.FUA_14-017). 1. preparación de huevo agua preparar sal de acuario de 0.6 g/L en inversa ósmosis o agua desionizada (DI) y añadir azul de metileno 0,01 mg/L a la solución. Nota: La conductividad medida debe ser de 400-500 μS/cm y pH nivel en 7.2-7.9. Para bajar el pH, airear el agua del huevo durante unas horas. 2. Preparación de solución madre de Metanosulfonato preparar 0,4% tricaine solución madre disolviendo 400 mg Metanosulfonato (MS-222), en 97,9 mL de agua destilada (ddH 2 O). Después de que el polvo se ha disuelto completamente, ajustar el pH a 7.0 con 2,1 mL 1M Tris (pH 9.0) y refrigere la solución. 3. Preparación de 1.0% agarosa de bajo punto de fusión disolver el polvo de agarosa de punto de fusión bajo en huevo agua a una concentración final de 1.0%. Calienta la mezcla en el microondas o en un plato caliente con agitación continua hasta que la solución de agarosa aparece homogénea. Almacenar las alícuotas a 4 º C durante no más de una semana. 4. Ensayo y la colección embrionaria de apareamiento tres días antes de las inyecciones de establece acoplamientos con parejas sanas de peces machos y hembras en los tanques de cría. Enriquecimiento con canicas de vidrio y plantas artificiales mejora de desove. Apareamientos deben ser durante la tarde y noche. a la mañana siguiente, recoger los huevos enraícen por drenar el tanque a través de un colador y lavar los huevos con el agua del huevo. Eliminar todos los huevos por invertir el colador y verter agua huevo a través del tamiz en una placa Petri. Para mantener los embriones sanos, su agua limpia quitando cualquier suciedad y embriones muertos con una pipeta plástica. Transferencia de los embriones en una incubadora a una temperatura estable de 28,5 ° C para permitir el desarrollo de los embriones según el pez cebra provisional normas 15. Examinar los embriones dos veces al día y descartar huevos inviable para mantener saludable el embrague. 5. Embrión Dechorionation Nota: este procedimiento es necesario si los embriones no han incubado en el momento de la inyección. En este procedimiento, " las larvas " son animales fuera de su corion desde 48 h post fertilización (hpf) adelante. En el día del experimento, colocar la placa Petri que contiene los embriones sanos bajo un estereoscopio disección. Tome extremos opuestos del corión con dos pinzas afiladas (Dumont #5), y suavemente rasgar y tirar abren el corion. Son imágenes de unos 5-6 larvas se inyectan a la vez y por lo general 3-4. Quitar las chorions de agua usando una pipeta de transferencia. 6. Preparación de Material de inyección preparar 1.0 mm agujas con Capillares de vidrio de paredes delgadas y un dispositivo de tirador de la micropipeta con la siguiente configuración: 2 pesos ligeros 1 peso pesado, tirón superior 2 mm + 5 mm fondo pull, 75,9 ° C (paso 1) + () de 78,2 ° C Paso 2). Almacenar las agujas en un plato de Petri en una tira de plastilina. La aguja ideal debe tener una punta estrecha, como T. cruzi medir aproximadamente 20 x 1-3 μm y pasar fácilmente a través de la aguja. Puede variar la longitud de la punta: una punta más larga es útil para llegar a estructuras más profundas, pero una extremidad más corta será más rígida, facilitando la inyección para el usuario. Nota: El tamaño de la punta de la aguja depende de la temperatura: una temperatura elevada para el paso 2 resulta en una punta más fina y más. Preparar una solución de agarosa al 1,5% en ddH 2 O y viértalo en un plato de Petri de 10 cm. Cubrir una profundidad de aproximadamente 1,0 cm. Colocar un molde prefabricado microinyección sobre la agarosa y déjelo solidificar. Levantar el molde prefabricado microinyección hacia fuera y añadir agua de huevo para el almacenamiento a 4 ° C. Esto evita que la agarosa se sequen. Huevo de agregar agua a la solución a una concentración final de 150 mg/L. tienda 4 Metanosulfonato ° C. 7. Cultivo de células para el crecimiento del parásito parásitos se mantienen en una línea celular de astrocitoma humano (CRL-1718) usando el método descrito por Vargas Zambrano et al. 16 iniciar el cultivo de células humanas en un frascos de cultivo T25 (superficie = 25 cm 2) con una densidad de 2 x 10 5 o 4 x 10 5 células en 4 mL de Medio RPMI-1640 con 10% de suero fetal de ternero (FCS), complementado con 2 mM L-glutamina, 4,5 g/L glucosa, 10 mM HEPES, piruvato de 1 mM y 1% de penicilina-estreptomicina (referido como " completar