התאים להציג מורפולוגיות שונות, ליצור מגוון רחב של אינטראקציות עם שכניהם. פרוטוקול זה מתאר איך לחשוף את המורפולוגיה של תאים בודדים כדי לחקור את תא-תא אינטראקציה באמצעות מערכת ביטוי Gal4/UAS ומבוססת.
תאים להציג מורפולוגיות שונות ויחסים האנטומי מורכב. כיצד תאים אינטראקציה עם שכניהם? האינטראקציות נבדלים בין סוגי תאים או אפילו בתוך סוג מסוים? אילו סוגים של חוקים מרחבי הם בצע? תשובות כאלה שאלות עקרוניות ויוו יש כבר הקשו עד כה על ידי חוסר כלים עבור תיוג תא בודד ברזולוציה גבוהה. . הנה, פרוטוקול מפורט היעד תאים בודדים עם טכניקה ססגוניות FlpOut (MCFO) הינו מסופק. שיטה זו מתבססת על שלושה אחרת מתויג עיתונאים (HA, דגל ו- V5) תחת שליטה UAS שנשמרים שקט מאת בסיים תעתיק ולצדו והשפלתם שני אתרים (והשפלתם-עצור-והשפלתם). דופק הלם החום המניע את הביטוי חום הנוצרות על-ידי הלם Flp recombinase, אשר באופן אקראי מסירה את הקלטות והשפלתם-עצור-והשפלתם תאים בודדים: ביטוי מתרחשת רק בתאים המבטאים גם מנהל התקן GAL4. זה מוביל מערך של תאים בצבעים שונים של סוג תא נתון המאפשר את החזיית תא בודד מורפולוגיות ברזולוציה גבוהה. כדוגמה, הטכניקה MCFO יכול להיות משולב עם נהגים GAL4 גליה ספציפיים כדי להמחיש את מורפולוגיות מסוגי המשנה גליה שונים במוח דרוזופילה למבוגרים.
עכשיו, דונלד, האוכלוסייה הלא-דופאמינרגיים של מערכת העצבים (NS), זמן האמינו לספק מסגרת סטטי של נוירונים, לכן לא נחקרו בפירוט. עם זאת, אצל בני אדם, עכשיו, דונלד מהווים את הרוב המכריע של תאים שריכזה (~ 90%), מחולקים למספר קטגוריות שונות, כולל האסטרוציטים, oligodendrocytes להפוך, מיקרוגלייה תאי שוואן. דרוזופילה, עכשיו, דונלד מהווים כ- 10% של תאים שריכזה. מסקרן, מורפולוגיות והפונקציות שלהם דומים להפליא אלה שנמצאו בעלי חוליות1,2. מורפולוגיות שלהם כוללים את מחסום הדם – מוח (BBB) ויוצרים epithelia, ensheathing ותאים אסטרוציט דמוי.
מערכת העצבים המרכזית (CNS) דרוזופילה מורכב המבנים העיקריים הבאים: קליפת אזורים המכילים את הגופות תאים עצביים; neuropils זה הנמל קשרים סינפטיים; ספינלי האקסון קטנים וגדולים המחברים את neuropiles שונים; העצבים ההיקפיים המחוברים אברי החישה והשרירים עם מערכת העצבים (איור 1). עכשיו, דונלד נמצאים המשויכים כל מבנים אנטומיים אלה: קליפת עכשיו, דונלד (CG) באזורים קורטיקליים, אסטרוציט כמו עכשיו, דונלד (נועה) ו- ensheathing עכשיו, דונלד (למשל) באזורים neuropile, ensheathing עכשיו, דונלד קשורים גם עם ספינלי האקסון המרכזית, ההיקפית העצבים (EGN), ולבסוף, שני גיליון עכשיו, דונלד, עכשיו, דונלד perineurial (עמוד) subperineurial (SPG), אשר ביחד יוצרים שכבה רציפה שמכסה את NS כולו (איור 2).
מחקרים קודמים הראו כי עכשיו, דונלד תפקיד חשוב בהתפתחות NS; הם לפקח דופאמינרגיים מספרים על ידי מגיב מערכתית במחזור דמוי אינסולין הפפטידים, לספק תמיכה עם מחלות את הנוירונים, כגון המעבורת לקטט אסטרוציט-נוירון, ולחסל נוירונים גוססים על ידי phagocytosis3,4 , 5 , 6. שריכזה בוגרת, עכשיו, דונלד לשמור על BBB, תופסים נוירוטרנסמיטורים לשמור על הומאוסטזיס יוניים, לשמש התאים החיסוניים הגדולות המחלקה שכן המקרופאגים לא יכול לפרוץ BBB, לווסת את פעילות סינפטית, כמו גם התנהגות בעלי חיים6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
אם תתי סוגים שונים גליה לבצע פונקציות מיוחדות נותרת שאלה פתוחה חשוב. עם זאת, ניתוח הגנום כולו שיטתית של עכשיו, דונלד, במיוחד אצל אדם בוגר, יש כבר הקשו על ידי חוסר המתאימה לכלים שלהם מניפולציה גנטית. כאן, מוצגת שיטה המאפשרת אפיון תא צורות ללמוד אינטראקציות מורכבות תא תא יעיל וקל. טכניקה זו הוחל לאפיין המורפולוגיה של גליה תתי-סוגים שונים במוח דרוזופילה למבוגרים, אבל, בהתאם הנהג GAL4 ספציפי בשימוש, זה יכול להיות מותאם ללמוד נוירונים12,13 , כל סוג של תאים בזה, באופן עקרוני כל רקמות בשלבים התפתחותיים כלשהם.
פרוטוקול זה מתאר שיטה נוחה ויעילה ללמוד המורפולוגיה של סוגי תאים שונים בתוך רקמה עניין ברזולוציה גבוהה. עם הטכניקה MCFO, כתבים מרובים עם תגי epitope שונים משמשים בשילוב של תיוג סטוכסטי ססגוניות (איור 2). בדומה בשיטות אחרות כגון Brainbow/Flybow15,16,<sup…
The authors have nothing to disclose.
המחברים תודה ארנים Jenett Aljoscha Nern, חברים אחרים של המעבדה רובין לקבלת ייעוץ ושיתוף של ריאגנטים שלא פורסמו, Janelia לטוס אור צוות הפרוייקט ליצירת תמונות קונפוקלי. המחברים גם תודה חברי המעבדה גאליה להערות על כתב היד.
Water bath | Grant | GD100 | |
PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
Forceps | Dumont | 11251-20 | |
Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |