郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

上記の方法は、大人のショウジョウバエの脳のあらゆる領域の信頼性と再現性のある可視化できます。ここできのこ体と光受容器ニューロンに注力しますが、休眠52、時計ニューロン53,54, などの脳領域を視覚化するための同様のメソッドを使用している他の研究と触角葉投射ニューロン55、多くの他の中で。重要なは、MARCM12,47などの技術を使用してこれらの構造の内で個々 のニューロンと同様、両方の全体の脳の構造を視覚化するこの手法を使用できます。図 4図 5図 6は、この郭清術、免疫染色手法を使用して生成することができます大人の脳のきのこ体と光受容器ニューロンからいくつかの異なる種類のデータを表示します。 まず、直接ファシクリン 2 (Fas2) を認識する抗体またはきのこ体神経34で表されるレポーター遺伝子のいずれかを使用してきのこ体形態を視覚化する上記の方法を使用できます。(程度) を図 4は図 4 bα, β を視覚化する抗体を使用ことができます Fas2 に示すように大人のきのこ体の γ 葉ショウジョウバエ脳を。Fas2 は細胞接着蛋白質ニューロン最大に必要なし、α と β の葉23,56,57、高いレベルで表現されることがこれらのキノコの行き届いた信頼できるマーカー体ニューロン。特に、成人の脳の中央部に位置する円形状の楕円体も視覚化できます (図 4A) この抗体を用いたします。 軸索誘導蛋白質の欠陥はしばしば不完全浸透きのこ体突然変異表現型15,34,35を引き起こします。したがって、ほとんどの状況でいくつかのダース脳撮像、解析。たとえば、Nab2 null ハエのきのこ体 β 葉軸索は不適切な脳の正中線を越えます。この「クロス オーバー」または β 葉「融合」の表現型は通常観察 Nab2 null ハエしますが、主に野生型コントロールから欠席し、分類することができます大人の約 80% で、わずかな、中程度、または融合34を完了します。反対側の脳半球に軸索の不適切な対側投影から正中線を越えて β 葉の「融合」の結果します。図 4Cとの詳細な34,35に示すようにわずかな融合は、適度な融合より実質的に接続されている β 葉中「Fas2 肯定的な繊維の薄い鎖」で接続されている β 葉正中線でわずかに減らされた葉の厚さを示します。完全な (または「極端な」) の融合は、完全に接続されており、葉の厚さや Fas2 が正中線で染色の減少を示さない β 葉を指します。きのこ体 β 葉融合の程度を定量化し、 34,35または形態不良の各種類を示す脳の割合を示す表として示すように表示することができます。 MARCM テクニック12,47,48は Fas2 抗体を用いた染色に加えて、きのこ体組織内の個々 の GFP+ニューロンの軸索ガイダンス決定を視覚化するも使用できます。MARCM は、個々 のニューロンまたは GFP (図 5A) でマークされたニューロンのクローンに関連するグループを作成する開発中の分裂の再結合を利用しています。MARCM は、完全にそれ以外のヘテロ フライ内タンパク質を欠いているニューロンの数が少ないを生成する方法を提供します。など、このテクニックは全体的に個体の生存率12,47にも欠かせないタンパク質の軸索ガイダンス機能の分析に特に便利されています。野生型の遺伝的背景に GFP が付いてニューロンを制御する GFP 付けホモ null ニューロンを直接比較できます。さらに、発展途上の幼虫や蛹が熱ショックによる、に応じてきのこ体神経をすることができますさまざまなクラス対象 (図 5B)。 図 5C、例として野生型 (すなわちコントロール) MARCM のクローンを生成する場所にこの技術を使用して生成されるデータの種類の例を示します。図 5CF1 の開発に個々 の GFP+きのこ体ニューロンを生成するには、幼虫は、25 ° C で収容された当初幼虫孵化後約 5-6 日 (ALH) 蛹だった熱 37 ° C で 30 分間に衝撃を与えた、羽化までの 25 ° C に戻ります。いた脳大人孵化後 PTN の解剖、修正、および同時に Fas2 を認識する抗体とインキュベート (1 4 希釈 1:20 PTN で) および GFP (PTN で希釈 1: 500)。脳、二次抗体とインキュベートされ前述のスライドに取付けた。GFP+セルが識別されたレーザ走査共焦点顕微鏡を用いたイメージングし、最大強度突起は、ImageJ を使用して作成されました。