Indução de paralisia e lesão do sistema Visual em camundongos por específicos de células T para Neuromielite Óptica Autoantigen Aquaporin-4

animais todos os procedimentos foram realizados em conformidade com orientações experimentais aprovadas pela Universidade da Califórnia, cuidado Animal institucional do São Francisco e Comitê de uso. Ratos fêmeas C57Bl/6 (H-2 b), 8 semanas de idade, foram comprados e C57BL/6 AQP4 – / – ratos foram fornecidos pelo r. Verkman. 1. imunização de camundongos com peptídeos AQP4 preparar Freund completo ' estoque de trabalho adjuvante (CFA) s. Moer finamente ralada preparação de M. tuberculosis (H37Ra) usando um almofariz e um pilão. Adicionar à terra H37Ra de Freund incompleto ' adjuvante de s para uma concentração final de 4 mg/mL. CFA pode ser armazenada a 4 ° C por até 6 meses. Dissolver liofilizado do peptide AQP4 de antígeno (Ag) em solução salina tamponada fosfato (PBS) para uma concentração final de 1 mg/mL. Manter a 4 ° C ou em gelo Preparar a montagem de 2 seringas luer-lock, juntou-se com uma torneira de passagem, que contém a emulsão CFA/peptídeo. Anexar uma seringa de vidro luer-lock sem êmbolo para uma torneira de 3 vias nylon com 2 conexões luer-lock macho. Feche a torneira, comutando a alavanca para a seringa. Posicione a extremidade aberta da seringa acima, permitindo que a seringa atuar como um tubo de ensaio. Coloque isso em uma cremalheira do tubo para aumentar a estabilidade. Estoque de trabalho vortex o CFA e a solução de Ag. Adicionar um volume de 1:1 do peptídeo / CFA na seringa aberta. 200 µ l de CFA/Ag (4 x 50 µ l) é necessária por rato. Nota: Normalmente, cerca de 1 mL da preparação é perdida na torneira, o que reduzirá o montante disponível para a imunização. Portanto, é importante incorporar isto no cálculo do volume total exigido. Exemplo: para a imunização de 5 ratos: (200 animais µ l/animal x 5) + 1 mL volume extra = 2 mL CFA/Ag total necessário. Inserir o êmbolo de vidro para a seringa e, mantendo-a no lugar, inverter a seringa para que a torneira está orientada para cima. Mude a alavanca da torneira para a conexão fêmea não utilizado. Cuidadosamente, aplica pressão para o êmbolo de vidro para remover o excesso de ar da seringa. O líquido preenche a segunda conexão luer-lock macho de torneira a. Anexar uma segunda seringa de vidro (êmbolo totalmente inserido) para a segunda conexão luer-lock macho da torneira. Este deve ser um sistema fechado de 2 seringas de vidro conectado com uma torneira de passagem contendo como pouco excesso de ar possível. Mix de para criar uma emulsão, empurrando os êmbolos para passar o líquido alternadamente entre as 2 seringas para aproximadamente 2 min. Chill repetir as seringas no gelo durante cerca de 10 min. a refrigeração e misturar até que haja uma clara mudança na viscosidade da preparação , resultando em uma emulsão branca, muito dura. Refrigerar as seringas contendo a emulsão a 4 ° C ou manter no gelo Transferir todos da emulsão para seringa luer-lock de um vidro, remova a seringa de vidro vazio e substituí-lo com uma seringa de 1 mL luer-lock para injeção. Encha a seringa nova com emulsão, retire a torneira e anexar uma agulha (25 x 5/8). " água-teste " a emulsão para a consistência. Expulse uma gota da emulsão em um pequeno prato de água. A emulsão não deve dispersar, indicando que é apropriado para a injeção. Se a emulsão dispersa, não está pronta para a injeção; transferência o líquido de volta no copo de seringas e continue a misturar e em seguida relaxar novamente até que a emulsão é dura. Testar a emulsão novamente até a consistência apropriada tenha sido alcançada. Injetar camundongos de doador AQP4 – / -, por via subcutânea (s.c.) com emulsão contendo o peptídeo AQP4. Cada rato recebe injeções de s.c. 4 x 50 µ l (200 µ l total (100 µ g de peptídeo)). Os 4 sites incluem ambos os lados da parte inferior do abdome, que drenam para os linfonodos inguinais (LN), e ambos os lados da parede torácica medial para cada axila, que desaguam LN. axilar A transferência adotiva exigirá ratos imunizados doador de 1-2 por destinatário do mouse. 