Avaliação da senescência induzida por lesão e na Vivo reprogramação no músculo esquelético
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo detalhado para detectar ambos senescentes e células-tronco pluripotentes no músculo esquelético após lesões enquanto induzindo na vivo reprogramação. Este método é adequado para avaliar o papel da senescência celular durante a regeneração do tecido e reprogramação na vivo.
Abstract
Senescência celular é uma resposta ao estresse que é caracterizada por uma detenção estável de crescimento celular, o que é importante para muitos processos fisiológicos e patológicos, tais como câncer e envelhecimento. Recentemente, a senescência também tem sido implicada na regeneração e reparo tecidual. Portanto, tornou-se cada vez mais crítico para identificar células senescentes em vivo. Senescência-associado β-galactosidase (SA-β-Gal) ensaio é o ensaio mais utilizado para detectar células senescentes tanto na cultura e na vivo. Este ensaio é baseado no aumento conteúdo lisossomal nas células senescentes, que permite a detecção histochemical da atividade lisossomal β-galactosidase em pH suboptimum (6 ou 5.5). Em comparação com outros ensaios, tais como citometria de fluxo, isto permite a identificação de células senescentes em seu ambiente residente, que oferece informações valiosas, tais como a localização, relacionadas com a arquitectura do tecido, a morfologia e o possibilidade de acoplamento com outros marcadores através de imuno-histoquímica (IHC). A limitação principal do ensaio SA-β-Gal é a exigência de amostras frescas ou congeladas.
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para entender como celular senescência promove celular plasticidade e tecido regeneração em vivo. Nós usamos SA-β-Gal para detectar células senescentes no músculo esquelético após a lesão, o que é um sistema bem estabelecido para estudar a regeneração de tecidos. Além disso, usamos IHC para detectar Nanog, um marcador de células-tronco pluripotentes, em um modelo do rato transgénico. Este protocolo permite-nos analisar e quantificar a senescência celular no contexto da plasticidade celular induzida e na vivo reprogramação.
Introduction
Senescência celular é uma forma de reação de estresse, caracterizada por uma detenção do ciclo celular estável. Na última década, pesquisa estabeleceu-se firmemente que a senescência é associada com vários processos biológicos e patológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário, fibrose e organismo envelhecimento1,2. Senescência celular foi identificada em fibroblastos humanos no final de sua vida replicative desencadeada por telômero encurtamento3. Além do estresse replicative, existem muitos outros estímulos que podem induzir a senescência, incluindo danos, estresse oxidativo, oncogênicos sinais e alterações genômicas/epigenomic, que eventualmente pode ativar as vias p53/p21 e/ou pRB para DNA estabelecer e reforçar o crescimento permanente de prisão1. Uma das características mais importantes de células senescentes é que eles permanecem metabolicamente ativos e robustamente expressam um fenótipo secretor associada a senescência (SASP): secreção de citocinas inflamatórias, fatores de crescimento e matriz extracelular muitos fatores4. Fatores SASP têm sido propostos para desempenhar um papel importante na mediação e amplificar o efeito de senescência, devido a seus potentes efeitos sobre atrair células imunes e alterando o tecido local e sistêmica www.UniEthos.org.br1. Curiosamente, senescência tem sido recentemente proposta para ser importante para tecido reparação e regeneração5,6. Além disso, dados de vários laboratórios, incluindo a nossa, tem sugerido que senescência induzida por danos do tecido pode aumentar a plasticidade celular, através do SASPs, para promover a regeneração7–9. Portanto, todos os dados emergentes destacam a importância de se estudar a senescência em vivo.
Na era pós (iPSC) células-tronco pluripotentes induzidas, plasticidade celular é a capacidade de uma célula para adquirir uma nova identidade e adotar um destino alternativo quando expostos a diferentes estímulos na cultura e na vivo10. É sabido que a reprogramação completa pode ser conseguida na vivo11,12, onde a expressão da fita contendo quatro fatores Yamanaka: Oct4, Sox2, Klf4e c-Myc de (OSKM) pode ser induzido na vivo para promover a formação de teratomas em múltiplos órgãos. Portanto, um modelo de mouse reprogramável (i4F) pode ser usado como um poderoso sistema para identificar os reguladores críticos e caminhos que são importantes para a plasticidade celular11.
Um sistema adequado e sensível na vivo é essencial para compreender a senescência celular como regula a plasticidade celular no contexto da regeneração de tecidos. Aqui, apresentamos um sistema robusto e um protocolo detalhado para avaliar a ligação entre senescência e plasticidade celular no contexto da regeneração de tecidos. O dano muscular combinação de toxina (CTX) induzida no grupo de músculo tibial Anterior (TA), um sistema bem estabelecido para estudar a regeneração do tecido e o modelo do rato de i4F, permite a detecção de senescência celular e vivo em reprogramação durante a regeneração do músculo.
