調査cruzi トリパノソーマの原因運動In Vivo動物モデルとしてのゼブラフィッシュ稚魚の確立

次のプロトコルは、機関動物ケアおよび使用委員会のロス アンデス大学 (CICUAL) によって承認されました。バイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) ガイドラインは病原体による汚染を防ぐために厳密に従う必要があります t. 原因。 注: 動物のケアとメンテナンス: キャスパー ゼブラフィッシュ ゼブラフィッシュの遺伝子組み換え株 (Danio rerio) すべての発達段階で彼らの貴重な光の透過性によりこのプロトコルで使用します。魚を操作するには、最適なケア種 14、14 h 光 10 h 暗いサイクル 28 ± 1 ° C、pH (7.0 7.4) 制御条件多槽循環水システムを使用します。動物はライブ ブラインシュリンプ (アルテミア) の 1 日 2 回を供給され、濃縮食品を飼育します。すべてのプロトコルは、デロス アンデス (C.FUA_14-017) で CICUAL によって承認されました。 1 です卵水の準備 内 準備 0.6 g/L 水族館塩逆浸透 (RO) または純水 (DI)、0.01 mg/L メチレン ブルーをソリューションに追加します。 。 注: 測定伝導率 400-500 μ S/cm と pH のレベルでなければなりません 7.2 7.9 に。PH を下げるため、数時間の卵水を通気します。 2。Tricaine ストック溶液の調製 97.9 蒸溜水 (ddH 2 O) 400 mg tricaine (MS-222) を溶解することにより 準備 0.4 %tricaine 原液。粉を完全に溶かし後、2.1 mL 1 M を使用して 7.0 に pH を調整するトリス (pH 9.0) ソリューションを冷蔵と。 3。1.0% の低融点アガロース 卵低溶解点 agarose 粉末が溶解水 1.0% の最終的な集中に。アガロース溶液が均一な表示されるまで連続攪拌にホット プレート、電子レンジでの混合物を熱します。 もはや一週間以上のための 4 ° C で因数を格納します。 4。アッセイと胚のコレクションとの交配 3 日注射の前にわれわれのタンクを繁殖の男性と女性の魚の健康的なペアを使用して設定します。ガラス玉や人工植物の濃縮は、産卵を向上させます。交配を午後時を設定し、一晩放置する必要があります。 次の朝、こし器を通ってタンクを流出させると卵水と卵を洗浄によって生み出された卵を収集します。こし器の反転とストレーナーをペトリ皿に卵水を注いで、すべての卵を削除します。胚を健康に保つために、残骸および転送プラスチック ピペットと死胚を削除してその水をきれいします。 は、ゼブラフィッシュ ステージング基準 15 によると胚の開発を許可する 28.5 ° C の温度が安定して培養する胚を転送します。一日に二回、胚を調べるし、クラッチを健康に保つために inviable 卵を破棄します。 5。胚 Dechorionation 注: 胚の注入の時に孵化したない場合、この手順が必要です。この手順で " 幼虫 " 48 h から、絨毛膜から動物ポスト受精 (hpf) 以降が。 実験の日、解離性万国実体写真の下で健康な胚を含むペトリ皿を配置します。 2 つの鋭い鉗子 (デュモン #5)、絨毛膜の反対の端をつかむし、優しく涙とプルは絨毛膜を開きます。約 5-6 の幼虫は、一度に注入されると通常 3-4 をイメージします。 転送ピペットを使用して水から、絨毛を削除します。 6。注入材料を準備する 準備 1.0 mm 針でガラス管を薄肉とマイクロ ピペットの引き手デバイスを使用して次の設定で: ライトウ エイト 2 + 1 の重量、2 mm トップ プル + 5 mm 下に引っ張り、75.9 ° C (ステップ 1) + 78.2 ° C (ステップ 2)。粘土のストリップにシャーレに針を格納します。理想的な針が必要 t. の原因 としての狭い先端約 20 x 1-3 μ m を測定し、簡単に針が通過。先端の長さが変わることができる: より長いヒントはより深い構造に到達するため便利ですが、短いヒントはより堅いユーザーの注入を容易になります 。 注: ニードル先端サイズによって異なります使用温度: ステップ 2 の高温が長く、細かいヒント結果します。 は、ddH 2 O で 1.5% アガロース溶液を準備し、10 cm シャーレにそれを注ぐ。約 1.0 cm の深さをカバーします。 Agarose をプレハブのインジェクション金型を置き、固めることができます。 うちプレハブのインジェクション金型を持ち上げ、4 ° C で保存用卵水を追加Agarose を乾燥から防ぐこれ。 