2. Polarização de células de cultura de células T e Proinflammatory T 10-12 dias após a imunização, coletamos os ratos LN. Em uma bandeja de gelo, preparar pratos de Petri 60mm equipado com um filtro de célula (malha tamanho 70 µm) e que contém a mídia RPMI refrigeradas com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) e estreptomicina de penicilina-100 µ g/mL 100 U/mL (pen-estreptococos) (RFPS). Euthanize ratos por exposição ao CO 2, seguido por deslocamento cervical. Mergulhe os ratos em etanol a 70% e em seguida fixar cada pata para um tabuleiro de dissecação. Cortar uma incisão de pele da virilha, no pescoço e embaixo de cada perna. Puxe a pele longe do peritônio e fixá-lo esticada à diretoria. Dissecar LN inguinal e axilar e colocar o prato de Petri contendo RFPS, no gelo. 19 para experiências de transferência adotiva, combine o LN de todos os animais dentro do mesmo grupo de imunização. Para análises de fluxo cytometric do uso Vβ, separe LN animais individuais. Coloque o filtro de célula que contém a FLN um tubo de centrífuga de 50 mL contendo RFPS. Use a extremidade achatada de um êmbolo da seringa 5ml estéril para pressionar as células LN através do filtro, lavando com 20-30 mL de RFPS para facilitar a recuperação das células. Manter as células LN no gelo durante todo o processamento até o momento para a cultura. Lavar duas vezes, centrifugação a 393 x g por 5 min. Após a segunda lavagem, Ressuspender as células LN em células T media (TCM). TCM contém RPMI com 10% inactivadas pelo calor FBS, 292 µ g/mL L-glutamina, 110 piruvato de sódio µ g/mL e 55 µM 2-Mercaptoetanol e caneta-estreptococos. Normalmente, um volume de 5 mL TCM por rato doador é usado. Contar as células de LN. Rendimento esperado é de aproximadamente 3-6 x 10 células de 7 LN por doador rato imunizado. Reserve 3-4 x 10 6 para um ensaio de proliferação (consulte a seção 3 abaixo). Configurar polarizador culturas para transferência adotiva (secção 6). Preparar uma cultura de Th17 polarizador de 5 x 10 6 LN células por mL com 10 µ g/mL Ag, 20 ng/mL do mouse recombinante interleucina (IL) -23 e IL-6 no TCM de mouse de 10 recombinante ng/mL. Como alternativa, para a polarização Th1, preparar uma cultura de 5 x 10 6 LN células por mL com 10 µ g/mL Ag e recombinante de ng/mL 10 mouse IL-12 na TCM. Adicionar 2 mL (1 x 10 7 células) por poço da mistura de cultura de polarização em uma placa de 12. As células de LN de 2-4 ratos de doador preencherá uma placa de 12. Manter as culturas em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO 2 por 72 h. Verifique visualmente as células LN na cultura para ativação em 48 h e 72 h. Activated células formarão extensivos aglomerados e as células T vão aumentar de tamanho, tornando-se mais pleomórfico. O aumento do metabolismo causará uma redução do pH na mídia, mudando de pêssego, a laranja. Se o pH estiver baixo o suficiente para transformar a mídia amarelo, adicionar 1 mL de TCM fresco para evitar toxicidade para as células no restante 24 h. Prosseguir com a secção 6 para transferência adotiva. Eficiência de polarização pode ser verificada por citocinas intracelulares (ICS), a coloração como described na seção 5. Configurar culturas usando LN de ratos individuais para análise de fluxo cytometric de superfície expressão Vβ (secção 4). Preparar 5 x 10 6 células LN / mL com 10 µ g/mL Ag em TCM. Adicionar 2 mL (1 x 10 7 células) da cultura por bem em uma placa de 12 de . As culturas devem ser mantidas em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO 2 por 10 dias. Prossiga para a secção 4. 3. Ensaio de proliferação Nota: isto continua a partir do ponto 2.4. Preparar 3-4 mL de células LN em um tubo, em 2 x 10 6 células / mL no TCM. Misture suavemente as células por inversão do tubo várias vezes e depois transferir para um cavado estéril. Placa de cultura de tecidos de fundo usar uma pipeta multicanal para placa, 100 µ l de células por poço em uma rodada de 96 poços. Normalmente, placa 15 poços para testar três vias 4 concentrações de Ag e nenhuma referência Ag. Diluir o Ag no TCM em várias concentrações, normalmente 80, 20, 5, 1 e 0 µ g/mL (para 2 unidades populacionais de x). Adicione 100 µ l de cada concentração em triplicado para uma concentração final de 40, 10, 2.5. 