Summary

Aplicação de técnica de FlpOut MultiColor para estudar a alta resolução única célula morfologias e interações de células da Glia em Drosophila

Published: October 20, 2017
doi:

Summary

Células exibir diferentes morfologias e estabelecer uma variedade de interações com seus vizinhos. Este protocolo descreve como para revelar a morfologia das células únicas e para investigar a interação célula-célula, usando o sistema de expressão Gal4/UAS bem estabelecido.

Abstract

Células exibem morfologias diferentes e complexas relações anatômicas. Como as células interagem com seus vizinhos? Que as interações diferem entre tipos de células, ou mesmo dentro de um determinado tipo? Quais os tipos de regras espaciais que eles seguem? As respostas a essas perguntas fundamentais na vivo foram dificultadas até agora por falta de ferramentas para a rotulagem de célula única de alta resolução. Aqui, um protocolo detalhado para atingir células única com uma técnica de FlpOut MultiColor (MCFO) é fornecido. Esse método se baseia em três diferentemente marcados repórteres (HA, bandeira e V5) sob controle UAS que são mantidos em silêncio por um terminador transcricional ladeado por dois sites FRT (FRT-paragem-FRT). Uma onda de choque do calor induz a expressão de um calor induzida por choque Flp recombinase, que aleatoriamente elimina as fitas FRT-FRT-paragem em células individuais: expressão ocorre apenas em células que expressam também um driver GAL4. Isto leva a uma matriz de cores diferentes células de um tipo de célula dado que permite a visualização da morfologia das células individuais em alta resolução. Como exemplo, a técnica MCFO pode ser combinada com drivers de GAL4 gliais específicos para visualizar as morfologias dos diferentes subtipos gliais no cérebro adulto drosófila .

Introduction

Glia, a população de células não-neuronais do sistema nervoso (NS), foram por muito tempo acreditou que fornecem uma estrutura estática de neurônios e, portanto, não foram estudados em detalhe. No entanto, em humanos, glia constituem a grande maioria das células no NS (~ 90%) e caem em várias categorias diferentes, incluindo astrócitos, oligodendrócitos, micróglia e células de Schwann. Em Drosophila, glia constituem cerca de 10% das células da NS. Curiosamente, suas morfologias e funções são muito semelhantes aos encontrados em vertebrados1,2. Suas morfologias incluem a barreira hemato – encefálica (BBB) formando epitélios, ensheathing e células astrocyte.

O sistema nervoso central de Drosophila (CNS) é composto das seguintes estruturas principais: regiões do córtex que contêm os corpos celulares neuronais; neuropils que abrigar conexões sinápticas; intervalos de axônio de pequenos e grandes que se conectar a diferentes neuropiles; nervos periféricos que conectam os músculos e órgãos sensoriais com o CNS (Figura 1). Glia encontram-se associados com todas estas estruturas anatômicas: glia Cortex (CG) nas regiões corticais, como astrocyte glia (AIG) e ensheathing glia (EG) nas regiões neuropile, ensheathing glia também estão associados com intervalos de axônio central e periférico nervos (EGN) e finalmente, duas folha-como glia, glia perineurial (PG) e subperineurial (SPG), que juntos formam uma camada contígua que cobre o NS inteiro (Figura 2).

Estudos anteriores mostraram que glia desempenham papéis importantes no desenvolvimento do NS; monitorar os números de celular neuronal por reagir a circula sistemicamente insulin-como peptides, fornecem suporte trófico para os neurônios, tais como o transporte do lactato astrocyte-neurônio e eliminar os neurônios morrendo por fagocitose3,4 , 5 , 6. no NS maduro, glia manter o BBB, ocupam os neurotransmissores e manter a homeostase iónica, atuam como as principais células do sistema imunológico da ns, desde que os macrófagos não podem violar o BBB e modulam a atividade sináptica, bem como comportamento animal6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.

Se os diferentes subtipos gliais executam funções especializadas permanece uma importante questão em aberto. No entanto, uma análise sistemática de todo o genoma da glia, especialmente no adulto, é dificultada pela falta de ferramentas genéticas adequadas para sua manipulação. Aqui, um método que permite a caracterização eficiente e fácil de formas de célula para estudar interações célula-célula complexo é apresentado. Esta técnica foi aplicada para caracterizar a morfologia dos diferentes subtipos gliais no cérebro adulto Drosophila , mas, dependendo do driver específico GAL4 usado, isso poderia ser adaptado para estudar neurônios12,13 , qualquer tipo de entrelaçamento de células e em princípio qualquer tecido em qualquer fase do desenvolvimento.