los medios de comunicación "). Incubar los cultivos de astrocitoma a 37 ° C en un 5% CO 2 ambiente. Una vez una monocapa confluente, separar las células con 2 mL de 0,25% de tripsina-EDTA por incubar 3 min a 37 ° C. visualmente Verifique las células para la separación y bloquear la solución de tripsina usando 3 mL de RPMI-1640 con 10% FCS en un tubo de 15 mL. Centrifugar la suspensión celular por 5 min a 1.350 x g. Lavar el pellet celular resultante en medio DMEM en un tubo de 15 mL y centrifugar durante 5 min a 1.350 x g a 22 ° C. Contar las células manualmente en una cámara de Neubauer y Compruebe la viabilidad en un microscopio óptico a 40 aumentos. Resuspendió suavemente el celular pellets en 4 mL de medio completo y utilizarlo para crear nuevos cultivos celulares utilizando 2 x 10 5 células cada frasco de cultivo T25. 8. T. cruzi cultura y etiquetado parásitos son una cepa originalmente obtenido de un humano infectado y caracterizado como cepa de T. cruzi DA (MHOM/CO/01/DA), genotipo TcI unidad discreta de tipificación (DTU) 16. Después de 3 o 4 días de cultivo, recoger los parásitos móviles en el sobrenadante de cultivo celular humano astrocytoma y centrifugar durante 5 min a 1.350 x g. descartar el medio. Nota: Los parásitos en el medio completo pueden utilizarse para volver a la cultura en una proporción 1:1 con las células de astrocitoma en frascos de cultivo T25. Suavemente vuelva a suspender el sedimento en 10 mL estéril 1 x de Buffer de fosfato salino (PBS) con 0.1% de FCS y centrifugar durante 5 min a 1.350 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender en 1 mL de PBS. Tomar 10 μL para contar los parásitos nadan libremente en una cámara de Neubauer. El resto de los parásitos suspendidos de nuevo (990 μL) y añadir 1 μl de Carboxyfluorescein Diacetato de SuccinimiDYL éster (CFSE), concentración final 5.0 μm. Incubar 10 min a temperatura ambiente. Nota: CFSE 5 mm debe ser alícuotas y mantenidos a -20 ° C. De la pelotilla de los parásitos (1.350 x g, 5 min). Reconstituir la pelotilla del parásito por sacudiendo el tubo y lávela en 10 mL de 1 x PBS-0.1% FCS seguidos de un exprimido posterior (1.350 x g, 5 min). Eliminar el sobrenadante y suavemente volver a suspender el sedimento de parásito etiquetados en 1 X PBS con el volumen adecuado para obtener una concentración final de aproximadamente 10-20 parásitos/nL para inyección. Utilizar un pequeño volumen (∼ 10 μl, aproximadamente 1 x 10 4 -2 x 10 4 parásitos) de tripomastigotos evaluar viabilidad y etiquetado. Un microscopio invertido de fluorescencia puede utilizarse para la visualización directa de los parásitos. En el modo de luz transmitido, compruebe que los parásitos se mueven. En el modo de fluorescencia, utilice el filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) para evaluar parásito etiquetado. 9. Inyección de larvas de pez cebra carga del parásito tomar 10 μl de parásitos de la resuspensión (100 μL) y cargarlos en las agujas de cristal utilizando una pipeta de microloader de 10 μl. Insertar la aguja de vidrio en el soporte de la aguja de las amalgamas dentales, utilizan un soporte magnético y colocar al lado el estereoscopio. Pinzas finas usando bajo el estereoscopio, cortar la aguja creando un embotado abierto fin y medir el tamaño de la gota para obtener un volumen de inyección de 1 nL (esto es equivalente a un diámetro de grano de 0.12-0.13 mm cuando se mide en aceite mineral 17). Un Consejo más es preferido para que la aguja puede alcanzar estructuras profundas dentro de los peces sin dañar el tejido. En este protocolo, se utiliza una aguja embotada, pero puede utilizarse una aguja biselada así. De montaje anestesiar larvas de 48 hpf con Metanosulfonato de 150 mg/L. Compruebe que no responden al tacto, pero asegúrese de que está latiendo el corazón. Colocar las larvas en el molde de agarosa de microinyección en posición lateral. Coloque el soporte de la aguja al lado del estereoscopio y ajustar el instrumental quirúrgico para que la punta de la aguja está en el centro del campo de visión. Mueva la caja Petri preparada en pasos de 6.2 a 6.4 para que la yema larval está cerca de la punta de la aguja. Comprobar el estado de la larva para asegurarse de que el corazón latir. Establecer los valores microinyectora como sigue: inyección 9,6 libras por pulgada (psi) de presión, mantiene la presión: 20 psi, 100 ms gama de gating; valor período de 1,9 (corresponde a 10,9 ms). El volumen de la inyección debe ser entre 1-3 nL, con aproximadamente 10-20 parásitos/nL. 10. Inyección del parásito inyectar el pescado en la parte superior anterior de la yema en el conducto de Cuvier. Este paso debe realizarse para asegurar la supervivencia de animales después de la inyección. Tarda aproximadamente 10 min para inyectar con éxito 5-6 larvas. Como control, se inyectan 1-2 larvas con el mismo volumen del vehículo (1 x PBS). Transferencia de la larva a agua fresca al huevo inmediatamente. 