إنشاء الزرد اليرقات "نموذج الحيوان" للتحقيق مثقبيه الكروزية حركية في فيفو
Summary
في هذا البروتوكول، المسمى فلوريسسينتلي الكروزية ت تم حقن اليرقات الزرد شفافة، وحركية الطفيلي وقد لوحظ في فيفو استخدام الورقة الضوء الفلورية مجهرية.
Abstract
وهو مرض شاغاس عدوى طفيلية الناجم عن المثقبيات الكروزية، الذين حركية ليس هاما للتعريب، بل أيضا لربط الخلوية والغزو. الحالي نماذج حيوانية لدراسة الكروزية ت. السماح بمراقبة محدودة للطفيليات المجراة، تمثل تحديا لفهم السلوك الطفيلي خلال المراحل الأولية للإصابة في البشر. هذا بروتوزوا مرحلة فلاجلر في ناقلات والمضيفين الثدييات، لكن لا توجد دراسات تصف به حركية في فيفو. وكان الهدف من هذا المشروع إلى إنشاء نموذج الزرد فقاريات حية لتقييم حركية الكروزية. ت. في نظام الأوعية الدموية. الزرد شفافة تم حقن اليرقات فلوريسسينتلي المسمى trypomastigotes ولاحظ استخدام الورقة الضوء الفلورية مجهرية ()، أسلوب موسع لتصور الكائنات الحية مع عالية الدقة البصرية. يمكن تصور الطفيليات لفترات طويلة من الوقت بسبب خطر هذا الأسلوب منخفضة نسبيا مقارنة مع [كنفوكل] د أو ابيفلوريسسينسي المجهري. ولوحظت الطفيليات الكروزية ت. السفر في الدورة الدموية الزرد يعيش في الأوعية الدموية مختلفة الأحجام وصفار البيض. أنها يمكن أيضا أن ينظر المرفقة للجدار كيس ألمح وصمام بي على الرغم من القوى القوية المرتبطة بتقلصات القلب. الكروزية. ت.-اليرقات الزرد الملقحين هو أسلوب قيمة التي يمكن استخدامها لوضع تصور تعميم الطفيليات وتقييم انتحاء، وأنماط الهجرة، وحركية في البيئة الحيوية لنظام القلب والأوعية الدموية الحيوانات الحية.
Introduction
هو سبب مرض شاغاس الطفيلي البرزي الكروزية ت. ما يقرب من 6 إلى 7 مليون شخص في العالم مصابون الكروزية. ت.. هذا المرض ينتقل أساسا في أمريكا اللاتينية، ولكن سجلت في الولايات المتحدة، وكندا، والأوروبي كثيرة، فضلا عن بعض بلدان “غرب المحيط الهادئ”، أساسا بسبب هجرة الأفراد المصابين1. داء شاغاس إلى حد كبير المنقولة والمنقولة إلى البشر عن طريق الاتصال مع براز الحشرات هيماتوفاجيك في الفصيلية Triatominae، تعرف عموما باسم “البق”. ومع ذلك، الكروزية ت. يمكن أن ينتقل أيضا عن طريق نقل الدم، انتقال عمودي من الأم إلى الطفل، أو ابتلاع الأغذية الملوثة بالطفيليات2. المرحلة الحادة هي أساسا غير متناظرة أو مؤثرا أعراض العدوى ويستمر من 6 إلى 8 أسابيع، بعد الذي يتحكم تحميل الطفيلي المشاركة في الجهاز المناعي لكن لا يلغي تماما الإصابة3. معظم الأفراد ثم أدخل مرحلة أعراض مزمنة؛ ومع ذلك، تقريبا 30% مرضى تطوير مرحلة مزمن أعراض، التي هي نظام القلب وأقل تواترا في الجهاز الهضمي والعصبي الشبهة4. هذا السيناريو يمثل تحديا للعلاج من الأمراض والسيطرة حيث لا تتوفر أي لقاح، وهناك اثنان فقط من الأدوية الفعالة لداء شاغاس: بينزنيدازولي ونيفورتيموكس. كل العلاجات تتطلب إقامة مطولة وقد آثار جانبية شديدة2.
