הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לזהות את שניהם senescent, גזע pluripotent בשריר השלד על פגיעה תוך גרימת ויוו התכנות. שיטה זו מתאימה להעריך את התפקיד של הזדקנות ביולוגית הסלולר במהלך התחדשות רקמות, התכנות ויוו.
Abstract
הזדקנות ביולוגית הסלולר היא תגובה מתח זה מאופיין על ידי מעצר צמיחה סלולרי יציב, וזה חשוב עבור תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון סרטן, הזדקנות. לאחרונה, הזדקנות ביולוגית גם היה מעורב רקמות תיקון והתחדשות. לכן, זה הפך קריטי יותר ויותר לזהות תאים senescent ויוו. הזדקנות ביולוגית-הקשורים β-galactosidase (SA-β-גל) assay הוא הבדיקה הנפוצה ביותר לזהות תאים senescent הן בתרבות והן ויוו. Assay הזה מבוסס על התכנים lysosomal מוגבר תאים senescent, מה שמאפשר זיהוי פתולוגיה lysosomal β-galactosidase פעילות ב- pH suboptimum (6 או 5.5). לעומת מבחני אחרים, כגון cytometry זרימה, זה מאפשר הזיהוי של תאים senescent בסביבתם תושב, המציע מידע בעל ערך כגון מיקום הנוגעים הארכיטקטורה רקמות, המורפולוגיה, ו האפשרות של צימוד עם סמנים אחרים באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC). המגבלה העיקרית של SA-β-גל וזמינותו היא הדרישה של דגימות טרי או קפוא.
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט כדי להבין איך הסלולר הזדקנות ביולוגית מקדמת הסלולר פלסטיות ורקמות התחדשות בתוך vivo. אנו משתמשים SA-β-גל כדי לזהות תאים senescent בשריר השלד על פגיעה, אשר היא מערכת מבוססת היטב ללמוד התחדשות רקמות. יתר על כן, אנו משתמשים IHC כדי לזהות Nanog, סמן של תאי גזע pluripotent, במודל של עכברים מהונדס. פרוטוקול זה מאפשר לנו לבחון ולכמת הזדקנות ביולוגית הסלולר בהקשר של פלסטיות הסלולר המושרה ואת ויוו התכנות.
Introduction
הזדקנות ביולוגית הסלולר היא צורה של התגובה לעקה מאופיין על ידי מעצר יציב של מחזור התא. בעשור האחרון, מחקר הקימה בחוזקה הזדקנות ביולוגית מזוהה עם תהליכים ביולוגיים ופתולוגיים שונים כולל התפתחות, פיברוזיס של האורגניזם בתהליך ההזדקנות1,2. הזדקנות ביולוגית הסלולר זוהה לראשונה ב fibroblasts האנושי בסוף על תוחלת החיים שלהם replicative המופעלות על-ידי טלומר קיצור3. מלבד הלחץ replicative, ישנם הרבה גירויים אחרים, זה יכול לגרום הזדקנות ביולוגית, כולל ה-DNA נזק, סטרס חמצוני, אותות oncogenic גנומית/epigenomic תיקונים קטנים, שכל אחד מהם יכול בסופו של דבר להפעיל המסלולים p53/p21 ו/או pRB כדי לבסס ולחזק את מעצרו של צמיחה קבוע1. אחד המאפיינים החשובים של תאים senescent הוא שהם נשארים פעילים סמויה ו robustly אקספרס (SASP) הזדקנות ביולוגית-הקשורים פנוטיפ הפרשה: הפרשת ציטוקינים דלקתיים רבים, גורמי גדילה ו מטריצה חוץ-תאית גורמים4. גורמים SASP הוצעו כדי לשחק תפקיד חשוב תיווכה ותגביר את אפקט הזדקנות ביולוגית, בגלל השפעתם חזק על משיכת תאים חיסוניים ושינוי המקומי ומערכתית רקמת milieus1. מעניין, הזדקנות ביולוגית הוצע לאחרונה להיות חשובה עבור רקמות תיקון והתחדשות5,6. בנוסף, נתונים מספר מעבדות, כולל שלנו, הציע כי רקמת נזק-induced הזדקנות ביולוגית יכול להגביר פלסטיות סלולרית, באמצעות SASPs, כדי לקדם התחדשות7–9. לכן, כל הנתונים המתעוררים להדגיש את החשיבות של לימוד הזדקנות ביולוגית בתוך vivo.
בעידן פוסט pluripotent המושרה תא גזע (iPSC) פלסטיות הסלולר הוא הקיבולת של תא לרכוש זהות חדשה, לאמץ מגורל חלופי כאשר הם נחשפים לגירויים שונים ב- תרבות, אין ויוו10. זה ידוע כי התכנות מלאה יכולה להיות מושגת ויוו11,12, שבו הביטוי בקלטת המכיל ארבעה גורמים יאמאנאקה: Oct4, Sox2, Klf4ו- c-Myc (OSKM) יכול להיות מושרה ויוו לקדם היווצרות teratomas באיברים רבים. לכן, מודל העכבר reprogrammable (i4F) יכול לשמש מערכת חזקה כדי לזהות הרגולטורים קריטי מסלולים חשובים עבור הסלולר פלסטיות11.
מערכת מתאימה ורגיש ויוו הכרחי להבין איך הסלולר הזדקנות ביולוגית מסדיר פלסטיות הסלולר בהקשר של התחדשות רקמות. כאן, אנו מציגים מערכת איתנה, פרוטוקול נתונים היסטוריים כדי להעריך את הקשר בין הזדקנות ביולוגית פלסטיות הסלולר בהקשר של התחדשות רקמות. הנזק שריר שילוב של cardiotoxin (אקס) המושרה בקבוצה השריר השוקתי הקדמי (TA), מערכת מבוססת היטב ללמוד התחדשות רקמות, המודל העכבר i4F, מאפשר הזיהוי של הזדקנות ביולוגית הסלולר והן vivo התכנות במהלך התחדשות השרירים.