0,5 e 0 µ g/mL. Incubar durante aproximadamente 72 h a 37 ° C. Nota: etapas 3.5 através de 3.7 envolvem materiais radioativos. O uso correto, monitoramento e eliminação de materiais radioativos devem ser conduzidas, de acordo com regulamentos governamentais e institucionais. Prepare uma solução stock de trabalho de 3 H-timidina (40 µCi/mL) por adição 1 mCi 3 H-timidina a 25 mL RPMI e guardá-lo em 4 ° C. Pipetar 0,5 mL da solução de trabalho para uma calha estéril. Adicionar 25 µ l de 3 H-timidina (1 µCi) por bem, usando uma pipeta multicanal. Incubar durante um adicional 18 h a 37 ° C. Colheita de células para uma esteira de filtro de vidro usando uma colhedora de célula de 96 poços e enxágue com etanol a 70%. Após a secagem, sele a filtro esteira em um saco plástico amostra de líquido de cintilação de 5 mL. Radioactividade de medida em cada poço usando um contador do scintillation. 4. Fluxo Cytometry Analysis para célula superfície TCR Vβ expressão Nota: isto continua da seção 2.6. Anticorpos para mouse TCR Vβ 2, 3, 4, 5.1 e 5.2, 6, 7, 8.1 e 8.2, 8.3, 9, 10b, 11, 12, 13, 14 e 17a estão disponíveis comercialmente para testar a expressão TCR Vβ. Para detecção de TCR Vβ, desalojar as células T da placa de cultura pipetando várias vezes e transferir as células para um tubo de. Lavar com tampão de FACS (FB) contendo 2% FBS, 0,1% de azida de sódio e 2 mM EDTA em PBS. Células de transferência para uma placa de 96 V-fundo em uma densidade de 1 x 10 5 3 x 10 6 células por poço. Se o painel inteiro de Vβ está sendo testado, as células devem ser distribuídas em vários poços (um bem por Vβ sendo testado). Excluir células mortas de análise de fluxo cytometric manchando com uma tintura de viabilidade ao vivo/morto, que reage com aminas livre expostas por células necróticas. Siga o fabricante ' instruções de s para centrifugação e ressuspensão em tintura de viabilidade. Incubar no gelo por 10-20 min. em toda a pilha que mancha os procedimentos, proteger as células de luz e manter em gelo Após a incubação, lavar a placa uma vez no FB. Para detectar TCR Vβ, suspender as células em 100 µ l de FB contendo uma diluição de 1: 100 de anticorpos para CD4 (clone RM4-5) e TCR Vβ. Incube por 15-60 min no gelo Lavar a placa uma vez no FB e corrigir as células, adicionando-se 200 µ l de paraformaldeído 4%, diluído em PBS. Incube durante 20 min no gelo. Lavar a placa no FB e analisar por citometria de fluxo. 5. Fluxo Cytometric Analysis para a produção de citocinas intracelulares de citocinas intracelulares coloração (ICS), tratar a culturas de células T com uma diluição de 1:1,000 do reagente de inibidor de transporte de proteínas (por exemplo, GolgiPlug) em TCM, 4h antes da ICS para evitar secreção de citocinas. Naquele tempo, ativar as células T com 50 ng/mL phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) e 500 ng/mL ionomycin fim de induzir a produção de proteína. Após 4 h de cultura a 37 ° C, desalojar as células da placa de cultura pipetando para cima e para baixo e transfira para um tubo de centrífuga (15 ou 50 mL). Lavagem com FB. Ressuspender as células em FB e transferir para uma placa de 96 V-fundo em uma densidade de 5 x 10 5 3 x 10 6 células por alvéolo. Células de mancha com tintura de viabilidade como descrito acima (seção 4.2). Após a incubação, lavar a placa uma vez no FB. Adicionar anticorpos para a deteção de marcadores de superfície como segue: para detecção de marcadores de superfície, suspender as células em 100 µ l de FB contendo uma diluição de 1: 100 de anticorpo para CD4 (clone RM4-5). , Opcionalmente, incluir anticorpos para B220 (clone 30-F11) e CD11b (clone M1/70) a uma diluição de 1: 100 para melhorar a retenção de células B e monócitos/macrófagos, respectivamente. Geralmente, PE-Cy7 anti-CD4, FITC anti-B220 e PerCP-Cy5.5 anti-CD11b funcionam bem. Escolha de anticorpo/fluorocromo conjugados deve ser guiada pela configuração de citômetro de fluxo a ser usado para análise e optimal concentrações de anticorpos devem ser determinadas empiricamente. Incube por 15-60 min na Ice. Lavar a placa com FB e ressuspender as células em 200 µ l de solução de fixação/permeabilização por 20 min no gelo. Isto irá corrigir as células e permeabilize as membranas. a