Evaluatie van schade-geïnduceerde senescentie en In Vivo herprogrammering in de skeletspieren
Summary
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol bij het detecteren van zowel verouderend en pluripotente stamcellen in de skeletspieren op letsel tijdens het inducerende in vivo herprogrammering. Deze methode is geschikt voor de evaluatie van de rol van cellulaire senescentie tijdens Weefselregeneratie en herprogrammering in vivo.
Abstract
Cellulaire senescentie is een stress-respons die wordt gekenmerkt door de arrestatie van een stabiele cellulaire groei, die belangrijk is voor veel fysiologische en pathologische processen, zoals kanker en veroudering. Senescentie heeft onlangs ook betrokken bij weefselherstel en regeneratie. Dus, het is geworden steeds kritischer te identificeren verouderend cellen in vivo. Senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) assay is de meest gebruikte bepaling te detecteren verouderend cellen zowel in cultuur en in vivo. Deze test is gebaseerd op de verhoogde lysosomale inhoud in de verouderend cellen, waardoor de histochemische detectie van lysosomale β-galactosidase-activiteit bij een suboptimale pH (6 of 5.5). In vergelijking met andere testen, zoals de stroom cytometry, hierdoor is de identificatie van verouderend cellen in hun verblijfplaats omgeving, die waardevolle informatie zoals de locatie met betrekking tot de architectuur van weefsel, de morfologie, biedt en de mogelijkheid tot koppeling met andere markeringen via immunohistochemistry (IHC). De grote beperking van de bepaling van de SA-β-Gal is de vereiste van vers of bevroren monsters.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om te begrijpen hoe cellulaire senescentie bevordert cellulaire plasticiteit en weefsels regeneratie in vivo. We SA-β-Gal gebruiken voor het detecteren van verouderend cellen in de skeletspieren van verwonding, dat een gevestigde systeem is te bestuderen van weefselregeneratie. Bovendien gebruiken we IHC voor het detecteren van Nanog, een marker van pluripotente stamcellen, in een transgeen muismodel. Dit protocol laat ons toe om te onderzoeken en kwantificeren van cellulaire senescentie in het kader van geïnduceerde cellulaire plasticiteit en in vivo herprogrammering.
Introduction
Cellulaire senescentie is een vorm van stressrespons gekenmerkt door een stabiel celcyclus arrestatie. In het laatste decennium, heeft onderzoek verankerd dat senescentie geassocieerd met verschillende biologische en pathologische processen wordt, met inbegrip van de embryonale ontwikkeling, fibrose en organisme vergrijzing van1,2. Cellulaire senescentie werd voor het eerst geïdentificeerd in menselijke fibroblasten aan het einde van hun Dr. levensduur getriggerd door telomere verkorting van3. Naast Dr. stress zijn er vele andere stimuli die senescentie induceren kunnen, met inbegrip van DNA schade, oxidatieve stress oncogene signalen en genomische/epigenomic wijzigingen, die kan uiteindelijk het p53/p21 en/of pRB emissieroutes naar de activeren vaststellen en versterken van de permanente groei arrestatie1. Een van de belangrijke kenmerken van verouderend cellen is dat ze metabolisch actief blijven en krachtig express een senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP): afscheiding van vele inflammatoire cytokines, groeifactoren en extracellulaire matrix factoren4. SASP factoren een belangrijke rol in het bemiddelen en versterken het senescentie effect, als gevolg van hun krachtige effecten op het aantrekken van immuuncellen en wijzigen van lokale en systemische weefsel milieus1voorgesteld. Interessant, heeft senescentie onlangs voorgesteld als belangrijk weefsel reparatie en regeneratie5,6. Gegevens uit verschillende labs, met inbegrip van ons, heeft bovendien voorgesteld dat weefsel schade-geïnduceerde senescentie cellulaire plasticiteit, via SASPs, ter bevordering van de regeneratie7–9zou kunnen verbeteren. Daarom, alle opkomende gegevens benadruk het belang van het bestuderen van senescentie in vivo.
In de post geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) tijdperk is cellulaire plasticiteit de capaciteit van een cel om een nieuwe identiteit te verwerven en te nemen een alternatieve lot wanneer blootgesteld aan verschillende stimuli, beide in cultuur en in vivo10. Het is bekend dat volledige herprogrammering bereikt in vivo11,12 worden kan, waar de uitdrukking van de de cassette met vier Yamanaka factoren: Oct4, Sox2, Klf4en c-Myc (OSKM) kunnen geïnduceerde in vivo ter bevordering van de vorming van de teratomas in meerdere organen. Daarom kan een Herprogrammeerbare muismodel (i4F) worden gebruikt als een krachtig systeem om kritische toezichthouders en trajecten die belangrijk voor cellulaire plasticiteit11 zijnte identificeren.
Een geschikt en gevoelige in vivo systeem is essentieel om te begrijpen hoe cellulaire senescentie regelt cellulaire plasticiteit in het kader van weefselregeneratie. Wij presenteren hier een robuust systeem en een gedetailleerd protocol bij het evalueren van het verband tussen senescentie en cellulaire plasticiteit in het kader van weefselregeneratie. De combinatie van cardiotoxin (CTX) geïnduceerde spier schade in de Tibialis Anterior (TA) spiergroep, een gevestigde systeem te bestuderen Weefselregeneratie en de muismodel van i4F, kan de detectie van cellulaire senescentie zowel in vivo herprogrammering tijdens regeneratie van de spier.