כדי להעריך את הקשר בין הסלולר פלסטיות הזדקנות ביולוגית, עכברים i4F נפגע עם אקס כדי לגרום לנזק חריפה הינם מטופלים עם דוקסיציקלין (0.2 מ”ג/מ”ל) במשך 7 ימים כדי לגרום ויוו התכנות. אמנם אקס המושרה לנזק חריפה התחדשות פרוטוקול כבר שפורסמו לאחרונה13, מסיבות מוסריות, הליך זה יושמט בפרוטוקול הנוכחי. TA שריר מדגמים ייאספו בגיל 10 ימים שלאחר פגיעה13, כאשר השיא של תאים senescent בעבר נצפו14. . הנה, פרוטוקול מפורט זה מתאר את כל הצעדים הדרושים כדי להעריך את רמת הזדקנות ביולוגית (דרך SA-β-גל) ואת התיכנות (דרך IHC צביעת של Nanog).
הזדקנות ביולוגית-הקשורים בטא-galactosidase (SA-β-גל) וזמינותו היא וזמינותו הנפוצות ביותר לזהות senescent התאים שניכם תרבות, אין ויוו15. לעומת מבחני אחרים, וזמינותו SA-β-גל מאפשר הזיהוי של התאים senescent בסביבה הטבעית שלהם האדריכלות רקמות ללא פגע, אשר חשוב במיוחד למחקר ויוו . יתר על כן, זה אפשרי זוג וזמינותו SA-β-גל עם סמנים אחרים באמצעות IHC. עם זאת, וזמינותו SA-β-גל לדרוש את דגימות טרי או קפוא, הנשאר מגבלה עיקרית. כאשר רקמות טרי או קפוא זמינות באופן שגרתי, כגון דגימות שריר ת א קפואים, SA-β-גל היא כמובן וזמינותו המתאימים ביותר כדי לזהות תאים senescent. Nanog הוא הסמן להשתמש כדי לזהות תאים reprogramed משתי סיבות: 1) זה סמן חיוני עבור pluripotency; 2) ויותר חשוב, הביטוי שלה לא מונעת על ידי דוקסיציקלין (dox), ולכן הוא מזהה pluripotency המושרה במקום הביטוי כפויה בקלטת יאמאנאקה.
חשוב לציין, הפרוטוקולים מכתימים שהוצגו במחקר זה יכול להתבצע בנפרד כדי לפשט את ההליך כמת, אך ניתן לבצע גם הליך שיתוף מכתימים כדי להמחיש את שניהם senescent, גזע pluripotent על אותו סעיף.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מציגים שיטה לאתר את שניהם senescent, גזע pluripotent בשריר השלד של עכברים reprogrammable. ניתן להשתמש בשיטה זו להעריך לכמת בשני הזדקנות ביולוגית, זירוז פלסטיות הסלולר ויווושל לבחון את התפקיד של הזדקנות ביולוגית של רקמות תיקון והתחדשות.
בפרוטוקול הנוכחי, וזמינותו הזדקנות ביולו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
. אנחנו חבים Clemire Cimper לתמיכה טכנית מעולה שלה. העבודה במעבדה של מרגשת מומן על ידי מכון פסטר, מרכז לאומי pour la רשרש מדעי, ואת סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש (d’Excellence Laboratoire Revive, Investissement d’Avenir; ANR-10-LABX-73), סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש (ANR-16-CE13-0017-01) ואת Fondation ארק (PJA 20161205028). . סיסי, איי. סי ממומנות על ידי Ph.d., פוסט דוקטורנטים מן האיחוד להחיות.
Materials
| K3Fe(CN)6 | Sigma | 13746-66-2 | For SA-β Gal staining solution |
| K4Fe(CN)6 | Sigma | 14459-95-1 | For SA-β Gal staining solution |
| MgCl2 | Sigma | 7786-30-3 | For SA-β Gal staining solution |
| X-Gal | Sigma | B4252 | For SA-β Gal staining solution |
| Doxycycline | Sigma | D3447 | For inducing in vivo reprogramming |
| Cardiotoxin | Lotaxan Valence, France | L8102 | For muscle injury |
| Glutaraldehyde | Sigma | 111-30-8 | For Fixation solution |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy science | 50-980-487 | For Fixation solution |
| NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre | Sigma | 18996-35-5 | For permeabilization solution |
| Triton | Sigma | 93443 | For permeabilization solution |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3608 | Washing solution |
| Antibody anti- Nanog | Cell signalling | 8822S | Rabbit monoclonal antibody |
| EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) | Dako | K4010 | For Nanog revelation |
| Eosin 1% | Leica | 380159EOF | Counterstainning |
| Fast red | Vector Laboratories | H-3403 | Counterstainning |
| Thermo Scientific Shandon Immu-Mount | Fisher scientific | 9990402 | Mounting solution |
| Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® | Sigma | 25608-33-7 | Mounting solution |
| Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives | Olympus | CKX41 | Microscope for Nanog quantification |
| Mouse: i4F-A | Abad et al., 2013 | N/A | Reprogrammable mouse model |
| Skeletal muscle, Tibialis Anterior | |||
| Slide Scanner | Zeiss | Axio Scan Z1 | slides scanning |
References
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
- Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
- Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
- Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
- Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
- Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
- Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
- Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
- Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
- Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
- Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528 (2015).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence?. Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
- Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).