fim de manter a permeabilização de membranas celulares durante a coloracao intracelular, use o tampão de lavagem/Perm (PW) (diluídos 01:10 do estoque X 10) em vez de FB. Lavar os poços em 200 µ l de PW. Para ICS, preparar uma diluição de 1: 100 de anticorpos para o interferon (IFN)-γ e IL-17A usando 1 x PW. Uma opção é APC anti-IFN-γ (clone XMG1.2) e PE anti-IL-17A (clone eBio17B7) que funciona bem. Ressuspender as células em 100 µ l do anticorpo intracelular cocktail e então incubar durante pelo menos 15 min. Também é possível continuar a coloração durante a noite a 4 ° C. Lavar os poços em 200 µ l de PW e ressuspensão em FB por citometria de fluxo. Em paralelo, preparar uma amostra imaculada (células no FB sem anticorpos) para otimizar o detector tensões e single-manchado de amostras para cada fluorocromo individual (isto é, células ou grânulos de compensação manchados com apenas um anticorpo/fluorocromo) para determinar valores de compensação spillover. Usando um citômetro de fluxo, adquirir ≥ 10.000 células (eventos), gating no viável CD4 (LIVE/mortos-negativo) + células. Para garantir a exata gating de células T, excluir o B220 + e CD11b + células (células B e monócitos/macrófagos, respectivamente). Dentro o CD4 + T subpopulação de células, determinar a percentagem de células expressando IFN-γ (linhagem Th1) ou IL-17A (linhagem Th17). 6. Adotivos transferência de patogénicos específicos AQP4 T células Nota: esta etapa segue de secção 2.5: célula T cultura e proinflammatory polarização de célula T. Células recover polarizado 12-poço chapas por pipetagem para cima e para baixo para desalojar e transferir para um tubo de 50 mL. Maintain no gelo até injeções. Contar as células, lave duas vezes com PBS frio e preparar uma suspensão de 1 x 10 8 células/mL de PBS. Geralmente, injetar as células dentro de uma hora. , Delicadamente, misturar as células agitando e transferir para uma seringa de 1 mL, no momento da injeção. Administrar 200 µ l de células (2 x 10 7) por via intravenosa (IV) para cada mouse, através da cauda veia. Injetar cada destinatário rato i.p. com 200 ng da b. pertussis toxina diluída em 200 µ l de PBS naquele dia e 2 dias depois. Monitorar os ratos diariamente para sinais de doença clínica. 7. Avaliação clínica de ATCA Examine destinatários ratos diariamente para sinais clínicos de auto-imunidade CNS. Em geral, os ratos mostrará sinais de auto-imunidade CNS 5-8 dias após transferência adotiva de células T específicas AQP4. Os ratos mostrará sintomas clínicos de disfunção neurológica. É útil realizar as avaliações em um ingênuo rato para definir a capacidade normal de um rato. Tom ratos de avaliar a perda da cauda. Mantenha os ratos suavemente na base da cauda e levantar na vertical. Uma cauda que inclina-se continuamente é descrita como a perda da cauda o Tom (Nota 1). Perda do tônus da cauda é frequentemente o primeiro sinal da doença clínica. Reflexo teste para corrigir colocando o mouse em suas costas sobre uma superfície plana. Corrigindo lento é um sinal de incoordenação do tronco (Pontuação de 2). Um ingênuo rato completamente vai resistir a qualquer tentativa de colocá-lo em suas costas, então qualquer lentidão na capacidade de direito é marcado como uma disfunção. É típico para testar o mouse 3 – 4 vezes para este reflexo. Avaliar a postura e deambulação. Os ratos começam a mostrar uma mudança na postura, resultando em uma redução ou arrastando do quadril durante a deambulação (Pontuação de 2.5). Mais resultados de doença em monoplegia, paralisia completa de um hind de um membro (Pontuação de 3.0) e paraplegia, paralisia completa de ambos os hind dos Membros (Pontuação de 3.5). Quadraparesis moderada, fraqueza dos quatro membros, resulta em movimento muito lento (Pontuação dos 4). Quadraparesis grave não permite quase nenhum movimento (Pontuação de 4,5). Finalmente, com doença grave podem tornar-se moribundo ou morrer (Pontuação de 5). Administrar aos ratos que perdem a capacidade de adquirir alimentos líquidos ou sólidos 1 mL de glicose 5% em salina i.p. Alternativamente, uso de suplementação com fluido de gel copos, alta calóricas softies gel e toucinho para contrariar a desidratação e privação de comida. Eutanásia em ratos moribundos. 