JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Published: November 06, 2017
doi:
10.3791/56174
, ,
1Program in Neuroscience,The College of Wooster, 2Department of Biology,The College of Wooster, 3Program in Biochemistry, Cellular, and Molecular Biology,The College of Wooster

Summary

يصف هذا البروتوكول بالتشريح وإيمونوستينينج من الكبار melanogaster المورفولوجية أنسجة الدماغ. على وجه التحديد، يبرز هذا البروتوكول استعمال المورفولوجية فطر الجسم وعلم الخلايا العصبية كمثال على مجموعات فرعية الخلايا العصبية التي يمكن استخدامها بدقة لكشف المبادئ العامة التي تقوم عليها العديد من جوانب التنمية العصبية.

Abstract

ويشمل تطوير الجهاز العصبي سلسلة متتابعة من الأحداث التي ينسقها العديد من مسارات الإشارات والشبكات التنظيمية. كثير من البروتينات المشاركة في هذه المسارات هي تقحم المصانة بين الثدييات وحقيقيات النوى الأخرى، مثل ذبابة الفاكهة melanogaster المورفولوجية، مما يوحي بوجود مبادئ تنظيم مماثلة أثناء تطوير هذه الكائنات الحية. الأهم من ذلك، المورفولوجية وقد استخدمت على نطاق واسع لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية التي تنظم العمليات المطلوبة في الثدييات بما في ذلك الخلايا والتمايز، والتوجيه محواري، سينابتوجينيسيس. الذباب أيضا قد استخدمت بنجاح نموذج مجموعة متنوعة من الأمراض العصبية النمائية البشرية. هنا يمكننا وصف بروتوكول ميكروديسيكشن خطوة بخطوة والتثبيت، وتعريب إيمونوفلوريسسينت للبروتينات داخل المخ المورفولوجية الكبار. هذا البروتوكول يركز على اثنين من السكان مثال الخلايا العصبية والخلايا العصبية جسم الفطر و photoreceptors الشبكية، ويتضمن الخطوات الاختيارية لتتبع الخلايا العصبية الجسم فطر الفردية باستخدام “تحليل فسيفساء” مع تقنية علامة خلية ريبريسيبلي (ماركم). وترد بيانات المثال من العقول متحولة والبرية من نوع جنبا إلى جنب مع وصفاً موجزاً لمعايير التهديف لعيوب الإرشاد محواري. وبينما هذا البروتوكول يبرز اثنين أجسام الراسخة للتحقيق مورفولوجية فطر الجسم ويمكن أيضا أن تكون الخلايا العصبية مستقبله ومناطق الدماغ المورفولوجية الأخرى وإضفاء الطابع المحلي على البروتينات داخل مناطق الدماغ الأخرى التحقيق في استخدام هذا البروتوكول.

Introduction

على الرغم من أن النظام العصبي المورفولوجية أقل من البشر والقوارض، تعقيدها نموذجا قوية، ودود فهم أفضل لنظرائه الفقاريات. في كثير من الحالات، ترميز الجينوم من الفقاريات والذباب مشابهة جداً من البروتينات التي تملي الآليات لتطوير الجهاز العصبي. والواقع أن العديد من الجينات المطلوبة لتنمية الخلايا العصبية في الفقاريات أورثولوجس في الذباب، بما في ذلك تلك التي أشركت في الممرات مما يشير إلى أن الزخرفة التحكم والخلايا والتوجيه محواري1،2،3 ،،من45. على سبيل المثال، نيترين يجند المطلوبة لتوجيه محواري في الثدييات و melanogaster دال-6،،من78. بينما نيترين كانت معزولة أصلاً من أنسجة الدماغ الجنينية فرخ6، قد كشفت الدراسات اللاحقة أن نيترين دوراً حفظت أثناء تطوير النظام العصبي المركزي (CNS) الجنينية في المورفولوجية8. استخدمت دراسات أخرى الشاشات الوراثية الجنينية المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي لتحديد يغاندس المصانة والمستقبلات المطلوبة اﻻستطﻻعية في المورفولوجية والفقريات9.

بينما يطير الجنينية الجهاز العصبي المركزي قد استخدمت على نطاق واسع في الماضي لتحديد يغاندس والمستقبلات والبروتينات الإشارات داخل الخلايا المطلوبة لتوجيه محواري،من89، الأعمال الأخيرة حقق في الطرق التي العديد من هذه البروتينات أيضا التحكم في القرارات اﻻستطﻻعية خلال المراحل الأخيرة من التنمية. على وجه التحديد، قدمت التحقيق هيئة فطر (ميغابايت) ومستقبله الشبكية العصبية التنمية (الشكل 1) نظرة ثاقبة الآليات اﻻستطﻻعية عنصر التحكم هذا وتشكيل المشبك وتشذيب إكسون وجوانب عديدة أخرى من الخلايا العصبية التنمية10،11،،من1213،14،15،،من1617. علم الخلايا العصبية الاتصال الشبكية يطير إلى مناطق الدماغ الكبار تسمى الصفيحة ولب، وهي حاسمة بالنسبة لترحيل المعلومات البصرية إلى المخ (استعرضها18،19)، بينما فطر الجسم من الخلايا العصبية مركزياً يقع في الدماغ يطير ومطلوبة من أجل التعلم والذاكرة20،21. علم الخلايا العصبية والخلايا العصبية الذاتية الهيئات الفطر، وتسمى الخلايا كينيون، الاستفادة من آليات تقحم حفظت إرشادات محواري ديفوسيبلي وتعتمد على الاتصال للبحث عن أهدافها بعد متشابك. بالإضافة إلى كونها مرئية في الذباب الكبار، مستقبله والخلايا العصبية ميغابايت يمكن أيضا مباشرة تصور في اليرقات والخوادر مع الأجسام المضادة أو مراسل الجينات22،23،،من2425. عزز القدرة على تصور هاتين المجموعتين من الخلايا العصبية في نقاط زمنية مختلفة التنموية بسهولة استخدامها كنماذج رائعة للعديد من جوانب التنمية العصبية.

وبالإضافة إلى تستخدم كنموذج لفهم آليات تطوير الجهاز العصبي الطبيعي، وقد أثبتت الدراسات الأخيرة أن الذباب ويمكن أيضا بمثابة نماذج دقيقة لمجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان، بما في ذلك متلازمة X الهش (FXS)26 ، الإعاقة الفكرية (ID)27،،من2829،،من3031، والبعض الآخر32. على سبيل المثال، دراسة وظيفة ZC3H14 الجزيئية وجينات مؤخرا مرتبطة بالإعاقة الفكرية البشرية، أنشأنا نموذج يطير لمعرف باستخدام اليل فارغة ذبابة أورثولوج ZC3H14، تسمى Nab230. الذباب تفتقر إلى Nab2 ضعف الذاكرة الشديد وتمتد ذيول poly(A)، لخص ما لوحظ في المرضى الإنسان أو المريض المستمدة خلية خطوط33،34. الأهم من ذلك، عرض الذباب تفتقر إلى Nab2 أيضا عيوب مورفولوجية الدماغ الشديدة في تلك الهيئات فطر الكبار34، مماثلة لما لوحظ في الذباب تفتقر إلى الجين متلازمة FXS، FMR135. وهكذا، يمكن الذباب بمثابة كائن حي نموذجا هاما لدراسة كل من نمو الدماغ الطبيعي والأمراض التي تخل بذلك.

وأخيراً، جعل إمكانية الحصول على أساليب إنتاجية عالية لرصد السلوك، جنبا إلى جنب مع مجموعة واسعة من الأدوات الجينية المتاحة، المورفولوجية كائن نموذج المفضل لتحديد مناطق الدماغ التي تتحكم في سلوكيات معقدة، مثل التعلم والذاكرة والنوم، والخطوبة، والعطش وغيرها36،37،،من3839. واحد أداة مفيدة بشكل خاص في مركز “مربع الأدوات الوراثة يطير في” هو نظام GAL4/UAS (الشكل 2). يستخدم هذا النظام40،41 التعبير الأنسجة محددة المنشط النسخي Gal4 لزيادة التعبير عن الجينات أو المتسلسلات في اتجاه مجرى النهر من المنبع تنشيط تسلسل (UAS). إدخال تعديلات على هذا النظام قد سمح الباحثون على سبيل المثال، التحكم بدقة في استثارة الخلايا العصبية المحددة42،43أو أوفيريكسبريس أو تدق لأسفل جينات محددة لمصلحة44، 45، وتحليل ديناميات الكالسيوم في الوقت الحقيقي في فيفو46، والتعبير عن الجينات مراسل لوضع علامة الأنساب العصبية41. تركيبة النظام GAL4/UAS مع جزئ الانقسامية يسمح أيضا لإنشاء “تحليل فسيفساء” مع12،نظام علامة خلية ريبريسيبلي (ماركم)47. ماركم قد استخدمت على نطاق واسع في تتبع الخلايا العصبية وحيدة لتحديد مكونات إرسال الإشارات الخلوية اللازمة لتوجيه محواري12،47. على الرغم من أن هذه وغيرها من تقنيات قدمت عددا من الأفكار القيمة بشأن الآليات الخلوية اللازمة لوظيفة الجهاز العصبي، ومعظم تتطلب أولاً تشريح الدماغ المورفولوجية ؛ إزالة حذراً من الدماغ مطلوب للاحتفاظ بأنماط الدماغ الصحيح مورفولوجيا والاتصال بين مناطق الدماغ. يستخدم البروتوكول التالي الفطر العصبية الجسم ومستقبلهمثال السكان الخلايا العصبية كما أنه يرشدك خلال التشريح والعقول المورفولوجية إيمونوفلوريسسينت تلوين للكبار.

Protocol

1-علم الوراثة melanogaster المورفولوجية والإجراءات الاختيارية من صدمة الحرارة عبروا من الذباب مرة واحدة وقد دبرت ذرية F1، والحصول على الإناث أو الذكور من النمط الوراثي المناسب. تبعاً لمنطقة الدماغ قيد التحقيق، ينبغي تجميع يوميا الذباب ومفصولة بالجنس حتى أنه يمكن تمييز أنماط تعتمد على العمر و/أو ديمبرافيك جنسياً من اتصال الدماغ بسهولة أكبر. ملاحظة: اختياري: إذا الذباب تستخدم “تحليل فسيفساء” مع 12 ، تحليل علامة خلية ريبريسيبلي (ماركم) 47، والأجنة، واليرقات، أو ينبغي أن يكون الخوادر الحرارة صدمة في 37 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة إلى حمل جزئ الانقسامية. من أجل استهداف مناطق محددة من الهيئات فطر لتحليل ماركم، ينبغي أن توقيت صدمة الحرارة وفقا لجدول زمني يحدده 12 والمبينة في الشكل 5 ب. في حالة استخدام ماركم للتحقيق في مناطق الدماغ خلاف الهيئات الفطر، ينبغي إجراء تجارب رائدة لتحديد المرحلة المثلى لتكون صدمة الحرارة. بينما تتم كتابة الخطوات التالية فيما يتعلق بالذباب اكلوسيد، فرات البالغين يمكن أن تشريح أيضا استخدام هذه الخطوات مرة واحدة تم إزالة القضية الخوادر. 2. إعداد محطة تشريح موقف ستيريوميكروسكوبي والضوء المصدر مع إرفاق جوسينيكس الألياف البصرية في benchtop كبيرة. لتشجيع حركات اليد المطرد والحد من ناحية " يهز " بينما تشريح، فمن الضروري أن تتوفر مساحة كافية في بقية اليد والذراع حول المجهر. التأكد من أن هناك ما يقرب من 8-10 بوصة على جانبي المجهر و 4-6 بوصات بين الحافة من مقاعد البدلاء وقاعدة المجهر. الآبار التعبئة 2 أو 3 من الزجاج طبق 9-جيدا أو 3-جيدا مع 1.0 مل PTN المخزن المؤقت (0.1 M فوسفات الصوديوم العازلة الرقم الهيدروجيني 7.2، 0.1% النطاق الفاعل، انظر “الجدول المواد” لمكونات المخزن المؤقت كاملة) ووضع بالقرب من محطة تشريح على الجليد. سيتم نقلها إلى هذا الطبق حديثا تشريح أدمغة وتخزينها حتى خطوة التثبيت. ملاحظة: إذا كان مطلوباً تصوير حية، تشريح المخزن المؤقت ينبغي أن يكون 1 × العازلة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو HL3 48. إذا كان التعريب البروتين داخل الخلايا المطلوبة، يمكن أيضا استخدام برنامج تلفزيوني كبديل مؤقت للتشريح والتثبيت. بعد التثبيت، permeabilization أغشية الخلايا ينبغي ثم إجراء استخدام يغسل PTN تحتوي على المنظفات النطاق 0.1% أو 0.3%- إذا تم استخدام برنامج تلفزيوني لتشريح والتثبيت، نصائح ماصة ينبغي مشطوف مرة واحدة على الأقل مع عازلة التي تحتوي على مواد التنظيف (مثل PTN) لمنع العقول من الالتصاق بنصائح ماصة بلاستيكية أثناء النقل إلى أنابيب ميكروسينتريفوجي. استخدام الزجاج الفارغة 35 ملم أو البلاستيك طبق بيتري، بناء طبق تشريح التي تحتوي على سيليكون الاستومر. بإيجاز، خلط المكونات الاستومر وفقا للشركة المصنعة ' الاتجاهات s، تصب في أطباق 35 ملم، والسماح لها بلمرة بين عشية وضحاها على سطح مستو. ينبغي استخدام الاستومر تحتوي على أطباق تشريح لحماية نصائح الجميلة من تشريح الملقط، التي يمكن أن تتلف بسهولة إذا تم إجراء الاتصال بين الملقط وسطح أكثر صعوبة، مثل صحن زجاج. ونحن أيضا بانتظام شراء الأطباق المتاحة تجارياً سيليكون مغلفة من تجار التجزئة على الإنترنت. لزيادة التباين أثناء تشريح، سيليكون الاستومر تشريح الأطباق التي تحتوي على الفحم المعطل (والأسود وهكذا الملونة) مفيدة بشكل خاص. 3. إجراء تشريح الدماغ الكبار أنيسثيتيزي يوم 3-5 الكبار القديمة melanogaster دال- مع CO 2 أو باستخدام الثلج. إذا كان استخدام الثلج، الذباب مكان يمنع القنينة التي تحتوي على الذباب رأسا على عقب (نهاية التوصيل إلى أسفل) إلى دلو الجليد لدقيقة ~ 5 وضع القنينة في الجليد رأسا على عقب من تصبح استقرت في المواد الغذائية. بمجرد قد تم تخديره من الذباب، وضع الذباب