زيادة فهم سلوك الكروزية ت. السلوك في فيفو هو المفتاح لتحديد الهجرة الطفيلية، ومرفق الهاتف الخلوي، وغزو داخل البلد المضيف؛ نقص في فيفو نماذج يحد من تطوير نهج علاجية جديدة. وقد أظهرت الدراسات في المختبر T. الكروزية العدوى أن حركية trypomastigotes مهم لربط أغشية الخلايا المضيفة واجتياح الخلوي5. ثبت استنفاد الطاقة في trypomastigotes في ثقافة المشارك مع خط خلية عرضه للحد من غزو الخلوية6. من المثير للاهتمام، في تريبانوسوماتيدس، حركة فلاجلر كما اتسم كآلية تهرب ضد الأجسام المضادة الخاصة بالطفيل7.
وقد درس على نطاق واسع في المختبر في المثقبيات البروسية، وثيقة الصلة طفيلي الذي يسبب “داء المثقبيات الأفريقي”8فلاجلر حركية. أظهرت الدراسات في المختبر من الحركية من هذه المثقبيات أن محاكاة الظروف للدم أو سوائل الجسم، بما في ذلك اللزوجة ووجود عقبات تمثيلية من خلايا الدم، مهم للتحرك إلى الأمام الطفيلي9 . حتى أنه لم الممكن تصور الحركة للطفيليات في مجرى الدم في الجسم الحي.
الزرد يرقات نموذجا قويا لدراسة التفاعلات المضيف الممرض في فيفو. فصغيرة وغير مكلفة وسهلة نسبيا لزيادة بالمقارنة مع النماذج الفقاريات الأخرى المنشأة لمرض شاغاس. الزرد نظم المناعة الفطرية وتكيفية مماثلة للبشر ولكن على الجهاز المناعي التكيفي يبدأ وضع في 4 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) وليست ناضجة ل أسابيع عدة أخرى10. أثناء المبكرة، عندما الضامة فقط موجودة، هناك نافذة كبيرة لدراسة السلوك الطفيلي دون التدخل الفوري محصنة ضد10. بيد أن أكبر ميزة لاستخدام اليرقات الزرد كنموذج فقاريات لدراسة سلوك الكائنات الممرضة يكمن في شفافيتها الضوئية، يجعلها قابلة للفحص المجهري والتصوير11. بالإضافة إلى ذلك، هناك العديد من الأدوات التعامل مع الأسماك علم الوراثة. على سبيل المثال، سلالة كاسبر خط متحولة من الزرد مع لا لون البشرة، مما يجعل الحيوان شفافة تماما ومفيداً للتصور الأجهزة الفردية وتتبع في الوقت الحقيقي لحقن الخلايا12.
حد رئيسية من المراقبة طولية للطفيليات تتحرك سريعاً في استخدام الزرد يعيش [كنفوكل] أو مجهرية ابيفلوريسسينسي يكمن في استحالة التصوير في سرعة اكتساب عالية وأعماق اختراق كبير مع نوعية صورة جيدة ومنخفضة خطر د. ورقة الضوء الفلورية ميكسروسكوبي () وهي تقنية تصوير ناشئة أن يتغلب على هذه القيود للسماح بهذه الملاحظات. باستخدام هدف واحد للكشف عن الأسفار وإضاءة متعامد هدف ثاني الذي ينير فقط المستوى البؤري للكشف عن الهدف، فإنه من الممكن الحصول على مقاطع بصرية عالية الدقة كما هو الحال في مجهر [كنفوكل]، ولكن مع إلى حد كبير انخفاض د، حتى فيما يتعلق ب الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي13. لسفم التقنية المستخدمة هنا تسمى واحد الطائرة إضاءة مجهرية (SPIM)، الذي ينير ورقة رقيقة من الضوء طائرة واحدة داخل اليرقات الزرد.