8. Preparação do tecido e histologia anestesiar ratos com 100 mg/kg de ketamina e xilazina 10 mg/kg, e em seguida fixar cada pata para um tabuleiro de dissecação. Abrir o peito, expondo o coração. Faça uma incisão do fígado para permitir a saída do sangue. Anexe uma agulha borboleta para a tubulação de uma bomba de velocidade variável miniflow usando um reservatório separado para PBS e 10% de formol. Insira a agulha no ventrículo esquerdo do coração e perfundir com 5 mL de PBS, seguido de 25 mL de formol a 10%. Remove a cabeça e, em seguida, os olhos. Olhos de processo e retinas conforme descrito anteriormente, 20. Atravessam as órbitas, insira uma tesoura no nariz e cortar o crânio anterior posterior de cada lado. Remover o crânio, expor os nervos ópticos, cortar o quiasma óptico e coloque em uma gaveta entre 2 almofadas de espuma. Mergulhar em formol a 10% (24 h) e então 50% de etanol (24h) e depois transferência para etanol a 70%. Remover o cérebro e coluna vertebral e coloque em formalina 10%. Serialmente seção cérebros no plano coronal; cabos de secção espinhal em sagital (aproximadamente metade) e coronal serial aviões (aproximadamente 20 seções cruzadas por rato). Amostras de processo CNS rotineiramente para a incorporação de parafina. Mancha de 8 µm de espessura seções com hematoxilina e eosina (nervo óptico) ou Luxol fast blue-hematoxilina e eosina (cérebro e medula espinhal). Avaliar o nervo óptico para a presença de inflamação dentro do nervo e meninges circundantes (neurite óptica) ou predominantemente em meninges circundantes (óptica perineuritis). Contar meníngeos e parenquimatosos focos inflamatórios (> 10 células mononucleares clusterizadas) nas amostras de cérebro e medula espinhal para cada mouse. 9. Na Vivo Retinal Imaging por tomografia de coerência óptica (OCT) Nota: imagem latente retinal OCT domínio espectral dos ratos é executada usando equipamento comercial (por exemplo, Spectralis com TruTrack tracker do olho) para atingir a ocular consistente orientação e reduzir artefatos de movimento. 5 min antes da imagem latente, dilatar as pupilas com tropicamida 1% (uma gota por olho) e coloque o mouse para ser fotografada na câmara de indução de anestesia, fornecendo um fluxo constante de 2 litros por minuto (1,5% de isoflurano). Vire na esteira de calor e preparar a gaiola de recuperação pós-anestesia. Coloque o mouse sobre o cilindro de imagem e redirecionar o fluxo de anestesia em conformidade. Protege os olhos com metilcelulose hidroxipropil de 0,3% para manter o olho úmido e assegurar a continuidade de refração. Coloque uma lente de contato personalizada no olho a ser examinado. Guiado pela imagem do fundo de infravermelho, direcionar o laser aos olhos, garantindo que o feixe é centrado sobre a cabeça do nervo óptico. Vertical e horizontal OCT deve confirmar que a retina apresenta o perpendicular ao laser. B 25 executar scans em modo de alta resolução e rasterização de 30 em média A-Scans. Após a imagem de ambos os olhos, remover a lente de contato e aplicar o gel oftálmico. Deixar o rato na gaiola recuperação quente. 10. Processamento e análise de out usar o modular software para segmentação automatizada de imagem. Segmentos manualmente corretos correspondente para o interior, limitando a membrana (ILM) e camada plexiforme interna (IPL), que representa os limites do interior da retina camadas (IRL) 21. Certifique-se que a camada de fibras de nervo da retina (RNFL) e a camada de células ganglionares (GCL) residam dentro dos limites da IRL e não se sobreponham. Espessuras IRL calcular usando a grade de 2 início tratamento retinopatia diabética estudo (ETDRS) com diâmetros de 1, 2 e 3 mm, centrado no disco óptico e exportar para um arquivo de planilha. O software calcula a espessura de cada camada da retina por uma média de cada setor de grade. Portanto, o segmento central, correspondente na cabeça do nervo óptico, é excluído. Analisar diferenças estatísticas entre os grupos em cada ponto de tempo. Analisar os dois olhos para cada mouse, usando generalizado estimando equações com uma matriz de correlação exchangeable e ajustes para intra-sujeitos correlações inter olho 21.