Mise en place du poisson-zèbre larvaire comme modèle Animal pour enquêter sur Trypanosoma cruzi motilité In Vivo

les protocoles suivants ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité de Los Andes Université (CICUAL). Niveau de biosécurité 2 (BSL-2) lignes directrices doivent être strictement respectées pour empêcher la contamination par l’agent pathogène T. cruzi. Remarque : entretien et soin des animaux : Casper zebrafish, une souche génétiquement modifiée de poisson-zèbre (Danio rerio) est utilisé dans le présent protocole en raison de leur transparence optique valable dans tous les stades de développement. Poissons sont manipuler avec soins optimaux des conditions pour l’espèce 14, dans un 14 h lumière à 10 h foncé cycle, à 28 ± 1 ° C, un pH (7.0 à 7.4) contrôlées multi-réservoir recirculation d’aqueduc. Les animaux sont nourris deux fois par jour avec live artémia (Artemia salina) et enrichies en nourriture d’élevage. Tous les protocoles ont été approuvés par CICUAL Universidad de Los Andes (C.FUA_14-017). 1. préparation de l’eau oeuf sel d’aquarium de 0,6 g/L de préparer à inverser l’osmose inverse (RO) ou l’eau désionisée (DI) et ajoute la solution de bleu de méthylène de 0,01 mg/L. Remarque : La conductivité mesurée doit affleurer de 400-500 µS/cm et le pH à 7,2-7,9. Pour abaisser le pH, aérer l’eau de le œuf pendant quelques heures. 2. Préparation de la Solution Stock de tricaïne solution mère de tricaïne 0,4 % Prepare en dissolvant les 400 mg tricaïne (MS-222) à 97,9 mL d’eau distillée (ddH 2 O). Lorsque la poudre est entièrement dissout, ajuster le pH à 7.0 à l’aide de 2,1 mL 1M Tris (pH 9,0) et réfrigérer la solution. 3. Préparation de 1,0 % faible Point de fusion Agarose dissoudre la poudre d’agarose point fusion faible dans l’oeuf l’eau à une concentration finale de 1,0 %. Chauffer le mélange au micro-ondes ou sur une plaque chauffante avec continue en remuant jusqu’à ce que la solution d’agarose apparaît homogène. Stocker les aliquotes à 4 ° C pour pas plus d’une semaine. 4. Accouplement de dosage et collecte d’embryons trois jours avant les injections mis en place des accouplements à l’aide de paires en bonne santé des poissons mâles et femelles dans les réservoirs d’élevage. Enrichissement avec billes de verre et de plantes artificielles améliore la fraye. Accouplements devraient être mis en place au cours de l’après-midi et laissés toute la nuit. Le lendemain matin, recueillir les oeufs pondus par la vidange du réservoir à travers une passoire et laver les oeufs avec l’eau de le œuf. Enlever tous les oeufs en inversant la crépine et verser de l’eau oeuf à travers la passoire dans une boîte de Pétri. Pour conserver les embryons sains, nettoyer leur eau en enlevant les débris et les embryons morts avec une pipette en plastique. Transférer les embryons dans un incubateur à une température stable de 28,5 ° C afin de permettre le développement des embryons selon le poisson-zèbre de normes mise en scène 15. Examiner les embryons deux fois par jour et rejeter non-viables oeufs pour maintenir l’embrayage en bonne santé. 5. Embryon Dechorionation Remarque : cette procédure est nécessaire si les embryons n’ont pas éclos au moment de l’injection. Dans cette procédure, " larves " sont les animaux hors de leur chorion de 48 h après la fécondation (hpf) onward. Le jour de l’expérience, placez la boîte de Pétri contenant les embryons sains dans un stéréoscope dissection. Saisir les extrémités opposées du chorion avec deux pinces pointus (Dumont #5), et délicatement lacrymogènes et tirer le chorion. Environ 5-6 larves sont injectés à la fois et en général 3-4 sont imagés. Enlever les chorions de l’eau à l’aide d’une pipette en. 6. Préparation du matériel d’Injection préparer 1,0 mm aiguilles utilisant des capillaires en verre à paroi fine et un dispositif d’extracteur de micropipette avec les paramètres suivants : 2 poids légers + 1 poids lourd, tirez dessus 2 mm + 5 mm bas pull, 75,9 ° C (étape 1) + (78,2 ° C Étape 2). Stocker des aiguilles dans une boîte de Pétri sur une bande de modeler. L’aiguille idéal devrait avoir une pointe étroite, T. cruzi mesurent environ 20 x 1-3 µm et passera facilement à travers l’aiguille. La longueur de la pointe peut varier : un embout plus long est utile pour atteindre des structures profondes, mais une pointe plus courte sera plus rigide facilitant l’injection pour l’utilisateur. Remarque : La taille de pointe aiguille dépend de la température : une température plus élevée pour l’étape 2 se traduit par un embout plus long et plus fin. Préparer une solution à 1,5 % d’agarose dans ddH 2 O et versez-la dans une boîte de Pétri de 10 cm. Couvrir d’une profondeur d’environ 1,0 cm. Recouvrir un moule de microinjection préfabriqués de l’agarose et laisser solidifier. Soulever le moule de microinjection préfabriqués sur et ajouter eau oeuf pour le stockage à 4 ° C. Cela empêche l’agarose ne se dessèchent pas. Eau oeuf ajouter à la solution mère de tricaïne à une concentration finale de 150 mg/L. magasin à 4 ° C. 7. Culture de cellules pour la croissance du Parasite Parasites sont maintenues dans une lignée de cellules humaines astrocytome (LCR-1718) à l’aide de la méthode décrite par Vargas-Zambrano et al. 16 commencer la culture de cellules humaines dans des flacons de culture T25 (surface habitable = 25 cm 2) à une densité de 2 x 10 5 ou 4 x 10 5 cellules dans 4 mL de milieu RPMI 1640 avec 10 % de sérum de veau foetal (FCS), complétée avec 2 mM de L-glutamine, 4,5 g/L de glucose, 10 mM HEPES, pyruvate de 1 mM et 1 % la pénicilline-streptomycine (appelés " toutes les médias "). Incuber les cultures astrocytome à 37 ° C dans un environnement de 2 5 % CO. Une fois une monocouche confluente, détacher les cellules à l’aide de 2 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA en incubant eux pendant 3 min à 37 ° C. visuellement cocher cellules de détachement et bloquer la solution de trypsine à l’aide de 3 mL de milieu RPMI 1640 avec 10 % de FCS dans un tube de 15 mL. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 1 350 x g. Laver le culot cellulaire qui en résulte dans un milieu DMEM dans un tube de 15 mL et centrifuger pendant 5 min à 1 350 x g à 22 ° C. Compter les cellules manuellement dans une chambre de Neubauer et recherchez de viabilité dans un microscope optique avec grossissement de 40 X. Doucement remis en suspension cellulaire de granule dans 4 mL de médias complet et utilisez-le pour créer de nouvelles cultures de cellules à l’aide de 2 x 10 5 cellules par flacon de culture T25. 8. T. cruzi Culture et l’étiquetage des produits Parasites sont une souche à l’origine provenant d’un humain infecté et caractérisée comme souche de T. cruzi DA (MHOM/CO/01/DA), génotype TcI unité discrète de dactylographie (DTU) 16. Après 3 ou 4 jours de culture, recueillir les parasites mobiles du surnageant de culture de cellules humaines astrocytome et centrifuger pendant 5 min à 1 350 x g. jeter le milieu. Remarque : Les Parasites en milieu complet peuvent être utilisés pour re-culture dans un rapport 1:1 avec cellules d’un astrocytome dans les flacons de culture T25. Doucement Resuspendre le culot dans 10 mL stérile 1 x salin de tampon Phosphate (PBS) avec 0,1 % FCS et centrifuger pendant 5 min à 1 350 x g. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 1 mL de PBS. Prendre 10 µL pour compter les parasites nageant libres dans une chambre de Neubauer. Prendre le reste des parasites remises en suspension (990 µL) et ajouter 1 µL de carboxyfluorescéine diacétate de Succinimidyl Ester (CFSE), concentration finale 5.0 µM. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Remarque : Stock CFSE à 5 mM doit être aliquotés et entretenu à -20 ° C. à pellets les parasites (1 350 x g, 5 min). Reconstituer le culot de parasite en effleurant le tube et les laver dans 10 mL de 1 x PBS-0.1% FCS suivie d’une rotation ultérieure (1 350 x g, 5 min). Jeter le surnageant et doucement Resuspendre le culot de parasite marqués en 1 X PBS avec le volume approprié pour obtenir une concentration finale d’environ 10-20 parasites/nL injectable. Utiliser un petit volume (∼ 10 µL, environ 1 x 10 4 -2 x 10 4 parasites) des trypomastigotes afin d’évaluer la viabilité et l’étiquetage. Un microscope à fluorescence inversé peut être utilisé pour une visualisation directe des parasites. Dans le mode lumière transmis, vérifier que les parasites se déplacent. Dans le mode de fluorescence, utilisez le filtre de l’Isothiocyanate de fluorescéine (FITC) pour évaluer l’étiquetage parasite. 9. Injection de larves de poisson zèbre Parasite de chargement prendre 10 µL de parasites de la remise en suspension (100 µL) et de les charger dans les aiguilles de verre scellé à l’aide d’une pointe de pipette 10 µL microloader. Introduire l’aiguille de verre dans le porte-aiguille du micromanipulateur, utiliser un support magnétique et placer à côté du stéréoscope. Using pince fine sous le stéréoscope, couper l’aiguille créant un émoussé ouvert fin et mesurer la taille des gouttes pour obtenir un volume d’injection de 1 nL (ce qui équivaut à un diamètre de talon de 0,12-0,13 mm lorsqu’elle est mesurée à l’huile minérale, 17). Un embout plus long est préférable pour que l’aiguille peut atteindre des structures profondément à l’intérieur du poisson sans agresser le tissu. Dans ce protocole, une aiguille émoussée est utilisée, mais peut servir aussi bien une aiguille biseautée. Montage anesthésier les larves de 48 hpf, avec tricaïne 150 mg/L. Vérifiez qu’ils ne répondent pas au toucher, mais faire en sorte que le cœur bat. Placer les larves dans le moule d’agarose microinjection dans une position latérale. Placer le porte-aiguille à côté le stéréoscope et régler le micromanipulateur afin que la pointe de l’aiguille est au centre du champ de vision. Déplacer la boîte de Pétri préparé en étapes 6.2 à 6.4 afin que le jaune larvaire se trouve à proximité de la pointe de l’aiguille. Vérifier l’état de la larve à veiller à ce que le cœur continue de battre. Définir les valeurs de microinjector comme suit : injection 9,6 livres par pouce (psi) de pression ; maintient la pression : 20 lb/po2 ; 100 ms plage de déclenchement ; valeur de période de 1,9 (correspond à 10,9 ms). Le volume d’injection doit être comprise entre 1-3 nL, avec environ 10-20 parasites/nL. 10. Injection du Parasite Inject le poisson dans la partie supérieure-antérieure du jaune à la gaine de Cuvier. Cette étape doit être pratiquée afin d’assurer la survie animale après l’injection. Il faut environ 10 min pour injecter avec succès des larves de 5-6. Comme un contrôle, injecter des larves de 1-2 avec le même volume de véhicule (solution de 1 PBS x). Transférer immédiatement la larve des œufs de l’eau. 11. LSFM montage d’injecté larves transférer la larve injectée avec parasites à une boîte de Pétri vide et retirer délicatement l’eau environnante avec une pipette en plastique et du papier absorbant. Immédiatement ajouter 100 µL de préchauffé 1,0 % d’agarose point