11. LSFM montaje de inyecta larvas transferencia de la larva inyecta con parásitos a un plato de Petri vacío y retire con cuidado el agua circundante con una pipeta de plástico y papel absorbente. Añadir 100 μl de precalentado 1.0% agarosa de punto de fusión bajo (consulte el paso 3 para la preparación de agarosa) para cubrir la larva. Asegurar la agarosa no es más de 40 ° C. Insertar un alambre dentro de un capilar de vidrio de 1.0 mm y usarlo como un émbolo para aspirar la larva en posición vertical. Asegúrese de dejar una pequeña cantidad de agarosa sobre la larva. Espere hasta que la agarosa se solidifique antes de exponer la larva (esto requerirá unos minutos). Si es necesario, empuje hacia fuera de agarosa sobrante por debajo de la larva y córtelo apagado Coloque el capilar en el portamuestras de microscopio y empuje hacia afuera el extremo que contiene la larva hasta que cuelga libre de los capilares. La cámara de muestra deberá ser rellenada con solución de Metanosulfonato (150 mg/L) y la temperatura de 28 ° C. Coloque la larva delante de la pupila del objetivo de detección utilizando un micromanipulador XYZ sistema. Rotaciones sobre el eje vertical, usar de escenario una rotación. Posicionamiento de la larva debe hacerse en el modo de luz transmitido para identificar claramente las estructuras larvales. 12. LSFM proyección de imagen de la inyección de parásitos modo de cambio de fluorescencia y ajustar la intensidad de iluminación, así como el tiempo de exposición para disminuir fotodaño y optimizar tiempo resolución. Para estos experimentos particulares, utiliza una potencia de 2.8-3.0 mW para la muestra y expone cada fotograma para 200 ms usando una cámara con 6,45 μm píxeles y eficiencia cuántica de ~ 70% en las longitudes de onda de detección. Esta configuración debe dar lugar a imágenes adecuadamente expuestos en unos 5 cuadros/s. Asegúrese de que utilizar un objetivo con la mayor apertura numérica posible. Iniciar una adquisición video de la región de interés (ROI). En nuestro caso, se observan parásitos adheridos a válvulas y libremente móvil en el área del corazón. Se recomienda tomar un video de un solo plano con el tiempo, o para utilizar el sistema de instrumental quirúrgico o piezo galvo enfocar diferentes planos mientras se mueve el parásito. Nota: Este procedimiento es útil para los tiempos de adquisición cortos de hasta 2 h. Para la adquisición a largo plazo, las larvas deben montarse utilizando métodos alternativos 20. 13. Tratamiento y análisis de datos adquiridos de imágenes Nota: tratamiento de la imagen fue realizada en un ordenador personal con un procesador GHz 2,90 8,00 GB de memoria y una tarjeta de video con 1,00 GB de memoria. Conjunto de datos de abierta la adquirida en el software de la opción de procesamiento de imágenes. El open software FiJi recomienda LSFM procesamiento de datos y análisis 21. En el software de análisis de imagen, ajustar niveles de brillo y contraste para mejorar las imágenes. Nota: No hay parámetros fijos son usados en este caso pero seleccionando la " Auto " opción puede ser útil para obtener una mejora inicial. Seleccione el retorno de la inversión. Nota: Para el seguimiento de los parásitos, FiJi tiene tanto seguimiento manual y automática de plugins disponibles. 14. Recuperación de larvas imágenes quitar la larva cuidadosamente de la agarosa usando Pinzas finas y una herramienta de lazo de pelo. Transferir el pescado a huevo fresco agua y comprobación para la recuperación después de 15 minutos volver a la larva a incubadora a 28 ± 0,5 ° C. Alternativamente, proceder a la eutanasia las larvas reflejadas con una sobredosis de Metanosulfonato. A continuación, introducir las larvas en una solución de hipoclorito de sodio (6.15% NaClO) durante 5 minutos matar el parásito. Disponer según la institución ' protocolos de s.