Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

O método descrito acima permite a visualização confiável e reprodutível de praticamente qualquer região do cérebro adulto drosófila . Aqui temos focado no cogumelos corpos e fotoreceptor neurônios, mas outros estudos utilizaram métodos semelhantes para visualizar regiões do cérebro como a pars intercerebralis52, relógio neurônios53,54e da antena lobo projeção neurônios55, entre muitos outros. Importante, esta técnica pode ser usada para visualizar estruturas do cérebro inteiro tanto neurônios individuais dentro dessas estruturas utilizando técnicas como MARCM12,47. Figura 4, Figura 5e Figura 6 mostram vários tipos diferentes de dados de corpos cogumelos e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos que podem ser gerados usando esta técnica de dissecção e imunocoloração. Primeiro, o método descrito acima pode ser usado para visualizar diretamente a morfologia de cogumelo corpo usando os anticorpos que reconhecem Fasciculin 2 (Fas2) ou genes repórter expressados em corpo cogumelo neurônios34. Como mostrado na Figura 4 e Figura 4B, Fas2 anticorpos podem ser usados para visualizar o α, β e (em menor grau) lóbulos γ dos corpos cogumelos em adultos Drosophila cérebros. Fas2 é uma proteína de adesão célula-célula necessária para neurônio fasciculação e é expresso em níveis elevados no α e β lóbulos23,56,57, tornando-se um marcador confiável e bem estabelecido destes cogumelos neurônios do corpo. Notavelmente, o corpo de elipsoide de forma circular, localizado na região central do cérebro adulto também pode ser visualizado usando este anticorpo(Figura 4). Defeitos de proteínas axonal orientação muitas vezes causam incompleta penetrante corpo cogumelo fenótipos mutantes15,34,35. Portanto, na maioria das circunstâncias, várias dezenas de cérebro deve ser fotografado e analisado. Por exemplo, os axônios de lobo β cogumelo corpo das moscas nulos Nab2 inadequadamente cruzam a linha média do cérebro. Este fenótipo de “fusão” lobo “crossing over” ou β normalmente é observado em ~ 80% dos adultos Nab2 nulo voa, mas é principalmente ausente dos controles do selvagem-tipo e pode ser classificada como leve, moderada ou completa fusão34. A “fusão” dos lobos β do outro lado da linha média resulta da projeção incorreta contralateral de axônios no hemisfério oposto do cérebro. Como mostrado na Figura 4C e detalhadas em34,35, ligeira fusão refere-se a lóbulos β, ligados por um “fio fino de fibras Fas2-positivo,” enquanto fusão moderada refere-se mais lobos substancialmente conectada β que mostram uma espessura ligeiramente diminuída lobo na linha. Fusão completa (ou “extrema”) refere-se a lóbulos β que estão totalmente ligados e mostram sem diminuição da espessura do lóbulo ou Fas2 coloração na linha. A extensão da fusão de lóbulo cogumelo corpo β pode ser quantificada e exibida como demonstrado em 34,35 ou como uma tabela que mostra a porcentagem do cérebro mostrando cada tipo de defeito de morfologia. Além de coloração com anticorpos Fas2, o de47,de12,48 MARCM técnica também pode ser usado para visualizar as decisões de orientação de axônio dos neurônios individuais de GFP+ dentro dos lóbulos corpo cogumelo. MARCM utiliza recombinação mitótica durante o desenvolvimento para criar neurônios individuais ou grupos com uma relação clonal de neurônios, marcados com GFP (Figura 5A). MARCM fornece uma maneira para gerar um pequeno número de neurônios que falta completamente uma proteína dentro de um caso contrário heterozigoto voar. Como tal, esta técnica tem sido especialmente útil para analisar as funções de orientação axonal de proteínas que são também essenciais para a viabilidade global dos12,47. Homozigotos nulos neurônios marcados com GFP podem ser comparados diretamente para controlar os neurônios marcados com GFP em um fundo genético do selvagem-tipo. Além disso, dependendo de quando em desenvolvimento de larvas ou pupas são calor-chocado, diferentes classes de cogumelo corpo neurônios podem ser alvo (Figura 5B). Um exemplo do tipo de dados gerados usando esta técnica é mostrado na Figura 5C, onde o selvagem-tipo (ou seja, controle) MARCM clones são gerados como um exemplo. Para gerar os neurônios de cogumelo corpo individuais GFP+ mostrados na Figura 5C, desenvolvendo F1 larvas foram inicialmente alojadas em 25 ° C. Aproximadamente 5-6 dias após a eclosão larvar (ALH), pupas foram calor chocado por 30 min a 37 ° C e em seguida retornou a 25 ° C até a eclosão. Após a eclosão do adulto, cérebros foram dissecados no PTN, fixo e simultaneamente incubados com anticorpos reconhecendo Fas2 (1, 4, diluído 01:20 em PTN) e GFP (diluído 1: 500 em PTN). Cérebros foram então incubados com anticorpos secundários e montados em slides conforme descrito acima. Células GFP+ foram identificadas e fotografaram usando um microscópio confocal de varredura a laser e projeções de intensidade máxima foram criadas usando o ImageJ. Como demonstrado na Figura 5C, controle de GFP+ neurônios gerados nos lóbulos α e β colocalize com Fas2 e terminar antes de contatar a linha que separa os dois hemisférios do cérebro drosófila . Um único axônio projetos anteriormente, bifurca e então os dois projetos dorsalmente e medialmente ao formulário o α e β lóbulos. Vários estudos anteriores usaram esta técnica para investigar se determinadas proteínas são necessárias para estudar a divisão celular autonomamente para muitos aspectos da axonogênese, incluindo a extensão, pathfinding, ramificação e/ou poda10, 11,12,13,14,15,16,17,34. Além dos corpos de cogumelos, as decisões de pathfinding axonal de neurônios fotorreceptoras da retina (R-células) podem também ser visualizadas usando o método de dissecação descrito acima (bem como o de método de dissecaçãocrito em referência48). Cada omatídeos dentro do olho de mosca contém 8 neurônios fotorreceptoras que podem ser classificados em três grupos (Figura 1): R1-R6 células, que se projetam axônios para a lâmina superficial do cérebro lobo óptico; R7 as células, que se projetam axônios para a camada mais profunda da M6 da medula; e o R8 células, que se projetam axônios para a camada intermediária de M3 da medula19,58. O padrão de projeção de cada classe de fotorreceptoras tem sido estudado extensivamente, e juntos esses neurônios foram usaram com sucesso como um modelo para compreender as vias de sinalização envolvidas no axônio orientação19,59. Importante, todos os axônios fotorreceptoras podem ser facilmente visualizados em cérebros dissecados de drosófila por imunocoloração do adulto, pupa, ou tecidos larvais usando um anticorpo que reconhece chaoptin, glicoproteína24, de superfície de uma célula 60 , 61. genes repórter expressando GFP ou β-galactosidase em cada tipo de R-células (células R1-R6, R7 e R8) também foram construídos e pode ser usados para visualizar cada classe de fotorreceptoras62. Desde que cada tipo de célula-R termina em uma camada diferente do lobo óptico em desenvolvimento, esses repórteres permitiram comparações detalhadas das vias sinalização necessárias para cada tipo de célula corretamente encontrar seu alvo. Um exemplo dos padrões de expressão produzida por dois destes genes repórter em combinação com a localização de chaoptin (que pode ser usada como um marcador de todos os neurônios fotorreceptoras) é mostrado na Figura 6. Para visualizar o R7 fotorreceptores, cérebros contendo o gene repórter do R7 específicos Rhodopsin4-LacZ foram dissecados e manchados com anticorpos anti-chaoptin e β-galactosidase. Rhodopsin 4 (Rh4) é expressa especificamente em um subconjunto do R7 células63; o promotor Rh4 , portanto, pode ser usado para dirigir a expressão do gene repórter só nestas células. Como esperado, as células R7 encerrar na camada mais profunda da M6 da medula (indicada com uma linha pontilhada amarela Figura 6). Da mesma forma, o cérebro expressando β-galactosidase da rodopsina 6 (Rh6) promotor, que é expressa especificamente no R8 fotorreceptores63, foram dissecados e immunostained usando anticorpos reconhecendo chaoptin e Β-galactosidase. Como mostrado na Figura 6, R8 fotorreceptores encerrado na camada de R3 amedula. Embora não mostrado aqui, Rh1-LacZ também pode ser usado para visualizar a finalização do R1-R6 fotorreceptores na lâmina. Figura 1: o adulto Drosophila melanogaster cérebro consiste em regiões funcionalmente distintas mas interligadas. Cérebro (A), um esboço do adulto d. melanogaster é mostrado, destacando os corpos cogumelos centralmente localizados e neurônios fotorreceptoras da retina periférica. (B) diagrama alargada dos feixes de axônio corpo cogumelo adulto (também chamados lóbulos) que são reconhecidos por anticorpos Fas2. Os neurônios intrínsecos dos corpos cogumelos, chamados células de Kenyon, projeto axônios anteriormente de corpos celulares localizados dorsalmente (corpos celulares omitidos neste diagrama) e formam estruturas distintas de lobo. No cérebro de um adulto, a forma de lóbulos (mostrado em vermelho) γ de um único feixe medial de axônios, enquanto o α dorsal e forma de lóbulos (mostrado em azul) β medial de um único axônio que se bifurca durante o processo de pathfinding. Α ‘ / β’ neurônios desenvolvem lóbulos axonal que parcialmente se sobrepõem com os dos neurônios α/β, mas não são reconhecidos pelos