في جلسة لوح أو طبق بيتري معدنية باردة في الجليد أو على CO 2 انبعاث لوح يطير. إذا كان تشريح أدمغة لتحليل نيوروديجينيريشن، كما يمكن استخدام الذباب كبار السن- ضع كمية صغيرة (150-200 ميليلتر) من PTN في وسط صحن تشريح استخدام ماصة نقل أو ماصة p200 لإنشاء " فقاعة " من PTN. ضع طبق التشريح تحت ستيريوميكروسكوبي وضبط الإضاءة والتركيز بحيث الفقاعة PTN تملأ مجال الرؤية وهو المضاءة بشكل موحد. التعامل مع الذباب بحيث تكون " في البطن حتى " (أي، الجانب البطني لأعلى) بينما الكذب على المعدن أو لوح 2 CO. استخدام زوج واحد من الملقط #5، فهم في البطن ليطير إلى أن تشريح، وتماماً إبقاء عقد ذبابة، تغرق في PTN في طبق التشريح. ملاحظة: لما تبقى البروتوكول، جميع الخطوات ينبغي إجراء بينما يتم غمر الرأس في PTN- استخدام زوج ثاني من الملقط #5، فهم قاعدة ململه يطير وسحب اثنين من الأزواج من الملقط بعيداً فصل رأسه يطير من الجسم. تجاهل في البطن والصدر. أثناء هذه الخطوة، من الأهمية بمكان أن الرأس لا صدر ويسمح لتطفو على السطح PTN. عندما يتحرك الرأس، يمكن أن يكون من الصعب جداً فهم مرة أخرى دون سحق الدماغ. ملاحظة: باستخدام هذا الأسلوب، يتم قطع الاتصالات بين الدماغ والحبل العصبي البطني. وإذا لزم اتصالات سليمة بين هاتين المنطقتين الجهاز العصبي المركزي، بروتوكولا تشريح بديلة، مثل 50 من 49 ،، ينبغي أن يتبع. إذا كان يفصل ململه من رأسه يطير قبل أن تتم إزالة الرأس، ستكون هناك حفرة حيث كان ململه. وفي هذه الحالة، فهم رأسه يطير على حافة حفرة القرب من عين واحدة. قم بإزالة الرأس باستخدام كمية معتدلة من القوة حين سحب اثنين من الأزواج من الملقط بعيداً عن بعضها البعض. في بعض الأحيان، عندما يتم إزالة الرأس من الجسم، بقايا الحبل العصب القناة الهضمية و/أو البطني يعلق في الرأس وينبغي إزالتها قبل متابعة التشريح. بينما يمسك زوج واحد من الملقط ململه، ينبغي فهم الزوج الثاني الآنسي حافة العين يطير الحق. ببطء، سحب الملقط بعيداً عن بعضها البعض. وينبغي تنفيذ هذه الخطوة مع كمية صغيرة من القوة الجانبية المطرد. كما الملقط تتحرك ببطء وبصرف النظر عن بعضها البعض، ينبغي سحب بعيداً عن الرأس ململه وخلق ثقب مركزي في بشرة الرأس. تجاهل ململه مع الزوج الأول من الملقط دون الإفراج عن الجزء الآنسي من العين اليمنى من الزوج الثاني- ملاحظة: الكبار melanogaster دال- الدماغ في والذيلية (أي الخلفي/خلفي) من منطقة الرأس يطير. ومن ثم، ينبغي تجنب استيعاب تلك المنطقة من الرأس. ومن الناحية المثالية، إلا روسترال (أي، الجبهة) ينبغي أن يكون جزء من الرأس قرب الشبكية الآنسي اغتنامها مباشرة قبل الملقط. وينبغي الآن مرئية من خلال ثقب مركزي في بشرة الدماغ والقصبة الهوائية المرتبطة بها. في هذا الوقت، يمكن إزالة أي المواضيع مفتول العضلات البيضاء من القصبة الهوائية بارزة من الحفرة وتجاهل. مع الزوج الثاني من الملقط، فهم على حافة الآنسي شبكية العين اليسرى (على حافة الحفرة المركزية في بشرة الرأس). لإزالة شبكية العين وبشرة المرتبطة بها، ببطء سحب الملقط بعيداً عن بعضها البعض بزاوية 180 درجة. كما الشبكية تنأى عن الفص البصري الأساسي، يجب أن تشعر بانخفاض طفيف في التوتر. السير ببطء منع تمزق الفص البصري- ملاحظة: يفصل الملقط بسرعة كبيرة جداً من خلال هذه الخطوة قد يؤدي تمزق thالفص البصري ه أو تعطيل لهياكل الجسم الفطر. في بعض الأحيان، سيتم إزالة أهاب ولكن القطع الشبكية ستظل متمسكة بالفص البصري. إذا كان التصوير الهيئات بالفطر، وليس تماما اللازمة لإزالة الشبكية كامل. ومع ذلك، قد تتطلب تحليل المناطق الدماغ الأخرى (مثل تعصيب العصبية الشبكية من فصوص الدماغ البصرية) شبكية العين المراد إزالتها تماما كما وصفها 48 ، 51- ملاحظة: يتم فصل الشبكية ببطء من الفص البصري الكامنة في الدماغ، الفص البصري ينبغي أن يمكن ملاحظتها كهيكل أبيض كامد مغطاة بالقصبة الهوائية البيضاء، مفتول العضلات. متى أزيل شبكية واحدة، فإنه يمكن تجاهل. عند تحليل اﻻستطﻻعية من الخلايا العصبية الشبكية، ينبغي إيلاء عناية خاصة أثناء هذه الخطوة لمنع الأضرار بالفص البصري. بروتوكول إضافي ركز على تشريح وتصوير مباشر من الخلايا العصبية مستقبله هو أيضا متاح 48- الآن، بعناية إزالة جزء كبير من القصبة الهوائية واضحة قدر الإمكان. قد تحتوي بالفعل على القصبة الهوائية أو في وقت لاحق ملء مع الهواء، مما تسبب في العقول تعويم، ويحتمل أن يتم فقدان أثناء الخطوات اللاحقة إيمونوستينينج. لإزالة القصبة الهوائية، اختيار إيقاف الدماغ باستخدام زوج حادة جداً من الملقط #5- إزالة الشبكية المتبقية وبشرة المحيطة باستخدام كلا أزواج من الملقط لفهم منطقة وسطى يطير شبكية العين اليسرى. عناية تمزق الشبكية في نصف إزالة أجزاء من الشبكية وبشرة. وفي بعض الحالات، إزالة أهاب المتبقية دون سحق الدماغ يثبت تنطوي على تحديات خاصة. وفي هذه الحالات، وقد وجدنا أن خيوط المتبقي من الحبل البطني العصب يمكن بدلاً من ذلك اغتنامها بزوج واحد من الملقط بينما يستخدم الزوج الأخرى من الملقط لإزالة آخر بشرة بعناية. باستخدام ماصة p200، نقل تشريح أدمغة إلى بئر واحدة للطبق 9-3 جيدا أو التي تحتوي على PTN. ينبغي أن تجمع معا في نفس جيدا العقول من نفس النمط الوراثي وأبقى على الجليد. ينبغي أن تكون ثابتة أنسجة المخ خلال ساعة واحدة للتشريح. يمكن إصلاحها في دفعات صغيرة العقول والمجمعة إذا كان مطلوب عدد أكبر من العقول. في معظم الحالات، يمكن الباحثين ذوي خبرة عادة تشريح دماغ وتحويلها إلى طبق جمع الزجاج في حوالي 3-5 دقيقة 4. التثبيت والإجراء تلطيخ إيمونوفلوريسسينت باستخدام ماصة p200، نقل تشريح أدمغة من الطبق 9-جيدا لأنبوب ميكروسينتريفوجي 0.5 مل مليئة 0.5 مل من 4% بارافورمالدهيد المخفف في PTN. ويمكن الجمع بين العقول على الأقل 10-15 من نفس النمط الوراثي في أنبوب ميكروسينتريفوجي واحد. يتم إكمال كافة الخطوات المتبقية (حتى متصاعدة العقول على الشرائح) في أنابيب ميكروسينتريفوجي 0.5 مل. تنبيه: ينبغي التعامل معها بارافورمالدهيد (PFA) في غطاء دخان. وينبغي حفظ PFA النفايات والتخلص منها بشكل صحيح. بارافورمالدهيد 20% تم شراؤها في امبولات زجاجية يمكن الكوتيد في أنابيب ميكروسينتريفوجي والمخزنة في-20 درجة مئوية إلى حين الحاجة. داخل غطاء دخان، احتضان العقول في بارافورمالدهيد 4% لمدة 20 دقيقة مع سرعة بطيئة التأرجح في درجة حرارة الغرفة- بعد التثبيت، السماح للعقول تسوية إلى الجزء السفلي من أنبوب ميكروسينتريفوجي بالجاذبية. ملاحظة: في بعض الأحيان، قد عصا العقول إلى جانب أنبوب ميكروسينتريفوجي. في حالة حدوث ذلك، يكون من المفيد عادة أفقياً تدوير الأنبوب بين السبابة والإبهام أو اضغط بلطف جداً الأنبوب على مقاعد البدلاء لتعزيز غرق العقول. إزالة مثبت باستخدام p1000 “الماصة؛” ونفذ اثنان " سريعة " يغسل مع 500 ميليلتر من PTN، السماح للعقول تسوية إلى الجزء السفلي من أنبوب ميكروسينتريفوجي بين يغسل. خلال هذه يغسل سريعة، حالما استقر جميع العقول بالجاذبية إلى الجزء السفلي من أنبوب ميكروسينتريفوجي، PTN يمكن فورا تبادل جديد من المخزن المؤقت؛ أي وقت من الأوقات أغسل إضافية مطلوب. ملاحظة: عادة، ترك المخزن المؤقت الإضافي في الأنبوب الأفضل للمخاطرة بإزالة الدماغ. دراسة متأنية لنصيحة ماصة غالباً ما مطلوب لضمان أن لا العقول قد أزيلت عن طريق الخطأ من الأنبوب. إذا كانت العقول الصدفة بيبيتيد في التلميح، الاستغناء عن هذه العودة في أنبوب ميكروسينتريفوجي والانتظار للعقل المدبر لتسوية، وثم متابعة إزالة أي PTN الإضافية التي ما زالت- بعد الغسيل السريع آخر، استخدم ماصة p1000 لتنفيذ ثلاثة " طويلة " يغسل: إضافة 500 ميليلتر من PTN والغسيل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الكرسي الهزاز/نوتاتور. كل المستقبل " طويلة " ينبغي أن يغسل لمدة 20 دقيقة- ملاحظة: بعد هذه يغسل، ثابتة العقول قد تكون مخزنة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في PTN- إزالة الغسيل آخر باستخدام ماصة p1000 واحتضان العقول على الروك أو نوتاتور في درجة حرارة الغرفة في 0.5 مل من عرقلة الحل [PTN + 5% مصل الماعز العادي (خ ع و)] على الأقل 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة- سيتم استخدام الأجسام المضادة الثانوية الماعز في الخطوات اللاحقة من البروتوكول. إذا كان سيتم استخدام الأجسام المضادة الثانوية من نوع آخر، المصل العادي من هذه الأنواع (بدلاً من خ ع و) ينبغي أن تستخدم في الحلول التي تسد وجسم. باستخدام ماصة p1000، إزالة الحل حظر وإضافة جسم الابتدائي المخفف في PTN (PTN + 5% خ ع + جسم الابتدائي المخفف). عند استخدام جسم الأولية لأول مرة، ينبغي تحديد تمييع الأمثل لتلك الأجسام المضادة تجريبيا. ملاحظة: لتصور الجسم فطر الخلايا العصبية، إذ تسلم Fas2 الأجسام المضادة تستخدم عادة. هذه الأجسام المضادة المتاحة من البنك هيبريدوما الدراسات الإنمائية (دشب) كجسم 1 4 وينبغي أن تكون مخففة 01:20 في PTN + 5% خ ع. ملاحظة: لتصور الخلايا العصبية مستقبله، إذ تسلم تشاوبتين الأجسام المضادة تستخدم عادة. أضداد تشاوبتين المتوفرة من دشب كجسم 24B10 وينبغي أن تكون مخففة 01:20 في PTN + 5% خ ع. ملاحظة: عملية التثبيت يزيل عادة الأسفار من البروتين الفلورسنت مثل البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل). لذلك، عند استخدام ماركم لتحليل محواري التوجيه الفردي ميغابايت الخلايا العصبية، استخدام جسم مضاد الاعتراف بالتجارة والنقل- احتضان العقول في حل جسم الأولية على الروك/نوتاتور 2-3 ليالي 4 ° C. بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الأساسي، تسمح للعقول تسوية إلى الجزء السفلي من أنبوب ميكروسينتريفوجي ثم قم بإزالة الحل جسم الأولية. نفذ باستخدام ماصة p1000، 2 " سريعة " يغسل و 3 " طويلة " 20 دقيقة يغسل مع 0.5 مل PTN كما هو موضح أعلاه في خطوات 4.4 و 4.5، مما يسمح بعناية العقول إلى تسوية بالجاذبية إلى الجزء السفلي من أنبوب ميكروسينتريفوجي بين كل واشنطن العقول إينكوباتي عن 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة مع الأجسام المضادة المناسبة الثانوي المسمى فلوريسسينتلي. يتم عادة تضعف الأجسام المضادة الثانوية في 0.5 مل من PTN + 5% خ ع بتركيز 1: 200- ملاحظة: حالما تتم إضافة الأجسام المضادة الثانوية الفلورسنت، العقول يجب أن تبقى في الظلام لما تبقى التجربة- ملاحظة: في حالة متبقية بروتينات فلورية خضراء الأسفار ما زالت، عند إجراء تحليل ماركم فإنه من المستحسن استخدام جسم ثانوي المسمى مع فلوروفوري وجود موجات الإثارة/الانبعاثات مماثلة كالتجارة والنقل (مثلاً، فلوروسسين إيسوثيوسياناتي (فيتك) أو Alexa488)- عقب حضانة جسم الثانوية، السماح للعقول تسوية إلى الجزء السفلي من أنبوب ميكروسينتريفوجي وإزالة الحل جسم الثانوية- 2 أداء " سريعة " يغسل و 3 " طويلة " 20 دقيقة يغسل مع 0.5 مل PTN كما هو موضح أعلاه في خطوات 4.4 و 4.5، مما يسمح بعناية العقول إلى تسوية إلى الجزء السفلي من أنبوب ميكروسينتريفوجي بين كل واشنطن عقب الثالث " طويلة " يغسل 20 دقيقة، واستخدام ماصة p200 لإزالة المخزن المؤقت قدر الإمكان. 