Оценка травмы индуцированного старения и в естественных условиях перепрограммирования в скелетных мышцах
Summary
Здесь мы представляем подробный протокол обнаружения оба стареющей и плюрипотентных стволовых клеток в скелетных мышцах после травмы во время склонение в vivo перепрограммирования. Этот метод подходит для оценки роли клеточного старения во время регенерации тканей и перепрограммирования в естественных условиях.
Abstract
Клеточного старения является стресс ответ, который характеризуется стабильной клеточного роста арест, который имеет важное значение для многих физиологических и патологических процессов, таких как рак и старения. Недавно старение также был вовлечен в ткани ремонт и регенерации. Таким образом становится все более важной для выявления стареющей клетки в естественных условиях. Пробирного связанные старения β-галактозидазы (SA-β-Gal) является наиболее широко используемым проба для выявления стареющей клетки в культуре и в естественных условиях. Этот assay основан на увеличение лизосомальных содержимое в стареющей клетки, что позволяет гистохимические обнаружение активности лизосомальных β-галактозидазы в suboptimum рН (6 или 5.5). По сравнению с другие анализы, например проточной цитометрии, это позволяет идентификации стареющей клеток в их среде резидентов, который предлагает ценную информацию, как местоположение, касающимся ткани архитектуры, морфология и возможность сопряжения с другими маркеры через иммуногистохимия (IHC). Основным ограничением SA-β-Гал пробирного является требование о свежих или замороженных образцов.
Здесь мы представляем подробный протокол понять как клеточного старения способствует клеточных тканей и пластичности регенерации в естественных условиях. Мы используем SA-β-Гал для обнаружения стареющей клетки в скелетных мышцах после травмы, которая является хорошо отлаженная система для изучения регенерации тканей. Кроме того мы используем IHC для обнаружения Nanog, маркер плюрипотентных стволовых клеток, в модели трансгенные мыши. Этот протокол позволяет нам изучить и количественной оценки клеточного старения в контексте индуцированных клеточных пластичности и в естественных условиях перепрограммирования.
Introduction
Клеточного старения является формой реакции на стресс характеризуется стабильной цикла клетки ареста. В течение последнего десятилетия исследования твердо установлено, что старение связано с различных биологических и патологических процессов, включая эмбриональное развитие фиброза и организм старения1,2. Клеточного старения была впервые выявлена в фибробластов в конце их репликативной жизни, вызванные теломер, укорочение3. Помимо репликативной стресс существуют многие другие стимулы, которые могут вызвать старения, включая повреждения ДНК, оксидативный стресс, онкогенные сигналов и геномной/epigenomic изменения, любой из которых в конечном итоге может активировать p53/p21 или pRB пути к установить и укрепить постоянный рост арест1. Одна из важных характеристик стареющей клетки является, что они остаются метаболически активные и энергично выразить старение связанные секреторной фенотип (SASP): секрецию многих воспалительных цитокинов, факторы роста и внеклеточного матрикса 4факторы. SASP факторов было предложено играть важную роль в качестве посредника и усиливая эффект старения, из-за их мощных эффектов на привлечении иммунные клетки и изменяя местных и системных ткани кругах1. Интересно, что старение недавно предлагается иметь важное значение для ткани ремонт и восстановление5,6. Кроме того данные из нескольких лабораториях, в том числе наша, предложил, что старение-индуцированного повреждения ткани могут повысить сотовой пластичности, через SASPs, способствовать регенерации7–9. Таким образом все новые данные подчеркивают важность изучения старение в естественных условиях.
В эпоху пост индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) сотовой пластичность является способность ячейки для приобретения новой идентичности и принять альтернативные судьба при воздействии различных раздражителей в культуре и в естественных условиях10. Известно, что полного перепрограммирования может быть достигнуто в vivo11,12, где выражение кассеты, содержащий четыре Яманака факторов: Oct4, Sox2, Klf4и c-Myc (OSKM) может быть индуцированные в естественных условиях содействовать тератомы формирования в нескольких органов. Таким образом модель перепрограммируемые мыши (i4F) может использоваться как мощная система для выявления критических регуляторы и пути, которые важны для сотовых пластичности11.
Подходит и чувствительных в естественных условиях системы важно понять как клеточного старения регулирует сотовой пластичности в контексте регенерации тканей. Здесь мы представляем надежные системы и подробный протокол для оценки взаимосвязи между старение и клеточных пластичности в контексте регенерации тканей. Сочетание cardiotoxin (СТХ) индуцированного повреждения мышц в группе мышц передней Tibialis (TA), хорошо отлаженная система для изучения регенерации тканей и i4F модель мыши, позволяет обнаруживать сотовой старение и в естественных условиях Перепрограммирование во время регенерации мышц.