anticorpos Fas2 e são omitidos neste diagrama. Os neurônios da retina (C) são fundamentais para veicular a informação visual da retina o lobo óptico. Projeto de axônios de corpos celulares localizados na retina (bege) e conexões de formulário com células alvo pós-sináptica na lâmina ou medula. R1-R6 fotorreceptoras células (mostradas em vermelho) formulário específicas ligações com células na camada exterior do lobo óptico, chamado a lâmina. R7 fotorreceptoras células sinapse (amarelo) com alvos na camada M6 da medula, enquanto as células R8 (mostradas em verde) projeto axônios para a camada de M3 ligeiramente mais superficial da medula. Parte C adaptado com permissão da Macmillan Publishers Ltd: natureza neurociência (referência64, copyright (2011)). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: GAL4/UAS o sistema pode ser usado para a expressão do gene alvo. Para obter expressa um gene de interesse (“Gene X”) em um padrão específico de tecido de moscas, moscas devem conter tanto um transgene expressando a proteína ativador transcricional de Gal4 sob o controle de um potenciador de tecido específico um transgene contendo o DNA de Gal4 ligação de sequência (chamada de Upstream ativando sequência ou UAS) adjacente ao Gene X. normalmente, essa combinação é alcançada acasalamento moscas parentais que cada um contém um transgene e selecionando para progênie de F1 que contêm ambos. Na geração1 F resultante, Gal4 será expressa e ligará para a UEA para ativar a transcrição do Gene X de uma maneira específica de tecido. Importante, os transgenes UAS contendo diferentes pode ser usado em combinação com a mesma GAL4 “motorista”. Por exemplo, um transgene expressando Gal4 nos órgãos do cogumelos (MBs) pode ser combinado com um transgene UAS-contendo a GFP expresso, um transgene que derruba a expressão de um gene de interesse, usar interferência de RNA ou um transgene-UAS que produz um repórter. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3 : Montagem o cérebro na preparação para a imagem latente de imunofluorescência. (A) cérebros são montados em slides SuperFrost Plus com uma tampa de ponte para evitar o achatamento dos cérebros. Duas lamínulas “base” são aderiu a um slide Superfrost Plus carregado positivamente, com esmalte de unha clara e cérebros dissecados são então colocados no slide entre eles. Um deslizamento da tampa clara “ponte” é colocado sobre o cérebro e aderido as base lamínulas. (B) uma vez o esmalte de unha seco, Vectashield é pipetado lentamente sob a ponte para preservar a fluorescência do anticorpo secundário. Esmalte de unha clara é usado para selar a parte superior e inferior da lamínula “ponte”. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Axônios de corpo cogumelo podem ser claramente visualizados usando anticorpos que reconhecem Fas2. (A) adulto Drosophila cérebros foram dissecados, fixo e incubados com anticorpos reconhecendo Fas2. Anticorpos primários foram reconhecidos usando anticorpos secundários acoplados Alexa488 da cabra-anti-mouse e cérebros foram montados em slides carregado positivamente e fotografaram usando um microscópio confocal de varredura de laser. Bisymmetrically localizado cogumelo celular corpo corpos estendem axônios anteriormente, bifurcam e formam feixes de axônio (também chamados lóbulos). Axônios que formam os lóbulos α dorsalmente saliente e medialmente saliente em lóbulos β expressam Fas2. Criticamente, lóbulos do β do selvagem-tipo moscas encerrar antes da linha média do cérebro. O corpo de forma elipsoide centralmente localizado também pode ser visualizado usando o 4-1 anticorpo. Axônios de lóbulo γ (B) o medialmente saliente do corpo adulto cogumelo Drosophila também expressar Fas2 e pode ser visualizados usando o 4-1 anticorpo. Normalmente, a expressão de Fas2 em axônios de lóbulo γ é menor do que dos lobos α e β. (C) o corpo cogumelo axônios dos cérebros de Nab2 nulo (genótipo: Nab2ex3/Nab2ex3) mis projeto contralaterally e muitas vezes falta lóbulos. Nab2 nulo cérebros foram dissecados, fixo e manchados com o 4-1 anticorpo Visualizar corpo cogumelo α, β e γ lóbulos. Projeções de intensidade máxima Z-pilha seções óticas, bem como individuais focadas na região da linha média são mostradas. Enquanto axônios de lobo selvagem-tipo cogumelo corpo β raramente cruzarem a linha média do cérebro, cérebro nulo Nab2 têm quantidades variáveis de projeção mis do outro lado da linha mediana no hemisfério cerebral contralateral, resultando em lóbulos β “fundidos”. Conforme definido em referências34,35, fusão suave refere-se a < lóbulos β com apenas vários “fios” de axônios, cruzando a linha mediana, fusão moderada refere-se a situações onde neurônios de lobo Fas2 β positivo entre o lóbulo da linha mediana mas β do cérebro largura na linha é reduzida, e fusão completa refere-se a situações onde não há nenhuma redução de espessura de lóbulo β como os lobos cruzam a linha média do cérebro. Desde que o corpo de forma elipsoide também expressa Fas2, seções óticas mostrando a linha média são frequentemente mais útil em Visualizar a fusão do lobo β. Notavelmente, faltando lóbulos são também frequentemente observados (denotada aqui com o asterisco branco). Dados na parte C são usados na quantificação dos fenótipos de cogumelo corpo de referência34, com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5 : MARCM pode ser usado para visualizar os axônios dos neurônios único. (A) análise de mosaico com uma marcador de célula Repressible (MARCM) usos FLP mediada por recombinase mitótica recombinação em sites FRT para criar duas células distintas. Neste exemplo, todas as células contêm uma proteína de GAL4 cogumelo corpo específico em um cromossomo separado. Após a recombinação mitótica durante a divisão celular, uma célula filha (topo) expresse GFP (ou a membrana vinculado CD8-GFP) e contém dois alelos mutantes de um gene de interesse, enquanto a outra célula filha (inferior) herda dois alelos de tipo selvagem (WT) e um transgene expressando a proteína Gal80 usando um promotor de tubulina. Gal80 inibe Gal4, então qualquer células produzindo Gal80 serão não-fluorescente e devem ser heterozigoto ou homozigoto selvagem-tipo. Somente as células que são GFP+ conterá duas cópias do alelo mutante. Observe que apenas um dos vários métodos para a geração de células GFP+ que também contêm dois alelos mutantes de um gene de interesse é mostrado; por favor ver12,,45,56 para outros exemplos. (B) desde que o desenvolvimento dos neurônios do corpo cogumelo começa com os neurônios γ, então α’/ β’ os neurônios e termina com os neurônios α/β, cada classe de neurônio seletivamente pode ser direcionado e visualizado pelo calor chocante em pontos diferentes de tempo no desenvolvimento. Conforme descrito em 12, um choque de calor de 40 min a 37 ° C que ocorre ≤2.5 dias após incubação larval (ALH) especificamente alvejará γ; neurônios, enquanto o choque térmico que ocorre 3.5-4.5 dias ALH (no final estágio larval L3) terá como alvo α’/ β’ os neurônios e um calor que o de choque ccurs entre 5-7 dias ALH (durante o desenvolvimento pupal) terá como alvo os neurônios α/β. (C) axônios individuais do selvagem-tipo foram visualizados usando MARCM. Pupas de tipo selvagem ~ 5-6 dias velho (genótipo: hsFLP, UAS-CD8-GFP; Banheira de FRT82B, UAS-CD8-GFP/FRT82B, > Gal80; OK107-GAL4/+) chocaram calor a 37 ° C por 40 min induzir recombinação mitótica. Cérebros foram dissecados, fixo e manchados com anticorpos reconhecendo GFP (1: 500) e Fas2 (01:20). Cérebros foram então incubados com anticorpos secundários fluorescente etiquetados e visualizados por microscopia confocal. Esses dados de exemplo de um genótipo “controle”, GFP positivas geradas usando MARCM de células são tipo selvagem e em vez de conter os dois alelos demut gene, contêm dois alelos de geneWT . Lóbulos de cogumelo corpo β (visualizados usando anticorpos reconhecendo Fas2) terminar antes de chegar à linha média do cérebro; Neurônios de lóbulo α também estão presentes. Para mostrar mais detalhes, uma ampliada em virtude de um hemisfério do cérebro único é mostrada na linha de fundo de imagens. Parte C foi adaptado com permissão de referência34. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6 : Axônios fotorreceptoras também podem ser visualizados. Cérebros de adultos expressando β-galactosidase em R7 fotorreceptores (à esquerda, usando Rh4-LacZ) ou fotorreceptores R8 (direita, usando Rh6-LacZ) foram dissecados, fixo e incubadas com anticorpos reconhecendo a β-galactosidase ou chaoptin. Cérebros em seguida foram incubados com anticorpos secundários fluorescente etiquetados e visualizados por microscopia confocal de varredura de laser. Única seções óticas são mostradas de cada cérebro. À esquerda, vários axônios de fotorreceptoras R7 (setas) podem ser vistos de terminação a camada mais profunda da M6 da medula (mostrada pela linha pontilhada amarela). À direita, axônios de fotorreceptoras R8 (setas) terminam na camada exterior do M3 da medula (mostrada pela linha pontilhada verde). Desde que o R7 fotorreceptores expressam ou Rh3 ou fotorreceptores Rh4 e R8 expressam Rh5 ou Rh663, todos os fotorreceptores R7 ou R8 não podem ser visualizados usando um único gene do repórter LacZ . Barras de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.