والهدف من هذه المنهجية إنشاء الزرد اليرقات كنموذج العدوى غير قابلة للتطبيق لفهم حركية الكروزية. ت. والسلوك ذات الصلة في فيفو. لتحقيق هذا الهدف، ونحن تحقن اليرقات الزرد شفافة مع المسمى فلوريسسينتلي trypomastigotes، شكل الخلوية المسؤولة عن حالات العدوى للبشر، وحددت حركة الكروزية. ت. في القلب والأوعية الدموية تداول الزرد باستخدام لسفم.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتبرز هذه الدراسة مزايا الزرد كنموذج حيوان لدراسة العوامل الممرضة السلوك في فيفو. على وجه الخصوص، تقترح هذه الدراسة وسيلة لتصور الممرض الكروزية. ت. في بيئتها الطبيعية: تداول هيماتيك. البيئة المكروية الدورة الدموية في الأسماك مماثل للثدييات، وتريبانوسوماتيدس وقد تطورت آليات للسفر، والتهرب من النظام المناعي، وإرفاق إلى الخلايا للإصابة في تلك البيئة25. ويوفر هذا البروتوكول وصف إجراء الأمثل لثقافة الكروزية. ت. في خط الخلية البشرية والعزلة اللاحقة من أشكال فلاجلر لوسم الفلورسنت. ثم يظهر الإعدادات المناسبة لنجاح حقن الطفيليات في الزرد شفافة للتصور باستخدام لسفم وتصاعد في وقت لاحق. وأخيراً، يقدم هذا البروتوكول اقتراحات للتصوير بكفاءة وفعالية في فيفو موقع الطفيلي والحركة في الدورة الدموية باستخدام لسفم.
السوط مثقبيات ينبثق من منطقتها الخلفية، تتدفق من جسم الخلية، وتوقف مجاناً في الجزء الأمامي من الكائن الحي26. الكروزية T. يدفع نفسه بالتلويح بالسوط قبل الجسم، والذي أوندولاتيس الطفيليات الجسم بأكمله. فلاجلر حركة ليس فقط أمرا لا غنى عنه لحركة الطفيلي، على غرار البروسية ت.27 (المسبّب لداء المثقبيات الأفريقي)، ولكن أيضا استخدامه للعدوى الخلوية، كما ثبت في الكروزية. ت.5 ،28. على الرغم من الزرد ليست المضيفة الطبيعية الكروزية. ت.، يمكن دراسة حركية للطفيلي في نظام الدورة الدموية القلبية الوعائية نامية استخدام البروتوكولات المذكورة هنا. بالإضافة إلى ذلك، هناك مثقبيات الأنواع التي تصيب الكارب، فئة الزرد، مثل كراسي ت. و . ت. بوريلي25. يمكن استخدام هذه الأنواع الطفيليات للدراسة في الوقت الحقيقي الحركات وآليات مرفق لهذه تريبانوسوماتيدس؛ يمكن أن تقدم مثل هذه الدراسات نظرة ثاقبة عملية عدوى خلايا الثدييات.
وفي هذه الدراسة، حقن متحركة الكروزية ت. الطفيليات كانت السفر ملاحظتها من خلال تداول الأسماك الملقحين القلب والأوعية الدموية، وتتحرك جنبا إلى جنب مع الكريات الحمراء المعتمة، والتمسك بهياكل في جدران الأوعية الدموية. كنا الصنع مع 10 X متعامي طويلة المسافة العمل الهدف الجوي (17.6 ملم) للذراع الإضاءة مع فتحه عددية من 0.25. 40 × الهدف غمر المياه اللازيغيه مع فتحه عددية من 0.8 ومسافة عمل 3.5 مم استخدمت للكشف عن الذراع. كانت مغمورة هدف الكشف عن في قاعة عينة، بينما كان الهدف إنارة خارج الدائرة. منفذ في غرفة مغلقة مع ساترة والغراء البصرية يسمح لشعاع الإضاءة لدخول قاعة، كما هو مبين في لورنزو et al. 18 المستخدمة للإضاءة، ونحن ليزر والعسف 50 ميغاواط في 488 نانومتر السلطة التي تمت عن طريق عامل “تصفية الانضباطي بصري أكوستو” التضمين. مسار الكشف عن استخدام مرشحات متوافقة مع أخضر نيون البروتين (بروتينات فلورية خضراء) أو فيتك. مجهر ضوء ورقة مزودة بحامل عينة الشعرية (ومن الناحية المثالية مع التناوب الآلي) والتحكم في درجة الحرارة الدائرة عينة ينبغي أن تكون مناسبة لهذا التطبيق. وينبغي الانحياز المجهر ومعايرة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة أو المستخدم مختبر البروتوكولات القياسية قبل حيازتها، إذا لزم الأمر. في هذا البروتوكول، تسيطر علينا المجهر استخدام البرمجيات SPIM19.
