Valutazione delle lesioni-indotta senescenza e In Vivo riprogrammazione nel muscolo scheletrico

La senescenza cellulare è una forma di risposta allo stress, caratterizzata da un arresto del ciclo cellulare stabile. Nell’ultimo decennio, la ricerca ha fermamente stabilito che la senescenza è associata con vari processi biologici e patologici, compreso lo sviluppo embrionale, la fibrosi e organismo invecchiamento^1,2. La senescenza cellulare è stata identificata in fibroblasti umani alla fine della loro durata di vita ripetitiva innescato da³di riduzione del telomero. Oltre lo stress ripetitivo, ci sono molti altri stimoli che possono indurre senescenza, inclusi danni DNA, stress ossidativo, segnali oncogenici e alterazioni genomiche/epigenomic, che alla fine può attivare le vie p53/p21 e/o pRB stabilire e rafforzare la crescita permanente arresto¹. Una delle caratteristiche importanti delle cellule senescenti è che essi rimangono metabolicamente attive e robustamente esprimere un fenotipo secretivo senescenza-collegata (SASP): secrezione di molte citochine infiammatorie, fattori di crescita e matrice extracellulare fattori⁴. SASP fattori sono stati proposti a giocare un ruolo importante nel mediare e amplificando l’effetto di senescenza, dovuto i loro effetti potenti su attirando le cellule immuni e alterazione del tessuto locale e sistemica ambienti¹. È interessante notare che, senescenza è stato recentemente proposto per essere importante per tessuto riparazione e rigenerazione^5,6. Inoltre, i dati da diversi laboratori, compreso il nostro, ha suggerito che la senescenza indotta da danni del tessuto potrebbe migliorare la plasticità cellulare, via SASPs, per promuovere la rigenerazione^7–9. Di conseguenza, tutti i dati emergenti evidenziano l’importanza di studiare la senescenza in vivo.

Nell’era post-(iPSC) sulle cellule staminali pluripotenti indotte, plasticità cellulare è la capacità di una cellula di acquisire una nuova identità e di adottare un destino alternativo quando esposto a stimoli diversi nella cultura ed in vivo¹⁰. È noto che la riprogrammazione completa può essere raggiunto in vivo^11,12, dove l’espressione della la cassetta contenente quattro fattori Yamanaka: Oct4, Sox2, Klf4e c-Myc (OSKM) può essere indotta in vivo per promuovere la formazione di teratomi negli organi multipli. Di conseguenza, un modello di topo riprogrammabile (i4F) utilizzabile come un potente sistema per identificare i regolatori critici e vie che sono importanti per plasticità cellulare¹¹.

Un sistema adatto e sensibile in vivo è essenziale per capire la senescenza cellulare come regola la plasticità cellulare nell’ambito della rigenerazione dei tessuti. Qui, presentiamo un sistema robusto e un protocollo dettagliato per valutare il collegamento tra senescenza e plasticità cellulare nell’ambito della rigenerazione dei tessuti. Il danno muscolare di combinazione di con (CTX) indotta nel gruppo del muscolo tibiale anteriore (TA), un sistema ben consolidato per studiare la rigenerazione dei tessuti e il modello del mouse i4F, permette la rilevazione della senescenza cellulare sia in vivo riprogrammazione durante la rigenerazione del muscolo.

Per valutare il collegamento tra plasticità cellulare e senescenza, i4F topi sono feriti con CTX per indurre il danno muscolare acuto e trattati con doxiciclina (0,2 mg/mL) per 7 giorni per indurre in vivo riprogrammazione. Mentre un CTX indotta danno muscolare acuto e protocollo di rigenerazione è stato recentemente pubblicato¹³, per motivi etici, questa procedura verrà omesso nel protocollo corrente. Saranno raccolti campioni di muscolo TA a 10 giorni post infortunio¹³, quando il picco delle cellule senescenti sono state precedentemente osservate¹⁴. Qui, questo protocollo dettagliato descrive tutti i passaggi necessari per valutare il livello di senescenza (via SA-β-gallone) e riprogrammazione (via IHC che macchia di Nanog).

Dosaggio di beta-galattosidasi senescenza-collegata (SA-β-gallone) è il test più comunemente usato per rilevare cellule senescenti entrambi nella cultura ed in vivo¹⁵. Rispetto ad altre analisi, il dosaggio di SA-β-gallone permette l’identificazione delle cellule senescenti nel loro ambiente nativo con architettura di tessuto intatto, che è particolarmente importante per lo Studio in vivo . Inoltre, è possibile accoppiare il saggio SA-β-gallone con altri marcatori utilizzando IHC. Tuttavia, il dosaggio di SA-β-gallone richiedono campioni freschi o congelati, che rimane una limitazione importante. Quando i tessuti freschi o surgelati sono ordinariamente disponibili, come i campioni di muscolo TA congelati, SA-β-gallone è ovviamente il dosaggio più adatto per rilevare cellule senescenti. Nanog è il marcatore utilizzato per rilevare le cellule riprogrammate per due motivi: 1) è un indicatore essenziale per la pluripotenza; 2) più importante, l’espressione non è guidato da doxiciclina (dox), pertanto si rileva pluripotenza indotta piuttosto che l’espressione forzata della cassetta Yamanaka.

È importante notare che i protocolli di colorazione presentati in questo studio possono essere condotto separatamente per semplificare la procedura di quantificazione, ma possono anche essere fatto in una procedura di co-colorazione per visualizzare entrambi senescenti e cellule staminali pluripotenti sulla stessa sezione.