75 إضافة ميليلتر من الفلورسنت تتلاشى لمكافحة تصاعد المتوسطة للعقول. ماصة العقول والمتوسطة المتصاعدة في تلميح ماصة مرة واحدة لخلط. لا عكس الأنبوب منذ العقول قد تصبح عالقاً في كاب أو الجانبين من أنبوب ميكروسينتريفوجي. ملاحظة: عقب تعليق العقول في تصاعد المتوسطة، أنابيب قد تكون مغلفة برقائق الألومنيوم بطء تبريد فلوروفوري والمخزنة في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. إذا كان ضروريا، العقول يمكن تخزينها لعدة أيام عند 4 درجة مئوية، ولكن ينبغي من الناحية المثالية شنت على الشرائح بأسرع. 5. تركيب أدمغة الكبار melanogaster دال على شرائح المجهر وتصوير بناء " جسر " الشريحة. ضع اثنين " قاعدة " كوفيرسليبس تقريبا 1 سم عن بعضها البعض على شريحة مشحونة بشكل إيجابي. تأكد من أن الجانب مشحونة بشكل إيجابي للشريحة هو مواجهة. الالتزام كوفيرسليبس للشريحة مع تلميع الأظافر كما هو موضح في الشكل 3 ألف. أنها عادة ما تكون مفيدة لختم الحواف الخارجية الثلاث لكل كشف غطاء قاعدة مع الأظافر البولندية لضمان تركيب وسائط الفتيل لا تحت هذه كشوف تغطية قاعدة. واسمحوا تلميع الأظافر يجف تماما (10-15 دقيقة) قبل المتابعة. ضع الشريحة تحت ستيريوميكروسكوبي و “الماصة؛” الحل الإعلام تصاعد يحتوي على تشريح أدمغة في المسافة بين كوفيرسليبس اثنين. لتوفير أكثر النقيض من ذلك، فإنه من المفيد المناورة الأضواء gooseneck بحيث تكون متوازية مع أعلى مقاعد البدلاء. إزالة تركيب وسائط إضافية من الشريحة باستخدام ماصة، مع الحرص على عدم “الماصة؛” العقول خارج الشريحة. الفتيل تصاعد إضافية بعيداً وسائل الإعلام. سيسمح هذا على العقول تكون في وضع أكثر دقة أثناء الخطوة التالية- استخدام زوج من الملقط وستيريوميكروسكوبي، ضع العقول على الشريحة في نمط شبكة مع الفصوص باللوامس تواجه المكياج. ضع بكشف الغطاء (" جسر ") على العقول ( الشكل 3 أ). استخدام ظفر البولندية لختم جانبي بكشف غطاء الجسر حيث يمكنهم الاتصال " قاعدة " كشوف الغطاء. استخدام ماصة p200، ببطء وملء تجويف مركز تحت الجسر مع تصاعد جديد وسائط الإعلام ( الشكل 3 ب). ضع قطره واحدة في كل مرة على حافة ساترة مركز مفتوح، والسماح لوسائل الإعلام المتزايدة الفتيل تحت ساترة جسر مركز. تستمر حتى يتم تعبئة تجويف كامل مع تركيب وسائط، ثم ختم الجزء العلوي والسفلي مع البولندية ظفر واضحة. مجرد تلميع الأظافر الجافة، صورة الشرائح مباشرة أو تخزينها في مربع شريحة ضيقة معتمة في-20 درجة مئوية. في غضون أسبوع واحد، صورة العقول استخدام مجهر [كنفوكل] ليزر المسح بأشعة الليزر الإثارة وتصفية المكعبات المناسبة للأجسام المضادة الثانوية نيون المختار. عادة الحصول على صور Z-مكدس فطر الجسم الخلايا العصبية هي استخدام 20 X أو 40 س الأهداف. تصوير الخلايا العصبية مستقبله الشبكية قد تتطلب أعلى التكبير-

Representative Results

الطريقة الموضحة أعلاه يسمح للتصور موثوقة واستنساخه من تقريبا أي منطقة من الدماغ المورفولوجية الكبار. هنا أننا ركزنا على الهيئات الفطر ومستقبله من الخلايا العصبية، ولكن دراسات أخرى استخدمت أساليب مماثلة لتصور مناطق الدماغ مثل إينتيرسيريبراليس بارس52،53،الخلايا العصبية على مدار الساعة54، وباللوامس الفص إسقاط الخلايا العصبية55، ضمن أشياء أخرى كثيرة. الأهم من ذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب لتصور الدماغ كامل الهياكل فضلا عن الخلايا العصبية الفردية داخل هذه الهياكل باستخدام تقنيات مثل ماركم12،47. الرقم 4و الشكل 5 الشكل 6 تظهر عدة أنواع مختلفة من البيانات من الهيئات الفطر وعلم الخلايا العصبية في أدمغة الكبار التي يمكن إنشاؤها باستخدام هذا الأسلوب التشريح وإيمونوستاينينج. أولاً، يمكن استخدام الطريقة الموضحة أعلاه لتصور مباشرة مورفولوجيا الفطر الجسم استخدام الأجسام المضادة التي تعترف فاسسيكولين 2 (Fas2) أو الجينات مراسل المعرب عنها في هيئة فطر الخلايا العصبية34. كما هو موضح في الشكل 4أ و الشكل 4 باء، Fas2 يمكن استخدام الأجسام المضادة لتصور α، β، و (بدرجة أقل) الفصوص γ الهيئات الفطر في تعليم الكبار المورفولوجية ، العقول. Fas2 هو بروتين التصاق خلية خلية المطلوبة لتليف الخلايا العصبية، ويعبر عنه على أعلى المستويات في α و β الفصوص23،،من5657، مما يجعلها علامة راسخة وموثوقة من هذه الفطر الخلايا العصبية في الجسم. جدير بالذكر أن الجسم الاهليلجي على شكل دائري يقع في المنطقة الوسطى من الدماغ الكبار يمكن أيضا تصور استخدام هذه الأجسام المضادة (الشكل 4أ). غالباً ما تسبب عيوب في البروتينات التوجيه محواري الاختراق غير كامل الجسم الفطر تعمل متحولة15،،من3435. ولذلك، في معظم الظروف، أدمغة عشرات عدة ينبغي تصويرها وتحليلها. على سبيل المثال، عبر محاور عصبية الفص β الجسم فطر Nab2 الذباب فارغة غير لائق خط الوسط الدماغ. هذا “العبور” أو β الفص “الانصهار” النمط الظاهري عادة يتم ملاحظة في ~ 80 في المائة البالغين Nab2 فارغة (null) الذباب ولكن هو أساسا غائبة عن ضوابط البرية من نوع ويمكن تصنيف طفيفة كما أو معتدلة أو إتمام الانصهار34. نتائج “انصهار” الفصوص β عبر خط الوسط من الإسقاط contralateral غير صحيحة من محاور عصبية في الدماغ المعاكس نصف الكرة الغربي. كما هو موضح في الشكل 4ج و مفصلة في34،35، الانصهار طفيف يشير إلى الفصوص β متصلة بواسطة “حبلا رقيقة من ألياف Fas2 إيجابية،” بينما الانصهار المعتدل يشير إلى أكثر β متصلة إلى حد كبير الفصوص أن إظهار سمك فص انخفاض طفيف في خط الوسط. الانصهار الكامل (أو “المدقع”) يشير إلى الفصوص بيتا التي ترتبط تماما وإظهار أي انخفاض في سمك الفص أو