من المهم أن نلاحظ أن في تعميم الزرد، مرفق اليرقات الطفيلية فعالة. وفي السياق الكاردينال، الطفيليات ظلت المرفقة لتصل إلى عدة دقائق؛ في القلب، وعقدوا الصمامات والجدران، وتتأرجح مع تقلصات القلب. يبقى إجراء المزيد من الدراسات من أجل توضيح ما إذا كان ت الكروزية يتفاعل مع الكريات الحمراء تتدفق بالانجراف في اتجاه تدفق الدم. الدراسات السابقة في المختبر أظهرت أن وجود هياكل صلبة (أي، خلايا الدم)، أو زيادة لزوجة السائل لتقليد الدم في المختبر، وله تأثير كبير على الحركة والسرعة للطفيلي 9.
هناك العديد من الأسئلة المتعلقة بمسار العدوى الكروزية. ت. في البشر بعد الهروب amastigotes الخلايا البلعمية، ونوع الخلايا المصابة في البداية29. على سبيل المثال، كيف يصلون إلى الأجهزة المستهدفة؟ ما هي آليات انتحاء إلى الأجهزة المفضلة، مثل القلب والجهاز الهضمي والعصبي المركزي؟ من المثير للاهتمام، في هذه الدراسة الطفيليات كانت في البداية تصويرها في القلب لأنه كان موقع أعلى كثافة للطفيليات. ومع ذلك، إشارة كفسي لاحقاً المتراكمة في الأمعاء النامي خلال 7 أيام بعد الحقن. على الرغم من أن تشريح الأسماك والثدييات المختلفة، تظهر نتائج هذه الدراسة شكلاً من أشكال انتحاء، كما لوحظ أن الطفيليات معارضها انتحاء نحو الأجهزة الهدف المفضل المعروفة على الرغم من الاختلافات العضوي. حد كبير واحد من هذه الدراسة تتعلق بدرجة الحرارة المستخدمة في التجارب. ينبغي أن تظل اليرقات الزرد حوالي 28 درجةمئوية خلال الإجراء بأكمله. على الرغم من أن درجة الحرارة هذه قد تكون مشابهة لناقل المضيف (حشرات فصيلة Triatominae)، فإنه يختلف تماما عن الثدييات ذوات الدم الحار التي تتألف منها يستضيف النهائي (حوالي 37 درجة مئوية). الكروزية. ت. ومن المعروف أن أشكال المعيشة فلاجلر في كلا المضيفين؛ ومع ذلك، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن هذا العامل قد يكون له أثر في سلوك الحيوانات في فيفو.
على الرغم من أن النظام المناعي التكيفي fish´s ليست ناضجة حتى 4 أسابيع بعد الإخصاب، تنشط نظام المناعة الفطرية المبكر في التنمية10. أقرب وقت هبف 48 أو 96، لوحظت خلايا متجولة وقد اجتاحت المسمى مثقبيات (البيانات لا تظهر). وهذا يحد من النافذة الزمنية للتصور للطفيلي. ومع ذلك، إذا تمت دراسة التركيز على تقييم الاستجابة المناعية fish´s، قد أوصت الحقن في مراحل لاحقة. أيضا، حقن الطفيليات في خطوط الأسماك المحورة وراثيا مع الضامة المسمى أو خلايا أخرى من الجهاز المناعي يمكن أن تكون مفيدة في دراسة مرفق الطفيلي والآليات الممكنة الالتقام. من المهم أن نلاحظ أنه في حالة الطفيليات المسماة مع كفسي وتسميات الخلايا المحورة وراثيا لا ينبغي أن تكون التجارة والنقل، وعلامة في نهاية الطيف الأصفر أو الأحمر مطلوب.
تقييم اتجاه مفصلة لحركة الطفيلي، قد يكون من المفيد اتباع مسار بهم في 3 الأبعاد (3D). 3D التصور والتعمير عملية، نظام عالي السرعة اللازمة. مع المعدات المستخدمة في هذا البروتوكول، فإنه من الممكن تصور الطفيليات في طائرة واحدة فقط. وفي هذه الحالة، نحن الأولوية للحفاظ على استقرار المستوى البؤري أثناء حركة الطفيلي، وتسجيل مساره في طائرة واحدة.
المنهجية المقترحة هنا يمهد الطريق مواصلة التحقيق في السلوك الطفيلي في الدورة الدموية في القلب والأوعية الدموية. وباختصار، خطوات ضرورية للتصوير الطفيليات الفلورسنت يعيش داخل يرقات الزرد:(ط) استخدام الأجنة مظلل في وقت مبكر (24-48 هبف) أو اليرقات أو الحيوانات بين 72-96 هبف مع لا تصبغ بحيث تكون شفافة وسهلة لحقن؛ (ثانيا) صورة يرقات وقت ممكن بعد الحقن لتجنب إزالة الطفيليات من الخلايا البلعمية؛ ويركز على الموقع للفائدة (مثلاً، منطقة التامور) (ثالثا) والحفاظ على التركيز. يسمح هذا الإجراء رواية تصور trypomastigotes في بيئة شبيهة بمكانته الطبيعية العدوى، توفير إمكانية دراسة الكروزية. ت. في حي للمرة الأولى.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل إينتيرفاكولتاديس كونفوكاتوريا من البحوث de Vicerrectoría de la جامعة دي لوس إنديز، وبرنامج وكالة التنمية الدولية للبحث والابتكار الزمالة. ونحن نشكر خوان رافائيل Buitrago وييفيرزون ارديلا للحفاظ على الأسماك والمساعدة.
Materials
| 0.5-10 μL Micropipette | Fisherbrand | 21-377-815 | |
| Agarose RA | Amresco | N605 | Regular |
| Agarose SFR | Amresco | J234 | Low Melting point |
| Aquarium salt | Instant ocean | SS15-10 | |
| Cell Count chamber | Boeco | Neubauer | |
| Cell culture flasks | Corning | 430639 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| CFSE | ThermoFisher | C34554 | |
| Detection objective | Nikon 40x 0.8NA | 40x CFI APO NIR | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Dumont #5 fine forceps | World precision Instruments | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
| Filter | Chroma | ET-525/50M | |
| Glass capillaries for embryo mounting | Vitrez Medical | 160215 | |
| Glass capillaries for pulling needles | World precision instruments | TW100-4 | |
| Glucose | Gibco | A2494001 | |
| HEPES | Gibco | 156300-80 | |
| Incubator | Thermo Corporation | Revco | |
| Larval microinjection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| Laser | Crystalaser | DL488-050 | |
| L-glutamine | Gibco | 250300-81 | |
| Methylene blue | Albor Químicos | 12223 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| Micromanipulator system | Sutter Instrument | MP-200 | For LSFM |
| Micropipette puller device | Narishige | PC-10 | |
| Microscope | Olympus | CX31 | |
| Microscope (inverted) | Olympus | CKX41 | |
| Multipurpose microscope | Nikon | AZ100M | |
| Neubauer counting chamber | Boeco Germany | ||
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-163 | |
| Petri dish 94×16 | Greiner bio-one | 633181 | |
| Plastic pasteur pipette | Fisherbrand | 11577722 | |
| Rotation stage | Newport | CONEX-PR50CC | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R4130 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Stereoscope | Nikon | C-LEDS | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | |
| TRIS | Amresco | M151 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | R-001-100 | |
| Tubes 15 ml | Corning | 05-527-90 |
References
- Bern, C. Chagas’s Disease. New England Journal of Medicine. 373 (5), 456-466 (2015).