Чтобы оценить связь между сотовой пластичности и старения, i4F мышей с CTX побудить острые мышечные ущерб ранения и получавших доксициклин (0,2 мг/мл) более 7 дней навести в vivo перепрограммирования. В то время как CTX индуцированных повреждений острые мышечные и регенерации протокол был недавно опубликованный13, по этическим соображениям, эта процедура будет пропущен в текущем протоколе. ТА проб мышцы будут собраны на 10 дней поста травмы13, когда пик стареющей клетки ранее наблюдались14. Здесь этот подробный протокол описывает все шаги, необходимые для оценки уровня старения (через SA-β-Gal) и перепрограммирования (через IHC окрашивание Nanog).
Пробирного старение связанные бета галактозидазы (SA-β-Gal) является наиболее часто используемых проба для выявления стареющей клетки как в культуре и в vivo15. По сравнению с другими анализов, SA-β-Гал assay позволяет идентифицировать стареющей клетки в их родной среде с неповрежденной ткани архитектуры, которая имеет особенно важное значение для изучения в естественных условиях . Кроме того возможна пара пробирного SA-β-Гал с другими маркеры с помощью IHC. Однако SA-β-Гал assay требуют свежих или замороженных образцов, которая остается одним из основных ограничений. Когда свежие или замороженные ткани обычно доступны, такие как замороженные TA мышцы образцы, SA-β-Гал, очевидно, наиболее подходящим проба для выявления стареющей клетки. Nanog является маркер, используемый для определения reprogramed клетки по двум причинам: 1) это необходимым маркер для плюрипотентности; 2) более того ее выражение не управляется доксициклин (dox), поэтому он обнаруживает индуцированных плюрипотентности вместо принудительного выражение Яманака кассеты.
Важно отметить, пятная протоколы, представленные в этом исследовании может проводиться отдельно для упрощения процедуры количественной оценки, но также может быть сделано в совместно пятная процедуру визуализировать как стареющей и плюрипотентных стволовых клеток на том же разделе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем метод для обнаружения оба стареющей и плюрипотентных стволовых клеток в скелетных мышцах перепрограммируемые мышей. Этот метод может использоваться для оценки и количественно обе старение и побудить сотовой пластичности в естественных условияхи изучить р?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы в долгу перед Clemire Cimper за ее отличную техническую поддержку. Работа в лаборатории H.L. финансировался Институтом Пастера, Национальный центр pour la Recherche научных и Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d’Excellence Revive, практический будущее; ANR-10-LABX-73), Agence Nationale de la Recherche (АНР-16-CE13-0017-01) и Фонд дуги (PJA 20161205028). C.C. и A.C. финансируются кандидатских и докторской стипендии от возродить консорциума.
Materials
| K3Fe(CN)6 | Sigma | 13746-66-2 | For SA-β Gal staining solution |
| K4Fe(CN)6 | Sigma | 14459-95-1 | For SA-β Gal staining solution |
| MgCl2 | Sigma | 7786-30-3 | For SA-β Gal staining solution |
| X-Gal | Sigma | B4252 | For SA-β Gal staining solution |
| Doxycycline | Sigma | D3447 | For inducing in vivo reprogramming |
| Cardiotoxin | Lotaxan Valence, France | L8102 | For muscle injury |
| Glutaraldehyde | Sigma | 111-30-8 | For Fixation solution |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy science | 50-980-487 | For Fixation solution |
| NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre | Sigma | 18996-35-5 | For permeabilization solution |
| Triton | Sigma | 93443 | For permeabilization solution |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3608 | Washing solution |
| Antibody anti- Nanog | Cell signalling | 8822S | Rabbit monoclonal antibody |
| EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) | Dako | K4010 | For Nanog revelation |
| Eosin 1% | Leica | 380159EOF | Counterstainning |
| Fast red | Vector Laboratories | H-3403 | Counterstainning |
| Thermo Scientific Shandon Immu-Mount | Fisher scientific | 9990402 | Mounting solution |
| Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® | Sigma | 25608-33-7 | Mounting solution |
| Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives | Olympus | CKX41 | Microscope for Nanog quantification |
| Mouse: i4F-A | Abad et al., 2013 | N/A | Reprogrammable mouse model |
| Skeletal muscle, Tibialis Anterior | |||
| Slide Scanner | Zeiss | Axio Scan Z1 | slides scanning |
References
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
- Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
- Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
- Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
- Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
- Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
- Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
- Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
- Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
- Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
- Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528 (2015).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence?. Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
- Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).