تلطيخ Fas2 في خط الوسط. يمكن كمياً مدى الجسم فطر β الفص الانصهار وعرضها كما هو موضح في 34،35 أو كجدول يبين النسبة المئوية للعقول عرض كل نوع من عيب مورفولوجيا. بالإضافة إلى تلطيخ مع الأجسام المضادة Fas2، يمكن أيضا استخدام ماركم تقنية12،،من4748 لتصور إكسون توجيه القرارات من الخلايا العصبية بروتينات فلورية خضراء+ الفردية داخل الفصوص فطر الجسم. ماركم يستخدم ممارسو الانقسامية أثناء التطوير لإنشاء الخلايا العصبية الفردية، أو المجموعات ذات الصلة كلونالي من الخلايا العصبية، التي تحمل بروتينات فلورية خضراء (الشكل 5ألف). ماركم يوفر طريقة لإنشاء عدد صغير من الخلايا العصبية التي تفتقر تماما لبروتين داخل يطير متخالف خلاف ذلك. على هذا النحو، وقد تم هذا الأسلوب مفيداً بشكل خاص في تحليل وظائف التوجيه محواري من البروتينات التي أيضا ضرورية للبقاء العضوي عموما12،47. ويمكن مقارنة الخلايا العصبية فارغة متماثل ملحوظ مع التجارة والنقل مباشرة للتحكم في الخلايا العصبية التي تحمل بروتينات فلورية خضراء في خلفية وراثية البرية من نوع. وعلاوة على ذلك، اعتماداً على عندما تكون اليرقات النامية أو الخوادر صدمة الحرارة، تستهدف فئات مختلفة من فطر الجسم يمكن أن تكون الخلايا العصبية (الشكل 5ب). ويرد مثال على نوع البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذا الأسلوب في الشكل 5ج، حيث يتم إنشاء البرية من نوع (أي، التحكم) استنساخ ماركم كمثال. لتوليد الفردية بروتينات فلورية خضراء+ فطر الجسم الخلايا العصبية هو موضح في الشكل 5ج، وضع F1 تم إيواء اليرقات في البداية عند 25 درجة مئوية. حوالي 5-6 أيام بعد الفقس اليرقات (آلة)، الخوادر كانت الحرارة بصدمة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية وعاد بعد ذلك إلى 25 درجة مئوية حتى اكلوسيون. عقب الفقس الكبار، العقول تم تشريح في PTN وثابتة والمحتضنة في وقت واحد مع الأجسام المضادة الاعتراف Fas2 (4 1، 01:20 في PTN المخفف) والتجارة والنقل (المخفف 1: 500 في PTN). ثم العقول المحتضنة مع الأجسام المضادة الثانوية والتي شنت على الشرائح كما هو موضح أعلاه. بروتينات فلورية خضراء+ خلايا تم تحديدها وتصويرها باستخدام مجهر [كنفوكل] المسح الضوئي الليزر وإسقاطات أقصى شدتها تم إنشاؤها باستخدام إيماجيج. كما يتبين في الشكل 5ج، مراقبة التجارة والنقل+ كولوكاليزي مع Fas2 الخلايا العصبية التي تم إنشاؤها في الفصوص α و β وإنهاء قبل الاتصال بخط الوسط الذي يفصل بين نصفي الدماغ المورفولوجية . مشاريع محور عصبي واحد الأسفل، إلى، وثم المشاريع على حد سواء دورسالي وميديالي للنموذج α والفصوص بيتا. العديد من الدراسات السابقة وقد استخدمت هذه التقنية للتحقيق في ما إذا كانت بعض البروتينات المطلوبة لدراسة تقسيم خلية مستقلة لجوانب كثيرة من أكسونوجينيسيس، بما في ذلك تمديد والاستطلاعية والتفريع، أو تشذيب10، 11،،من1213،،من1415،16،17،34. بالإضافة إلى هيئات الفطر، قرارات اﻻستطﻻعية محواري الخلايا العصبية مستقبله الشبكية (R-الخلايا) يمكن أيضا تصور استخدام أسلوب التشريح الموصوفة أعلاه (وكذلك دي طريقة التشريحscribed في مرجع48). ويتضمن كل أوماتيديا داخل العين يطير 8 علم الخلايا العصبية التي يمكن تصنيفها في ثلاث فئات (الشكل 1): R1-R6 الخلايا التي المشروع محاور عصبية للصفيحة السطحية للفص البصري في الدماغ؛ R7 الخلايا التي المشروع محاور عصبية إلى طبقة M6 أعمق من لب؛ والخلايا R8 التي المشروع محاور عصبية للطبقة المتوسطة M3 من19،لب58. نمط العرض لكل فئة من مستقبله قد درست على نطاق واسع ومعا هذه الخلايا العصبية وقد استخدمت بنجاح كنموذج لفهم المسارات مما يشير إلى المشاركة في محور عصبي التوجيه19،59. الأهم من ذلك، يمكن تصور جميع محاور عصبية مستقبله بسهولة في تشريح المورفولوجية العقول التي إيمونوستينينج الكبار، الخوادر، أو الأنسجة اليرقات باستخدام جسم مضاد يعترف تشاوبتين، خلية سطح بروتين سكري24، 60 , 61-كما تم تشييد الجينات مراسل معربا عن التجارة والنقل أو β-جالاكتوسيداسي في كل نوع R-الخلية (الخلايا R1 R6 و R7 R8) ويمكن استخدامها لتمثيل كل فئة من مستقبله62. نظراً لكل نوع من خلايا R ينهي في طبقة مختلفة من الفص البصري النامي، أتاحت هذه الصحفيين مقارنات تفصيلية من مسارات الإشارات اللازمة لكل نوع من الخلايا لإيجاد هدفه بشكل صحيح. يظهر مثال عن أنماط التعبير تنتجها اثنين من هذه الجينات مراسل في تركيبة مع التعريب تشاوبتين (والتي يمكن أن تستخدم كعلامة لجميع الخلايا العصبية مستقبله) في الشكل 6. تصور R7 photoreceptors، تشريح أدمغة المحتوية على الجينات مراسل R7 الخاصة Rhodopsin4-لاكز وملطخة بالأجسام المضادة إلى تشاوبتين و β-جالاكتوسيداسي. رودوبسين 4 وأعرب عن (Rh4) على وجه التحديد في مجموعة فرعية من الخلايا R763؛ ولذلك يمكن استخدام المروج Rh4 لمحرك التعبير الجيني مراسل في هذه الخلايا فقط. كما هو متوقع، إنهاء R7 الخلايا في طبقة M6 أعمق من لب (النطاق المرمز إليه بخط منقط أصفر الشكل 6). وبالمثل، العقول الإعراب عن β-جالاكتوسيداسي من المروج 6 رودوبسين (Rh6)، الذي يتجلى على وجه الخصوص في R8 photoreceptors63، وتم تشريح وإيمونوستينيد باستخدام الأجسام المضادة الاعتراف تشاوبتين و Β-جالاكتوسيداسي. كما هو موضح في الشكل 6، R8 photoreceptors إنهاؤها في طبقة R3لب. على الرغم من أن لا يظهر هنا، يمكن استخدام لاكز Rh1 أيضا تصور إنهاء photoreceptors R1 R6 في الصفيحة. رقم 1: الكبار melanogaster المورفولوجية الدماغ ويتألف من مناطق متميزة لكنها مترابطة وظيفيا. يرد الدماغ (A) مخططا