4 で 150 mg/l. 店の最終濃度に tricaine 原液を追加卵水 ° C 7。寄生虫の成長のための細胞培養 寄生虫はバルガス ザンブラーノ ら で説明したメソッドを使用して人間の星状細胞腫細胞株 (CRL-1718) に保持されます。 16 コート t25 フラスコ培養フラスコにひと細胞の培養を開始 (表面積 = 25 cm 2) 2 x 10 5 または 10% 牛胎児血清 (FCS) の RPMI 1640 培地 4 mL に 4 x 10 5 セルの密度で補われます。2 mM L グルタミン、4.5 G/L グルコース、10 mM HEPES、1 mM ピルビン酸 1% ペニシリン-ストレプトマイシンと (呼ばれる " メディアを完了 ")。37 ° c 5% CO 2 環境で星状細胞腫文化をインキュベートします。 単層が合流すると、それらの 37 ° c. 視覚的にチェックのための細胞剥離、3 分の孵化によって 0.25% トリプシン-EDTA の 2 mL を使用してセルを外し、15 mL チューブに 10% FCS RPMI 1640 の 3 mL を用いたトリプシン溶液をブロックします。 1,350 x g に 5 分の細胞懸濁液を遠心分離 15 mL チューブと 22 で 1,350 × g で 5 分間遠心 DMEM 培地の結果細胞ペレットを洗う ° C ノイバウアー商工会議所と顕微鏡 40 倍の倍率での生存率を確認する手動でのセルをカウントします。 優しく再中断細胞の完全なメディアの 4 mL にペレット、T25 培養用フラスコあたり 2 x 10 の 5 セルを使用して新しい細胞培養の作成に使用します。 8 。T. 原因 文化とラベリング の寄生虫は、もともと感染した人間から得られ、t. の原因 DA 株 (MHOM/株/01/ダ)、として特徴付けられるひずみ遺伝子型離散入力ユニット (DTU) TcI 16。養殖の 3 または 4 日間人間の星状細胞腫細胞の培養上清 1,350 x g. で 5 分間遠心から移動寄生虫を収集後、培地を除去 。 注: 完全培地に寄生虫は再コート t25 フラスコ培養フラスコで星状細胞腫細胞と 1:1 の比率で文化のため使用できます。 優しく 1,350 x g に 10 mL 滅菌 1 リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) 0.1% の FCS と 5 分間遠心する x のペレットを再停止 は、上澄みを廃棄し、再 1 mL の PBS で中断します。ノイバウアー チャンバー内で自由遊泳性の寄生虫をカウントするための 10 μ L を取る。 (990 μ L) の再懸濁の寄生虫の残りの部分を取るし、Carboxyfluorescein 二酢酸一 Succinimi の 1 μ L を追加dyl エステル (CFSE)、最終濃度 5.0 μ M. 室温で 10 分間加温 。 注: 5 mm CFSE 株式は避けようと-20 で維持をする必要があります ° C ペレット寄生虫 (1,350 × g、5 分) です。チューブをフリックすることで寄生虫のペレットを再構成し、PBS-0.1% FCS は続いてそれに続くスピン (1,350 × g、5 分) 1 x の 10 mL で洗うです。 上澄みを廃棄し、優しく再取得についての最終濃度に適切なボリュームの 1x PBS でラベルの付いた寄生虫ペレットを中断注射用 10 20 寄生虫/nL。 は、少量を使用 (∼ 10 μ L、約 1 × 10 4-2 x 10 4 寄生虫) 生存率とラベリングを評価する trypomastigotes の。倒立蛍光顕微鏡は、寄生虫の直接可視化に使用できます。透過光モードで寄生虫が移動することを確認します。蛍光モードで寄生虫のラベリングを評価するフルオレセイン イソチオ シアン酸 (FITC) フィルターを使用します。 9。ゼブラフィッシュ幼虫を注入する の 寄生虫の読み込み 再懸濁 (100 μ L) から寄生虫の 10 μ L をとり 10 μ microloader のピペット チップを使用して密封されたガラス針にそれらを読み込む。 マニピュレーターの針ホルダーにガラス針を挿入、磁気スタンドを使用してし、万国実体写真の隣に配置します。 鈍オープンを作成する針をカット、万国実体写真の下微細鉗子を使用を終了し、1 の注入量を取得するドロップ サイズを測定 nL (これは鉱物油 17 において測定する場合 mm 0.12 0.13 のビード径に相当)。針は構造にアクセスできるように、長く先端が最寄り、組織を損傷することがなく魚の奥深く。