Summary

높은 해상도 단일 셀 형태학 초파리 에서 명과의 세포 상호 작용을 공부 하 고 다 색 FlpOut 기술의 응용

Published: October 20, 2017
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Summary

셀 다른 형태학을 표시 하 고 그들의 이웃과 상호 작용의 다양 한 설정. 이 프로토콜에는 단일 세포의 형태를 공개 하 고 확고 Gal4/UAS 식 시스템을 사용 하 여 세포 세포 상호 작용을 조사 하는 방법을 설명 합니다.

Abstract

셀 다른 형태학 및 복잡 한 해 부 관계를 표시합니다. 그들의 이웃과 셀 어떻게 상호 작용 합니까? 상호 작용 세포 유형 사이 또는 지정 된 형식 내에서 심지어 다릅니까? 그들은 어떤 종류의 공간 규칙을 따라 합니까? 이러한 근본적인 질문에 비보에 대 한 답변 고해상도 단일 셀 라벨에 대 한 도구의 부족으로 지금까지 방해 되어 있다. 여기, 상세한 프로토콜 멀티 컬러 FlpOut (MCFO) 기법으로 단일 세포를 대상으로 제공 됩니다. 이 방법은 3 다르게 태그 기자 (HA, 플래그 및 V5) UAS 통제 transcriptional 터미네이터 2 개의 FRT 사이트 (FRT-정지-FRT)에 의해 형벌에 의해 자동 보관을 사용 합니다. 열 충격 펄스 유도 열 충격 유도 Flp recombinase, 개별 셀에 FRT-정지-FRT 카세트를 임의로 제거 하 식: 식 또한 GAL4 드라이버를 표현 하는 셀에만 발생 합니다. 이것은 높은 해상도에서 개별 셀 형태학의 시각화 수 있는 특정된 셀 종류의 서로 다른 색된 셀의 배열. 예를 들어, MCFO 기술 초파리 두뇌의 다른 폐해의 형태학을 시각화 하기 위해 특정 glial GAL4 드라이버와 결합할 수 있습니다.

Introduction

명과, 신경 계통 (NS), 비 신경 세포 인구 했다 긴 신경 세포에 대 한 정적 프레임 워크를 제공 하 고 따라서 자세히 공부 하지 했다. 그러나, 인간, 명과 셀 NS (~ 90%)의 대다수를 구성 하 고 이다, oligodendrocytes, microglia 및 Schwann 세포를 포함 하 여 일부의 범주에 빠지다. 초파리에서 명과 NS에 있는 세포의 약 10%를 구성 합니다. 글에, 그들의 형태학과 기능 척추 동물1,2에서 발견 된 현저 하 게 유사 하다. 그들의 형태학 혈액-뇌 장벽 (BBB) 형성 epithelia, ensheathing, 사이토와 같은 셀을 포함 합니다.

다음 주 구조 이루어져 초파리 중앙 신경 시스템 (CNS): 신경 셀 시체;를 포함 하는 피 질 영역 neuropils 시 냅 스 연결 항구 다른 neuropiles; 연결 하는 크고 작은 축 삭 책자 CNS는 (그림 1)과 감각 기관과 근육을 연결 하는 주변 신경 명과 이러한 모든 해 부 구조와 관련 된 찾을 수 있습니다: 피 질 명과 (CG) 대뇌 피 질의 영역, 사이토 처럼 명과 (ALG) 및 neuropile 지역, ensheathing 명과 ensheathing 명과 (EG)에 또한 중앙 축 삭 책자와 주변 기기 연결 신경 (EGN), 그리고 마지막으로, 두 개의 시트 같은 명과, perineurial 명과 (PG) subperineurial (SPG)는 함께 전체 NS (그림 2)를 포함 하는 연속 층을 형성 하 고.

이전 연구는 명과 NS;의 개발에 중요 한 역할을 그들은 체계적으로 순환 인슐린 같은 펩 티 드에 반응 하 여 신경 세포 수를 모니터링 하 고 사이토 신경 젖 셔틀 같은 신경에 영양 지원을 제공, 먹어서3,4 여 죽어가는 신경 세포를 제거 , 5 , 6. 성숙한 NS에서 명과 BBB 유지, 신경 전달 물질을 차지 하 고 이온 항상성 유지, NS, 주요 면역 세포 대 식 세포 수 없기 때문에 BBB, 위반 시 냅 스 활동으로 동물 행동6 조절 역할 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.