للكبار ميلانوجاستير دال ، تبرز هيئات فطر موقعا مركزياً والخلايا العصبية مستقبله الشبكية المحيطية. (ب) الرسم التخطيطي للموسع الحزم إكسون جسم الفطر الكبار (وتسمى أيضا الفصوص) يتم التعرف عليه بواسطة الأجسام المضادة Fas2. الخلايا العصبية الذاتية الهيئات الفطر، وتسمى الخلايا كينيون، المشروع محاور عصبية الأسفل من الهيئات الخلية دورسالي يقع (الهيئات الخلية حذف من هذا الرسم التخطيطي) وتشكيل هياكل الفص متميزة. في الدماغ الكبار، وشكل γ الفصوص (هو مبين في الحمراء) من حزمة الآنسي واحدة من محاور عصبية، بينما α الظهرية وبيتا الآنسي الفصوص (هو موضح في الأزرق) نموذج من إكسون واحد إلى أن خلال هذه العملية اﻻستطﻻعية. Α ‘/β’ تطوير الخلايا العصبية محواري الفصوص التي تتداخل مع تلك الخلايا العصبية α/β، جزئيا ولكن لا يعترف بها الأجسام المضادة Fas2 ويتم حذف من هذا الرسم التخطيطي. (ج) الخلايا العصبية الشبكية الحاسمة في ترحيل المعلومات المرئية من الشبكية إلى الفص البصري. محاور عصبية من الهيئات الخلية الموجودة في الشبكية (بيج) وتكوين اتصالات مع الخلايا المستهدفة بعد متشابك في الصفيحة أو لب المشروع. R1 R6 علم الخلايا (يظهر باللون الأحمر) تكوين اتصالات محددة مع الخلايا في الطبقة الخارجية من الفص البصري، تسمى الصفيحة. خلايا مستقبله R7 المشبك (أصفر) مع الأهداف في طبقة M6 من لب، بينما الخلايا R8 (يظهر باللون الأخضر) المشروع محاور عصبية إلى طبقة M3 قليلاً أكثر سطحية لب. الجزء ج تكييفها بإذن من الناشرين ماكميلان المحدودة: “طبيعة علم الأعصاب” (مرجع64، وحقوق التأليف والنشر (2011)). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- رقم 2: يمكن أن تستخدم نظام GAL4/UAS للتعبير الجيني المستهدف. للحصول على الذباب التعبير عن جينات التي تهم الجينات (“X”) في نمط محدد من أنسجة، يجب أن تحتوي الذباب التحوير التعبير عن البروتين المنشط النسخي Gal4 الخاضعة لسيطرة محسن الأنسجة محددة سواء التحوير المحتوية على الحمض النووي Gal4 ربط تسلسل (يسمى تسلسل تفعيل المنبع أو UAS) المتاخمة “الجينات عاشرا عادة”، يتحقق هذا المزيج بالتزاوج الذباب الأبوية أن تحتوي كل منها على التحوير واحد وتحديد لذرية1 و التي تحتوي على حد سواء. في الجيل1 و الناتجة عن ذلك، سوف يتم التعبير عن Gal4 وسيتم ربط UAS لتنشيط النسخ العاشر الجينات بطريقة محددة في أنسجة. الأهم من ذلك، يمكن استخدام المتسلسلات المحتوية على UAS مختلفة في تركيبة مع نفس GAL4 “برنامج التشغيل”. على سبيل المثال، التحوير التعبير عن Gal4 في هيئات الفطر (MBs) يمكن أن يقترن التحوير المحتوية على UAS للتجارة والنقل السريع أو التحوير الذي يقرع أسفل تعبير الجينات لمصلحة استخدام تدخل الجيش الملكي النيبالي UAS-التحوير التي تنتج مراسل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3 : تصاعد العقول في التحضير لتصوير الفلورة. العقول (A) هي التي شنت على “سوبيرفروست بالإضافة إلى” الشرائح مع غطاء جسر لمنع تسطيح العقول. اثنين من كشوف غطاء “قاعدة” التقيد بشريحة “سوبيرفروست بالإضافة إلى” مشحونة بشكل إيجابي مع البولندية ظفر واضحة، وتشريح أدمغة ثم توضع على الشريحة بينهما. بكشف غطاء “جسر” واضحة توضع فوق العقول والتقيد بكشوف غطاء قاعدة. (ب) مرة واحدة البولندية ظفر قد جفت، وهو بيبيتيد فيكتاشيلد ببطء تحت الجسر للحفاظ على الأسفار من الجسم المضاد الثانوي. ثم يتم استخدام البولندية ظفر واضحة لختم العلوي والسفلي من كشف الغطاء “الجسر”. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 4 الرقم: يمكن تصور فطر الجسم محاور عصبية وضوح استخدام الأجسام المضادة التي تعترف Fas2. (أ) تم تشريح أدمغة الكبار المورفولوجية ، وثابتة، والمحتضنة مع الأجسام المضادة الاعتراف Fas2. الأجسام المضادة الأولية تم الاعتراف باستخدام Alexa488-إلى جانب الماعز-مكافحة–الماوس الثانوي الأجسام والعقول وقد شنت على الشرائح مشحونة بشكل إيجابي وتصويرها باستخدام ليزر المسح مجهر [كنفوكل]. وتقع بيسيميتريكالي فطر الجسم خلية الهيئات مد محاور عصبية الأسفل وتتشعب، وتشكيل حزم إكسون (تسمى أيضا الفصوص). محاور عصبية تشكل بإسقاط دورسالي الفصوص α وإسقاط ميديالى الفصوص β إكسبريس Fas2. نقديا، إنهاء الفصوص بيتا من الذباب البرية من نوع قبل خط الوسط الدماغ. الجسم الاهليلجي موقعا مركزياً يمكن أيضا تصور استخدام 4 1 الأجسام المضادة. (ب) إبراز ميديالى γ الفص محاور عصبية من الجسم المورفولوجية فطر الكبار أيضا التعبير عن Fas2 ويمكن تصور استخدام 4 1 الأجسام المضادة. عادة، يتم التعبير عن Fas2 في γ الفص محاور عصبية أقل من الفصوص α و β. (ج) الجسم فطر محاور عصبية من العقول Nab2 خالية null (النمط الوراثي: Nab2ex3/Nab2ex3) سوء المشروع كونترالاتيرالي، وغالباً ما تفتقر إلى الفصوص. تم تشريح أدمغة فارغة Nab2، وثابتة، والملون مع 4 1 جسم لتصور الجسم فطر الفصوص α و β و γ. تظهر الإسقاطات أقصى شدتها Z-مكدس المقاطع البصرية، فضلا عن فرادى كما يركز على منطقة خط الوسط. بينما جسم الفطر البرية من نوع β الفص محاور عصبية نادراً ما عبر خط الوسط الدماغ، قد أدمغة فارغة Nab2 كميات مختلفة من سوء الإسقاط عبر خط الوسط في نصف الكرة الغربي contralateral الدماغ، أسفر عن الفصوص β “تنصهر”. حسب التعريف الوارد في المراجع34،35، الانصهار خفيف يشير إلى < الفصوص β مع فقط عدة “خيوط” من محاور عصبية عبور خط الوسط، الانصهار معتدلة ويشير إلى الحالات التي تعبر فيها Fas2 β إيجابية الفص الخلايا العصبية الفص خط الوسط لكن β الدماغ وانخفض العرض في خط الوسط، والانصهار