Para avaliar a relação entre a plasticidade celular e senescência, i4F ratos são feridos com CTX para induzir a lesão muscular aguda e tratados com doxiciclina (0,2 mg/mL) durante 7 dias para induzir no vivo reprogramação. Enquanto um CTX induzido por lesão muscular aguda e protocolo de regeneração tem sido recentemente publicado13, por razões éticas, este procedimento será omitido no protocolo atual. Amostras de músculo TA serão recolhidas às 10 dias pós lesão13, quando o pico de células senescentes anteriormente foram observados14. Aqui, este protocolo detalhado descreve todos os passos necessários para avaliar o nível de senescência (via SA-β-Gal) e reprogramação (através de coloração de IHC de Nanog).
Senescência-associado de beta-galactosidase (SA-β-Gal) ensaio é o ensaio mais comumente usado para detectar células senescentes na cultura e na vivo15. Em comparação com outros ensaios, o ensaio de SA-β-Gal permite a identificação das células senescentes em seu ambiente nativo com arquitetura de tecido intacto, que é particularmente importante para o estudo em vivo . Além disso, é possível acoplar o ensaio SA-β-Gal com outros marcadores usando IHC. No entanto, o ensaio de SA-β-Gal requer amostras frescas ou congeladas, que continua a ser uma grande limitação. Quando os tecidos frescos ou congelados são rotineiramente disponíveis, tais como amostras congeladas de músculo TA, SA-β-Gal é, obviamente, o ensaio mais adequado para detectar células senescentes. NANOG é o marcador usado para detectar células reprogramadas por dois motivos: 1) é um marcador essencial para pluripotência; 2) mais importante, sua expressão não é movido a doxiciclina (dox), portanto ele detecta pluripotência induzida ao invés da expressão forçada da fita Yamanaka.
É importante notar, os protocolos de coloração apresentados neste estudo podem ser realizados separadamente para simplificar o processo de quantificação, mas também podem ser feitos em um procedimento co coloração Visualizar ambos senescentes e células-tronco pluripotentes na mesma seção.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, apresentamos um método para detectar ambos senescentes e células-tronco pluripotentes no músculo esquelético de ratos reprogramáveis. Esse método pode ser usado para avaliar e quantificar os dois senescência e induzir plasticidade celular na vivoe examinar o papel da senescência em reparação de tecidos e regeneração.
No protocolo atual, o ensaio da senescência-associado β-galactosidase (SA-β-Gal) é usado para detectar células senescentes no vivo no mús…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos em dívida com Clemire Cimper por seu excelente suporte técnico. Trabalho no laboratório de H.L. foi financiado pelo Instituto Pasteur, Centre National pour la Recherche científico e a Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire conquistou Revive, Investissement d’Avenir; ANR-10-LABX-73), a Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) e ARC Fondation (PJA 20161205028). C.C. e C.A. são financiados pelo doutorado e pós-doutorado bolsas do consórcio reviver.
Materials
| K3Fe(CN)6 | Sigma | 13746-66-2 | For SA-β Gal staining solution |
| K4Fe(CN)6 | Sigma | 14459-95-1 | For SA-β Gal staining solution |
| MgCl2 | Sigma | 7786-30-3 | For SA-β Gal staining solution |
| X-Gal | Sigma | B4252 | For SA-β Gal staining solution |
| Doxycycline | Sigma | D3447 | For inducing in vivo reprogramming |
| Cardiotoxin | Lotaxan Valence, France | L8102 | For muscle injury |
| Glutaraldehyde | Sigma | 111-30-8 | For Fixation solution |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy science | 50-980-487 | For Fixation solution |
| NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre | Sigma | 18996-35-5 | For permeabilization solution |
| Triton | Sigma | 93443 | For permeabilization solution |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3608 | Washing solution |
| Antibody anti- Nanog | Cell signalling | 8822S | Rabbit monoclonal antibody |
| EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) | Dako | K4010 | For Nanog revelation |
| Eosin 1% | Leica | 380159EOF | Counterstainning |
| Fast red | Vector Laboratories | H-3403 | Counterstainning |
| Thermo Scientific Shandon Immu-Mount | Fisher scientific | 9990402 | Mounting solution |
| Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® | Sigma | 25608-33-7 | Mounting solution |
| Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives | Olympus | CKX41 | Microscope for Nanog quantification |
| Mouse: i4F-A | Abad et al., 2013 | N/A | Reprogrammable mouse model |
| Skeletal muscle, Tibialis Anterior | |||
| Slide Scanner | Zeiss | Axio Scan Z1 | slides scanning |
References
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