図 5Cコントロール GFP+に示すよう α と β の葉で生成されたニューロンは Fas2 と colocalize、2 つのショウジョウバエの脳の半球を分ける正中線を連絡する前に終了します。単一の軸索のプロジェクトは前方、分割と両方にフォーム、α と β の葉の背側、内側をプロジェクトします。いくつかの以前の研究は、自律的拡張、草分け、分岐、または剪定10を含む、axonogenesis の多くの側面の細胞分裂を勉強するのにために必要なある特定の蛋白質かどうかを調査するのにこの手法を使用しています。 11,12,13,14,15,16,17,34。 きのこ体に加えて網膜光受容器ニューロン (R-細胞) の軸索経路決定することができますもを使用して視覚化 (および郭清法 de 上の郭清方法参照48scribed)。ハエ目内の各のシャコが含まれます (図 1) の 3 つのグループに分類することができます 8 の光受容器ニューロンには: R1 R6 の細胞は、脳の視葉; の表面板に軸索のプロジェクトR7 のセルは、髄質; の深層に M6 に軸索をプロジェクトR8 のセルは、髄質19,58の中間の M3 層へ軸索をプロジェクトします。視細胞の各クラスの投影パターンは広く研究されているし、一緒にこれらの神経細胞が正常に使用されてモデルとして軸索ガイダンス19,59に関与するシグナル伝達経路を理解します。重要なは、蛹、大人の免疫染色によって簡単にすべての光受容体の軸索切り裂かれたショウジョウバエ脳で視覚化することまたは chaoptin を認識する抗体を用いた幼虫組織、細胞表面糖タンパク質24,60,61。 GFP または各 R セル型 (R1 R6、R7、R8 細胞) で β-ガラクトシダーゼ レポーター遺伝子が構築されも、視細胞62の各クラスの視覚化に使用することができます。以来、発展途上の視葉の別のレイヤーで R セルの各タイプが終了すると、各セル正しくターゲットを見つけるために必要なシグナル伝達経路の詳細な比較のためこれらのレポーターが許可されています。プロデュース chaoptin ローカリゼーション (これはすべての光受容器ニューロンのマーカーとして使用可能) との組み合わせでこれらのレポーターの遺伝子の 2 つの表現パターンの例を図 6に示します。R7 視細胞を可視化、R7 固有Rhodopsin4 LacZレポーター遺伝子を含んでいる頭脳は解剖され chaoptin と β-ガラクトシダーゼ抗体で染色します。ロドプシン 4R7 細胞63のサブセットの具体的表現 (Rh4)Rh4プロモーターは、したがって、これらのセルだけにレポーター遺伝子発現をドライブに使用できます。予想通り、R7 セル終了 (黄色点線図 6で示されます) 髄質の深層に M6 のです。同様に、脳の β-ガラクトシダーゼ R8 光受容体63で具体的に表現される、解剖されたロドプシン 6 (Rh6) プロモーターからと chaoptin を認識する抗体を用いた immunostained を表現してΒ-ガラクトシダーゼ。図 6に示すように、R8 視細胞の R3 レイヤーで終了、髄質。ここに示されていませんが、 Rh1 LacZは、ラミナの R1 R6 視細胞の終了を視覚化する使用もできます。 図 1:大人ショウジョウバエ脳が機能的に異なるが、相互接続された領域で構成されています。中心部にあるきのこ体と周辺網膜光受容器ニューロンを強調し大人のキイロショウジョウバエの概要 (A) 脳が表示されます。(B) Fas2 抗体によって認識される (葉とも呼ばれます) の大人のきのこ体軸索束の拡大図。ケニヨン細胞と呼ばれるきのこ体固有のニューロン背側に位置する細胞体 (細胞体がこの図から省略) から前方の軸索のプロジェクトと異なる葉構造を形成します。大人の脳では、軸索の単一の内側のバンドルから γ 葉 (赤で示されている) フォーム背 α と単一軸索から内側 β 葉 (青色で表示) のフォームながら、その経路探索プロセス中を分割します。Α ‘/β’ ニューロン開発軸索の葉を部分的に α/β ニューロンのそれらと重複する Fas2 抗体によって認識されない、この図から省略されます。(C) 網膜の神経細胞は、視葉に網膜からの視覚情報を中継で重要です。板や髄質におけるシナプス標的細胞と網膜 (ベージュ) とフォーム接続に位置する細胞体から軸索のプロジェクト。R1 R6 光受容細胞 (赤色で表示) フォーム特定接続光葉の外側の層で細胞とでは、板と呼ばれます。