de fusion bas (reportez-vous à l’étape 3 pour préparation d’agarose) pour couvrir la larve. S’assurer que l’agarose n’est pas plus de 40 ° C. Insérer un fil droit dans un verre de 1.0 mm capillaire et utilisez-la comme un piston pour aspirer la larve en position verticale. Veillez à laisser une petite quantité de gel d’agarose au-dessus de la larve. Attendez que l’agarose se solidifie avant d’exposer la larve (cela nécessitera quelques minutes). Si nécessaire, faire sortir l’excès d’agarose au-dessous de la larve et coupez-le off Placer le capillaire dans le porte-échantillon microscope et retirer l’extrémité contenant la larve, jusqu’à ce qu’il se bloque gratuite de capillaire. La chambre de l’échantillon doit être remplie avec la solution de tricaïne (150 mg/L) et la température réglée à 28 ° C. Position de la larve en face de la pupille de l’objectif de la détection à l’aide d’un système de XYZ-micromanipulateur. Pour les rotations autour de l’axe vertical, utilisez une platine de rotation. Positionnement de la larve doit se faire en mode lumière transmise pour identifier clairement les structures larvaires. 12. LSFM Imaging d’injecté Parasites mode changement de fluorescence et d’ajuster l’intensité de l’éclairage ainsi que la durée d’exposition à diminuer le photovieillissement et optimiser la résolution temporelle. Pour ces expériences particulières, nous avons utilisé une puissance de 2,8 à 3,0 mW pour l’échantillon et exposés chaque image pendant 200 ms en utilisant une caméra avec 6,45 µm pixels et efficacité quantique ~ 70 % dans les longueurs d’onde de détection. Ces paramètres devraient se traduire par des images correctement exposées à environ 5 images/s. Assurez vous d’utiliser un objectif avec la plus forte ouverture numérique possible. Démarrer une acquisition vidéo de la région d’intérêt (ROI). Dans notre cas, parasites sont observées attachée à vannes et librement mobiles autour de la zone de cœur. Il est recommandé de prendre une vidéo d’un seul plan au fil du temps, ou d’utiliser le système micromanipulateur ou piézo-galvo à concentrer des plans différents, tandis que le parasite se déplace. Remarque : Cette procédure est utile pour les délais d’acquisition court jusqu’à 2 h. Pour l’acquisition à long terme, les larves doivent être montés à l’aide de méthodes alternatives 20. 13. Traitement et analyse des données acquises d’images Remarque : traitement de l’Image a été réalisée sur un ordinateur personnel avec un processeur de 2,90 GHz, 8,00 Go de mémoire et une carte vidéo avec 1,00 Go de mémoire. Ouvrir l’acquis dataset dans le logiciel de choix de traitement d’image. L’air libre logiciel Fidji est recommandée pour LSFM informatique et analyse 21. Dans le logiciel d’analyse image, régler les niveaux de luminosité et de contraste pour améliorer les images. Remarque : Aucun des paramètres fixes ne sont utilisés dans ce cas, mais en sélectionnant le " Auto " option peut être utile d’obtenir une amélioration initiale. Sélectionner le ROI. Remarque : Pour le suivi des différents parasites, les Fidji ont les deux plugins de suivi automatique et manuel disponibles. 14. Récupération des larves imagés enlever la larve soigneusement de l’agarose à l’aide de pinces fines et un outil de boucle de cheveux. Transférer le poisson à l’eau œufs frais et vérifiez pour la récupération après 15 min. retourner la larve à l’incubateur à 28 ± 0,5 ° C. Sinon, passez à l’euthanasier les larves imagés avec une surdose de tricaïne. Ensuite, introduire les larves dans une solution d’hypochlorite de sodium (6,15 % NaClO) pendant 5 min tuer le parasite. Disposer selon l’institution ' les protocoles standard de s.