Protocol

1. moscas preparando-se para experiências MultiColor FlpOut (MCFO) Nota: técnica de The MCFO refere-se a uma versão modificada da excisão de gaveta mediada por Flp parada chamado (FlpOut). Transgénicas MCFO moscas carregam um promotor de choque térmico (hsp)-recombinase Flp e repórteres diferentes sob UAS controlam. Cada repórter consiste de um backbone comum de um myristoylated (myr) super pasta verde proteína fluorescente (sfGFP), no quais 10 cópias de uma marca de epítopo (EG…

Representative Results

Esta seção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos usando a técnica MCFO no cérebro adulto drosófila . A Figura 3 mostra um esquema do método. Três diferentemente a membrana-tag repórteres (myr-smGFP-HA, myr-smGFP-bandeira e myr-smGFP-V5) sob controle UAS são mantidos em silêncio por um terminador transcricional ladeado por dois sites FRT (FRT-paragem-FRT). Uma onda de choque do calor induz a expressão de re…

Discussion

Este protocolo descreve um método fácil e eficiente para estudar a morfologia dos diferentes tipos de células dentro de um tecido de interesse em alta resolução. Com a técnica MCFO, vários repórteres com epítopo diferente tags são usados em combinação para a rotulagem estocástico multicolor (Figura 2). Semelhante a outros métodos, como Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO aumenta a diversidad…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecer Arnim Jenett Aljoscha Nern e outros membros do laboratório Rubin para aconselhamento e partilha de reagentes inéditos e Janelia voar luz equipe do projeto para a geração de imagens confocal. Os autores também agradecer aos membros do laboratório Gália para comentários sobre o manuscrito.

Materials

Water bath Grant GD100
PCR tubes Sarstedt 72.737.002
Forceps Dumont 11251-20
Dissecting dish 30 mm x 12 mmm Electron Microscopy Sciences 70543-30 Glass dissection dish
Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate Corning 7223-34 Glass dissection plates
Sylgard Black SYLGARD, Sigma-Aldrich 805998 home made with charcoal
ExpressFive S2 cell culture medium Invitrogen 10486-025
20% PFA Electron Microscopy Sciences 15713
Triton X-100 Roth 3051.3
Normal goat serum Jackson Laboratories 005-000-121
Normal donkey serum Jackson Laboratories 017-000-121
Bovine Serum Albumin Sigma A9647
Rabbit HA-tag Cell Signaling C29F4 Primary antibody, dilution 1:500
Rat FLAG-tag Novus Biologicals NBP1-06712 Primary antibody, dilution 1:100
Mouse V5-tag:DyLight 549 AdSerotec 0411 Conjugated antibody, dilution 1:200
anti-rabbit AlexaFluor 488 Invitrogen A11034 Secondary antibody, dilution 1:250
anti-rat DyLight 647 Jackson Laboratories 712-605-153 Secondary antibody, dilution 1:100
Vecta Shield Vector Laboratories H-1000
SlowFate Gold Invitrogen S36937
Secure Seal Spacer Grace Biolabs Contact company for ordering
Microscope cover glass 22 X 60 mm Marienfeld 101152
Microscope cover glass 22 x 22 mm Roth H874
Stereo Microscope, Leica MZ6 Leica
Confocal laser scanning microscope LSM710 Zeiss
Immersol Zeiss 518 F Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free
Immersol Zeiss W 2010 Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free
R56F03-GAL4 (EG) Bloomington Stock Center 39157 GAL4 driver
R86E01-GAL4 (ALG) Bloomington Stock Center 45914 GAL4 driver
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 Bloomington Stock Center 64085 UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
Fiji (Image J) Image analysis software
Multi Time Macro Zeiss Software for automated scanning

References

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Cite This Article
Batelli, S., Kremer, M., Jung, C., Gaul, U. Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila. J. Vis. Exp. (128), e56177, doi:10.3791/56177 (2017).

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