R7 光受容細胞、髄質の M6 層のターゲットを持つ (黄色) シナプスの (緑色で表示) R8 細胞プロジェクト髄質のわずかにより表層の M3 に軸索中。マクミラン出版業者株式会社からの許可によって適応 C パート: 性質の神経科学 (64を参照、著作権 (2011))。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 2:ターゲット遺伝子発現、GAL4/UAS システムを使用できます。組織の特定のパターンに興味 (「遺伝子 X」) 遺伝子を表現するハエを得るためには、ハエはティッシュ特定エンハンサーの制御の下で Gal4 転写活性化因子蛋白を発現する遺伝子と Gal4 DNA を含む遺伝子両方を含める必要があります。(上流活性化シーケンスまたは UAS と呼ばれる) シーケンスを結合遺伝子 X. 通常に隣接し、この組み合わせはそれぞれが 1 つの遺伝子を含む親のハエの交尾と両方を含む F1子孫の選択によって達成されます。結果 F1世代 Gal4 を表現してティッシュ特定の方法で X 遺伝子の転写を活性化する UAS にバインドされます。重要なは、別の UA を含む遺伝子は同じGAL4 「ドライバー」との組み合わせで使用できます。たとえば、記者を生成する UA 遺伝子や RNA 干渉を用いた遺伝子の発現をノックダウン transgene エクスプレス GFP 遺伝子の UAS を含む、きのこ体 (MBs) で Gal4 を発現する遺伝子を結合できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3:蛍光イメージングのための準備で脳をマウントします。(A) 脳は脳の平坦化を防ぐためにブリッジ カバー付け SuperFrost プラス スライドに搭載されています。明確な指の爪のポーランド語での Superfrost プラス荷電のスライドに 2 つの「基本」カバー スリップが守られているとそれらの間のスライドに切り裂かれた脳が置かれます。明確な「ブリッジ」カバー スリップは脳の上に配置、基本カバー スリップに付着します。(B) 一度、指の爪マニキュアは乾燥している、Vectashield はゆっくりと二次抗体の蛍光性を維持するために橋の下戻します。明確な指の爪マニキュアは、「ブリッジ」カバー スリップの上下をシールに使用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4:きのこ体神経軸索は Fas2 を認識する抗体を使用して明確に視覚化できます。(A) 大人のショウジョウバエ脳解剖、固定、そして Fas2 を認識する抗体とインキュベートします。Alexa488 結合ヤギ抗マウス二次抗体を使用して一次抗体も認められ、脳の正荷電のスライド マウントし走査型レーザー共焦点顕微鏡を使ってイメージ化します。Bisymmetrically はあるきのこ体細胞体前方軸索を拡張、分岐、および軸索束 (葉とも呼ばれる) を形成します。Α 葉の背側投影および β 耳たぶの内側に投影を形成する軸索エクスプレス Fas2.批判的に、野生型のハエの β 葉は脳の正中線前に終了します。1 4 を使用して、位置の回転楕円体を視覚化できる抗体。大人のショウジョウバエのきのこ体の内側に投影 (B) γ 葉軸索も Fas2 を表現し、1 の 4 を使用して視覚化することができます抗体。通常、γ 葉軸索における Fas2 の発現は、α と β の葉よりも短いです。Nab2 null 脳の (C) きのこ体軸索 (遺伝子型: Nab2ex3/Nab2ex3) ミス髓プロジェクトし、しばしば葉を欠いています。Nab2 null 脳された解剖、修正、および 1 の 4 で染色抗体きのこ体の α、β、γ の葉を視覚化します。Z スタックの最大強度突起正中領域に焦点を当てただけでなく、個々 の光学セクションが表示されます。野生型のきのこ体 β 葉軸索はほとんど脳の正中線をクロス、Nab2 null 脳は「融合」β 葉で対側の脳半球に正中線を越えて誤投影の様々 な量をあります。軽度の融合を指す参照34,35で定義されている < 正中線、適度な融合を交差軸索のだけいくつか「鎖」で β 葉と Fas2 肯定的な β 葉ニューロンが脳の正中線が β の葉をクロスの状況は、正中線で幅を狭くと、および完全な融合と状況は、葉は脳の正中線を横切るように β 葉厚低減がないです。以来、回転楕円体は、Fas2 の表現も正中線を示す光学セクションが多い β 葉融合の可視化に役立ちます。