다른 폐해 하위 전문된 기능을 수행 하는 여부는 중요 한 미결 문제에 남아 있다. 그러나, 명과, 성인, 특히에 대 한 체계적인 게놈 넓은 분석 그들의 조작에 대 한 적절 한 유전 도구의 부족에 의해 방해 되어 있다. 여기, 셀 셰이프 셀을 복잡 한 상호 작용을 공부를 효율적이 고 쉬운 특성을 허용 하는 메서드가 제공 됩니다. 이 기술은 성인 초파리 뇌의 다른 폐해의 형태학 특성을 적용 하지만, 특정 GAL4 드라이버 사용에 따라 그것은 신경12,13 공부에 적응 수 있습니다. , intermingling 셀의 원리에 어떤 종류 어떤 발달 단계에 있는 조직.

Protocol

1. 멀티 컬러 FlpOut (MCFO) 실험에 대 한 준비 파리 참고: The MCFO 기술 소위 Flp 중재 중지 카세트 절단 (FlpOut)의 수정된 된 버전을 말합니다. 유전자 변형 MCFO 파리 열 충격 발기인 (hsp) 수행-Flp recombinase UAS 아래 다른 기자 제어. 각 기자 myristoylated (myr) 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (sfGFP), 피토 프 태그의는 10 년에서의 일반적인 백본 구성 됩니다 (예., 하, 플래그 또는 V5) 삽입 되…

Representative Results

이 섹션에서는 초파리 두뇌의 MCFO 기술을 사용 하 여 얻을 수 있는 결과의 예를 보여 줍니다. 그림 3 방법의 회로도 보여준다. 3 명의 다르게 막 태그 기자 (myr-smGFP-하, myr-smGFP-플래그 myr-smGFP-V5) UAS 통제 transcriptional 터미네이터 2 개의 FRT 사이트 (FRT-정지-FRT)에 의해 형벌에 의해 자동 보관 됩니다. 열 충격 펄스 유도 임의로 개별 셀?…

Discussion

이 프로토콜 높은 해상도에 관심의 조직 내에서 다른 세포 유형의 형태를 연구 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다. MCFO 기술을 다른 epitope 태그로 여러 기자 색 확률적 라벨 (그림 2)에 대 한 조합에 사용 됩니다. Brainbow/Flybow15,,1617등 다른 방법과 마찬가지로 MCFO 증가 마커 coexpression 통해 레이블 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 아 르 님 Jenett, Aljoscha Nern, 및 조언을 루빈 연구소의 다른 회원 들과 공유 되지 않은 시 약 및 confocal 이미지를 생성 하기 위한 Janelia 비행 빛 프로젝트 팀 감사 합니다. 저자 또한 원고에 의견에 대 한 갈리아 연구소의 회원을 감사합니다.

Materials

Water bath Grant GD100
PCR tubes Sarstedt 72.737.002
Forceps Dumont 11251-20
Dissecting dish 30 mm x 12 mmm Electron Microscopy Sciences 70543-30 Glass dissection dish
Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate Corning 7223-34 Glass dissection plates
Sylgard Black SYLGARD, Sigma-Aldrich 805998 home made with charcoal
ExpressFive S2 cell culture medium Invitrogen 10486-025
20% PFA Electron Microscopy Sciences 15713
Triton X-100 Roth 3051.3
Normal goat serum Jackson Laboratories 005-000-121
Normal donkey serum Jackson Laboratories 017-000-121
Bovine Serum Albumin Sigma A9647
Rabbit HA-tag Cell Signaling C29F4 Primary antibody, dilution 1:500
Rat FLAG-tag Novus Biologicals NBP1-06712 Primary antibody, dilution 1:100
Mouse V5-tag:DyLight 549 AdSerotec 0411 Conjugated antibody, dilution 1:200
anti-rabbit AlexaFluor 488 Invitrogen A11034 Secondary antibody, dilution 1:250
anti-rat DyLight 647 Jackson Laboratories 712-605-153 Secondary antibody, dilution 1:100
Vecta Shield Vector Laboratories H-1000
SlowFate Gold Invitrogen S36937
Secure Seal Spacer Grace Biolabs Contact company for ordering
Microscope cover glass 22 X 60 mm Marienfeld 101152
Microscope cover glass 22 x 22 mm Roth H874
Stereo Microscope, Leica MZ6 Leica
Confocal laser scanning microscope LSM710 Zeiss
Immersol Zeiss 518 F Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free
Immersol Zeiss W 2010 Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free
R56F03-GAL4 (EG) Bloomington Stock Center 39157 GAL4 driver
R86E01-GAL4 (ALG) Bloomington Stock Center 45914 GAL4 driver
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 Bloomington Stock Center 64085 UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
Fiji (Image J) Image analysis software
Multi Time Macro Zeiss Software for automated scanning

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Cite This Article
Batelli, S., Kremer, M., Jung, C., Gaul, U. Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila. J. Vis. Exp. (128), e56177, doi:10.3791/56177 (2017).

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