このプロトコルでは、鈍針が使用されて、しかし、ベベル針を使用することもできます。 マウント 48 の幼虫を麻酔 hpf 150 mg/L tricaine で。彼らは、タッチに応答しないことを確認、確保心臓が。 側臥位マイクロインジェクション agarose 金型で幼虫を配置します。 は、株分け業横針ホルダーを置き、針の先端が視野の中心にはマニピュレーターを調整します。6.4 6.2-の手順で準備して仔魚の卵黄が針の先端に近いペトリ皿を移動します。心臓が鼓動を続けているように幼虫の状態を確認します。 マイクロインジェクター値のとおり設定: 注入圧力 9.6 ポンド インチ (psi); 圧力を保持: 20 psi; ゲートの 100 ms の範囲、期間値が 1.9 (10.9 ms に相当)。注入量は約 10-20 寄生虫/nL との 1-3 nL の間する必要があります。 10。寄生虫の注入 注入キュビエのダクトで卵黄の上前の部分の魚。この手順は、投与後動物の生存を確保する練習する必要があります。5-6 幼虫を正常に注入する約 10 分がかかる。 コントロールとして同じ車両容積 (1 x PBS) 1 2, 幼虫を投入します。 幼虫を新鮮な卵水にすぐに転送します。 11。LSFM マウントの注入幼虫 空のシャーレに寄生虫を注入した幼虫を転送し、プラスチック ピペットと吸水紙と周囲の水を慎重に取り外します。予熱した 1.0% 低融解点 agarose の 100 μ L をすぐに追加 (アガロース調製の手順 3 を参照)、幼虫をカバーします。Agarose がない 40 歳以上を確認 ° C は 1.0 mm のガラス管の中の直線を挿入し、垂直位置に幼虫を吸うプランジャーとしてそれを使用します。幼虫上 agarose の少量を残すことを確認します。Agarose (これは数分かかります) 幼虫を公開する前に凝固するまで待機します。必要に応じて、幼虫の下の余分な agarose を押し出すし、オフを切って 毛細血管顕微鏡サンプル ホルダーに置き、かかっている毛細血管から無料まで、幼虫を含む端をプッシュします。標本室は tricaine ソリューション (150 mg/L) と 28 で設定温度で満たされる必要があります ° C は、XYZ マイクロマニピュレーター システムを使用して検出の目的の生徒の前で幼虫を配置します。垂直軸を中心として回転、回転ステージを使用します。幼虫の構造を明示する透過光モードで幼虫の位置決めを行う必要があります。 12。LSFM イメージングの注入寄生虫 蛍光 変更モードと照度と光損傷を減少し、時間分解能を最適化する露光時間を調整します。これらの特定の実験サンプル 2.8 3.0 mW の電力に使用し、6.45 μ m ピクセル検出波長で 〜 70% の量子効率とカメラを使用して 200 ミリ秒の各フレームを公開します。これらの設定は、約 5 フレーム/秒を最も高い可能な開口を使用し客観的に確認で十分に露出した画像になります。 は、領域 (ROI) のビデオ集録を開始します。当社の場合、バルブに接続されていると心臓周辺自由に動く寄生虫が観察されます。時間をかけて、1 つの平面のビデオを取るか寄生虫に移動しながら別の平面を集中するマニピュレーターまたはピエゾ ガルバノ システムを使用する勧めします 。 注: この手順は 2 h までの短いアクイジション時間帯に有用です。長い用語獲得の幼虫は代替方法 20 を使用してマウントする必要があります。 13。画像の処理および取得データの解析 注: 2.90 GHz プロセッサ、8.00 GB のメモリ 1.00 GB のメモリとビデオカードとパソコンで画像処理を行いました。 画像処理の選択のソフトウェアの オープン、取得したデータセットです。オープン ソフトウェア フィジー LSFM データ処理・分析 21 勧めします。 画像解析ソフトウェアで画像を向上させる明るさとコントラストのレベルを調整します 。 注: 固定パラメーターはこのケースで使用される、選択、" 自動 " オプションは、初期の強化を取得することができます。 は、投資収益率を選択します 。 注: 個々 の寄生虫を追跡、フィジーが両方手動および自動追跡プラグインを利用します。 14。幼虫のイメージを回復する 削除 agarose を使用してから慎重に幼虫微細鉗子と髪ループ ツール。15 分は 28 ± 0.5 ° C でインキュベーターに幼虫を帰国後、新鮮な卵水と回復のためのチェックに戻って魚を転送 はまた、tricaine の過剰摂取とイメージの幼虫を安楽死させるのに進みます。その後、次亜塩素酸ナトリウムの溶液に幼虫を紹介 (6.15 %naclo) 寄生虫を殺すために 5 分間。機関によると処分 ' s 標準プロトコル。