特に、不足している葉が (白のアスタリスクの付いたここで表されます) もよく観察されます。パーツ C のデータは参照34許可を得てからきのこ体の表現型の定量化であります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 5: 単一ニューロンの軸索を視覚化するために MARCM を使用できます。(A) 2 つの娘細胞を作成する抑制型セル マーカー (MARCM) 使用 FLP リコンビナーゼを介した細胞分裂組換え FRT サイトでモザイク解析。この例では、すべてのセルには別の染色体上のきのこ体固有 GAL4 タンパク質が含まれています。次の細胞分裂時に分裂の再結合、1 つの娘細胞 (top) は GFP を表現 (または膜バインド CD8 GFP) と他の娘細胞 (下) 2 つの野生型 (WT) 対立遺伝子を継承しながら、興味の遺伝子の 2 つの突然変異体の対立遺伝子が含まれていますチューブリン プロモーターを用いた Gal80 タンパク質を表現する遺伝子。Gal80 は、Gal80 生産セル非蛍光性になります、ヘテロ接合体、ホモ接合体野生型である必要がありますので、Gal4 を抑制します。GFP+をされているセルだけ突然変異体の対立遺伝子の 2 つのコピーが含まれます。興味の遺伝子の 2 つの突然変異体の対立遺伝子を含む GFP+細胞を生成するためのいくつかのメソッドの 1 つだけが表示されることに注意してください。12,45,56他の例を参照してください。(B) 以来、きのこ体ニューロンの開発から始まる γ ニューロン、α’/β’ ニューロンと α/β ニューロン、ニューロンの各クラスで終わる選択的にターゲットおよび視覚化できる異なる発達時点で衝撃的な辛さで。≤2.5 日後に幼虫の孵化 (ALH) を γ 標的; (L3 幼虫) の 3.5 から 4.5 日 ALH を発生するヒート ショック中のニューロンに発生する 37 ° C で 40 分のヒート ショック、α を対象12に従って、’/β’ ニューロンとその o を衝撃熱5-7 日 ALH (蛹の発育) 中間 ccurs α/β ニューロン対象となります。(C) 個々 の野生型の軸索は、MARCM を使用して視覚化されました。野生型 5 〜 6 日間の古い蛹 (遺伝子型: hsFLP、UAS CD8 GFP。FRT82B、UAS CD8 GFP/FRT82B、浴槽 > Gal80;OK107-GAL4/+) 熱は分裂の再結合を誘発する 40 分の 37 ° C でショックを受けた。脳解剖、固定、そして GFP (1: 500) および Fas2 を認識する抗体で染色 (1:20)。脳が蛍光に分類された二次抗体とインキュベートし、共焦点顕微鏡による可視化します。このサンプル データは、「コントロール」の遺伝子型、肯定的な MARCM を使用して生成された細胞が野生型 GFP からと 2 つの遺伝子mutの対立遺伝子を含むの代わりに、2 つの遺伝子WT対立遺伝子を含まれてください。きのこ体 β 葉 (Fas2 を認識する抗体を用いて可視化する) を脳の正中線に到達する前に終了します。Α 葉ニューロンもあります。詳細を表示するには、単一の脳半球で拡大されるが、イメージの一番下の行に表示されます。C の部分は、参照34から許可を合わせられました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 6: 視細胞軸索を視覚化もできます。大人脳 R7 光受容体 (左、 Rh4 LacZを使用して) または R8 の光受容体の発現する β-ガラクトシダーゼ (右、 Rh6 LacZを使用して) 解剖、修正、および β-ガラクトシダーゼまたは chaoptin を認識する抗体とインキュベートしました。脳が蛍光に分類された二次抗体とインキュベートし、共焦点レーザー顕微鏡で可視化しました。光学セクションの一つは、それぞれの脳から示しています。左側に、(黄色の点線で表示) 髄質の深層に M6 終了をいくつか R7 視細胞軸索 (矢印) に見ることができます。右側に、R8 視細胞軸索 (矢印) は (緑の点線で示す) 延髄の外側の M3 層で終了します。R7 視細胞エクスプレスか Rh3、Rh4、R8 の視細胞エクスプレス Rh5 または Rh663、単一LacZレポーター遺伝子を用いたすべての R7、R8 の視細胞を可視化ことはできません。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。