Om te beoordelen van het verband tussen cellulaire plasticiteit en senescentie, zijn i4F muizen gewonden met CTX voor het opwekken van acute spier schade en behandeld met doxycycline (0,2 mg/mL) meer dan 7 dagen voor het opwekken van in vivo herprogrammering. Terwijl een CTX acute spier schade geïnduceerde en regeneratie protocol heeft onlangs gepubliceerde13, om ethische redenen, zal deze procedure in het huidige protocol worden weggelaten. TA spier monsters zal worden genomen op 10 dagen post letsel13, wanneer het hoogtepunt van verouderend cellen zijn eerder waargenomen14. Dit gedetailleerde protocol beschrijft hier, alle vereiste stappen voor het evalueren van het niveau van senescentie (via SA-β-Gal) en herprogrammering (via IHC kleuring voor Nanog).
Senescentie-geassocieerde beta-galactosidase (SA-β-Gal) assay is de meest gebruikte test voor de opsporing van beide verouderend cellen in cultuur en in vivo15. Vergeleken met andere testen, maakt de SA-β-Gal-bepaling de identificatie van de verouderend cellen in hun eigen omgeving met intact weefsel architectuur, die vooral belangrijk voor in vivo onderzoek is. Bovendien is het mogelijk om alleen de SA-β-Gal-assay met andere markeringen met behulp van IHC. Echter, de SA-β-Gal assay hoeft vers of bevroren monsters, die nog steeds een belangrijke beperking. Wanneer vers of bevroren weefsels routinematig beschikbaar, zoals bevroren TA spier monsters zijn, is SA-β-Gal uiteraard de meest geschikte test te detecteren verouderend cellen. NANOG is de markering gebruikt om te ontdekken van reprogramed cellen om twee redenen: 1) het is een fundamentele marker voor pluripotent; 2) nog belangrijker, de expressie wordt niet gedreven door doxycycline (dox), dus het detecteert geïnduceerde pluripotent in plaats van de gedwongen expressie van de Yamanaka cassette.
Het is belangrijk op te merken, de kleuring protocollen gepresenteerd in deze studie kunnen afzonderlijk worden uitgevoerd om de kwantificering procedure te vereenvoudigen, maar kunnen ook worden gedaan in een mede kleuring procedure te visualiseren beide verouderend en pluripotente stamcellen op dezelfde sectie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we een methode voor het detecteren van zowel verouderend en pluripotente stamcellen in de skeletspieren van Herprogrammeerbare muizen. Deze methode kan worden gebruikt om te beoordelen en kwantificeren van beide senescentie induceren cellulaire plasticiteit in vivoen onderzoeken van de rol van senescentie in weefselherstel en regeneratie.
In het huidige protocol, wordt de bepaling senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) gebruikt voor het detecteren van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zijn Clemire Cimper dank verschuldigd voor haar uitstekende technische ondersteuning. Werk in het laboratorium van H.L. werd gefinancierd door het Institut Pasteur, Centre National pour la Recherche wetenschappelijke, en het Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d’Excellence Revive, Investissement d’Avenir; ANR-10-LABX-73), de Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) en Fondation ARC (PJA 20161205028). C.C. en A.C. worden gefinancierd door de Ph.D. en postdoctorale beurzen van het Consortium doen herleven.
Materials
| K3Fe(CN)6 | Sigma | 13746-66-2 | For SA-β Gal staining solution |
| K4Fe(CN)6 | Sigma | 14459-95-1 | For SA-β Gal staining solution |
| MgCl2 | Sigma | 7786-30-3 | For SA-β Gal staining solution |
| X-Gal | Sigma | B4252 | For SA-β Gal staining solution |
| Doxycycline | Sigma | D3447 | For inducing in vivo reprogramming |
| Cardiotoxin | Lotaxan Valence, France | L8102 | For muscle injury |
| Glutaraldehyde | Sigma | 111-30-8 | For Fixation solution |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy science | 50-980-487 | For Fixation solution |
| NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre | Sigma | 18996-35-5 | For permeabilization solution |
| Triton | Sigma | 93443 | For permeabilization solution |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3608 | Washing solution |
| Antibody anti- Nanog | Cell signalling | 8822S | Rabbit monoclonal antibody |
| EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) | Dako | K4010 | For Nanog revelation |
| Eosin 1% | Leica | 380159EOF | Counterstainning |
| Fast red | Vector Laboratories | H-3403 | Counterstainning |
| Thermo Scientific Shandon Immu-Mount | Fisher scientific | 9990402 | Mounting solution |
| Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® | Sigma | 25608-33-7 | Mounting solution |
| Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives | Olympus | CKX41 | Microscope for Nanog quantification |
| Mouse: i4F-A | Abad et al., 2013 | N/A | Reprogrammable mouse model |
| Skeletal muscle, Tibialis Anterior | |||
| Slide Scanner | Zeiss | Axio Scan Z1 | slides scanning |
References
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
- Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
- Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
- Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
- Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
- Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
- Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
- Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
- Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
- Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
- Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528 (2015).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence?. Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
- Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).