- Sosa Estani, S., Segura, E. L., Ruiz, A. M., Velazquez, E., Porcel, B. M., Yampotis, C. Efficacy of chemotherapy with benznidazole in children in the indeterminate phase of Chagas’ disease. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 59 (4), 526-529 (1998).
- Rosas, F., Roa, N., Cucunuba, Z. M., Cuellar, A., Gonzalez, J. M., Puerta, J. C. Chagasic Cardiomyopathy. Cardiomyopathies – From Basic Research to Clinical Management. , (2012).
- Finkelsztein, E. J., et al. Altering the motility of Trypanosoma cruzi with rabbit polyclonal anti-peptide antibodies reduces infection to susceptible mammalian cells. Experimental Parasitology. 150, 36-43 (2015).
- Martins, R. M., Covarrubias, C., Rojas, R. G., Silber, A. M., Yoshida, N. Use of L-Proline and ATP Production by Trypanosoma cruzi Metacyclic Forms as Requirements for Host Cell Invasion. Infection and Immunity. 77 (7), 3023-3032 (2009).
- Engstler, M., et al. Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes. Cell. 131 (3), 505-515 (2007).
- Uppaluri, S., et al. Impact of Microscopic Motility on the Swimming Behavior of Parasites: Straighter Trypanosomes are More Directional. PLoS Computational Biology. 7 (6), e1002058 (2011).
- Heddergott, N., et al. Trypanosome Motion Represents an Adaptation to the Crowded Environment of the Vertebrate Bloodstream. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003023 (2012).
- Gratacap, R. L., Wheeler, R. T. Utilization of zebrafish for intravital study of eukaryotic pathogen–host interactions. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 108-115 (2014).
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-Pathogen Interactions Made Transparent with the Zebrafish Model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Huisken, J. Slicing embryos gently with laser light sheets. BioEssays. 34 (5), 406-411 (2012).
- Westerfield, M. . The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Vargas-Zambrano, J. C., Lasso, P., Cuellar, A., Puerta, C. J., González, J. M. A human astrocytoma cell line is highly susceptible to infection with Trypanosoma cruzi. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 108 (2), 212-219 (2013).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (25), e1115-e1115 (2009).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6, 22 (2011).
- Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using μManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10 (2014).
- Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (84), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ng, A. N. Y., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmental Biology. 286 (1), 114-135 (2005).
- Higuchi, M. D. L., et al. Correlation between Trypanosoma cruzi parasitism and myocardial inflammatory infiltrate in human chronic chagasic myocarditis: Light microscopy and immunohistochemical findings. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 2 (2), 101-106 (1993).
- Vago, A. R., Silva, D. M., Adad, S. J., Correa-Oliveira, R., d’Avila Reis, D. Chronic Chagas disease: presence of parasite DNA in the oesophagus of patients without megaoesophagus. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (3), 308-309 (2003).
- Wiegertjes, G. F., Forlenza, M., Joerink, M., Scharsack, J. P. Parasite infections revisited. Developmental & Comparative Immunology. 29 (9), 749-758 (2005).
- De Souza, W. Basic cell biology of Trypanosoma cruzi. Current Pharmaceutical Design. 8 (4), 269-285 (2002).
- Langousis, G., Hill, K. L. Motility and more: the flagellum of Trypanosoma brucei. Nature Reviews. Microbiology. 12 (7), 505-518 (2014).
- Johnson, C. A., et al. Cellular response to Trypanosoma cruzi infection induces secretion of defensin α-1, which damages the flagellum, neutralizes trypanosome motility, and inhibits infection. Infection and Immunity. 81 (11), 4139-4148 (2013).
- Magalhães, L. M. D., Viana, A., Chiari, E., Galvão, L. M. C., Gollob, K. J., Dutra, W. O. Differential Activation of Human Monocytes and Lymphocytes by Distinct Strains of Trypanosoma cruzi. PLoS neglected tropical diseases. 9 (7), e0003816 (2015).