الكامل يشير إلى حالات حيث يوجد أي تخفيض لسمك الفص بيتا كما الفصوص عبور خط الوسط الدماغ. منذ الجسم الاهليلجي تعرب أيضا عن Fas2، مقاطع بصرية تظهر خط الوسط غالباً أكثر مفيدة في تصور بيتا الفص الانصهار. جدير بالذكر أن الفصوص المفقودة هي أيضا كثيرا ما لوحظ (المعرفة هنا مع العلامة النجمية بيضاء). يتم استخدام البيانات في الجزء جيم في التحديد الكمي لتعمل هيئة فطر من مرجع34، مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 5 : يمكن استخدام ماركم لتصور محاور عصبية من الخلايا العصبية واحد. (أ) “التحليل فسيفساء” مع علامة خلية ريبريسيبلي (ماركم) يستخدم حزب العمل الفيجي recombinase بوساطة الانقسامية جزئ في مواقع FRT لإنشاء خليتين ابنه متميزة. في هذا المثال، تحتوي كافة الخلايا بروتين GAL4 خاصة بهيئة فطر على كروموسوم منفصلة. عقب الانقسامية جزئ خلال انقسام الخلايا، خلية ابنه واحدة (أعلى) وتعرب عن التجارة والنقل (أو الغشاء ملزمة CD8-التجارة والنقل) ويحتوي على الآليلات متحولة اثنين من الجينات للفائدة، بينما الخلية الابنة الأخرى (السفلي) يرث اثنين من الآليلات (WT) البرية من نوع التحوير معربا عن البروتين Gal80 باستخدام أحد المروجين tubulin. يمنع Gal80 Gal4، حتى أية خلايا إنتاج Gal80 سوف تكون غير الفلورية وينبغي أن يكون نوع البرية متخالف أو متماثل. فقط تلك الخلايا التي هي التجارة والنقل+ سوف تحتوي على نسختين من اليل المسخ. لاحظ أنه يتم عرض واحد فقط من عدة طرق لتوليد بروتينات فلورية خضراء+ الخلايا التي تحتوي أيضا على الآليلات متحولة اثنين من الجينات للفائدة؛ يرجى الاطلاع على12،،من4556 لأمثلة أخرى. (ب) نظراً لتنمية الخلايا العصبية في جسم الفطر يبدأ مع الخلايا العصبية γ، ثم α ‘/β’ يمكن بصورة انتقائية استهدفت الخلايا العصبية، وينتهي مع الخلايا العصبية α/β، كل فئة من العصبية وتصور بحرارة صدمة عند نقطة زمنية إنمائية مختلفة. كما هو موضح في 12، صدمة حرارة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية التي تحدث بعد الفقس اليرقات (آلة) سوف تستهدف على وجه التحديد γ يوما ≤2.5؛ والخلايا العصبية، بينما صدمة الحرارة التي تحدث أيام 3.5-4.5 آلة (في أواخر مرحلة اليرقات L3) ستستهدف α ‘/β’ الخلايا العصبية، وحرارة صدمة أن س وسوف تستهدف ككورس بين 5-7 أيام آلة (أثناء تطوير الخوادر) α/β الخلايا العصبية. (ج) الفردية البرية من نوع محاور عصبية كانت تصور استخدام ماركم. الخوادر البرية من نوع ~ 5-6 اليوم القديم (النمط الوراثي: هسفلب، UAS-CD8-التجارة والنقل؛ حوض FRT82B، UAS-CD8-التجارة والنقل/FRT82B، > Gal80؛ OK107-GAL4/+) كانت الحرارة صدمة في 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة للحث على جزئ الانقسامية. تم تشريح أدمغة، ثابتة، وملطخة بالأجسام المضادة الاعتراف بالتجارة والنقل (1: 500) و Fas2 (01:20). ثم المحتضنة مع الأجسام المضادة الثانوية المسمى فلوريسسينتلي العقول وتصور بالفحص المجهري [كنفوكل]. في هذا المثال البيانات من النمط وراثي “سيطرة”، إيجابية، الخلايا التي تم إنشاؤها باستخدام ماركم البرية من نوع التجارة والنقل، وبدلاً من الذي يحتوي على اثنين من الآليلاتموت الجينات، تحتوي على اثنين من الآليلاتWT الجينات. هيئة فطر β الفصوص (تصور استخدام الأجسام المضادة الاعتراف Fas2) إنهاء قبل أن تصل إلى خط الوسط المخ؛ الخلايا العصبية في الفص α موجودة أيضا. لإظهار مزيد من التفصيل، يظهر أسرع نظراً لنصف الكرة الدماغ واحد في الصف السفلي من الصور. الجزء جيم تم تكييفها بإذن من المرجع34. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الرقم 6 : يمكن أيضا تصور محاور عصبية مستقبله. الكبار العقول إذ تعرب عن β-جالاكتوسيداسي في فوتوريسيبتورس R7 (يسار، استخدام لاكز Rh4) أو R8 photoreceptors (اليمين، واستخدام Rh6-لاكز) تم تشريح وثابتة، والمحتضنة مع الأجسام المضادة الاعتراف β-جالاكتوسيداسي أو تشاوبتين. ثم المحتضنة مع الأجسام المضادة الثانوية المسمى فلوريسسينتلي العقول وتصور بالليزر الفحص المجهري [كنفوكل]. تظهر المقاطع بصري واحد من كل الدماغ. على اليسار، ويمكن رؤية العديد من محاور عصبية مستقبله R7 (الأسهم) تنتهي في طبقة M6 أعمق من لب (يظهر بخط منقط الأصفر). على اليمين، إنهاء R8 مستقبله محاور عصبية (الأسهم) في طبقة M3 الخارجي للب (يظهر بخط منقط أخضر). منذ R7 photoreceptors إكسبريس أما Rh3 أو فوتوريسيبتورس Rh4 و R8 إكسبريس Rh5 أو Rh663، لا يمكن تصور جميع photoreceptors R7 أو R8 استخدام جينات مراسل لاكز واحد. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

طريقة التشريح والتصور الوارد وصفها أعلاه يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من إيمونوستينينج، ويعيش تطبيقات التصوير. نحن أوجزت بروتوكول إيمونوستينينج عامة، وقد سلطت الضوء على إحدى الطرق التي يمكن استخدامها ماركم لتصور محواري مورفولوجيا الخلايا العصبية الفردية فطر الجسم. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذه الإجراءات العامة لتصوير مناطق الدماغ الأخرى الثابتة أو الكبار طازجة تشريح العقول48،65. تصوير الحية قد توفر نهجاً أكثر فعالية عند تحليل أنماط التعبير من الفخاخ محسن، مراسل الجينات أو تقليد خطوط66، على سبيل المثال. لمنع التقاط القطع الأثرية من موت الخلايا أثناء التصوير الحي للتجارة والنقل في الأنسجة غير المثبتة، العقول ينبغي تشريح في 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو HL3 وسائل الإعلام48، التي شنت على شرائح الجسر في 1 x برنامج تلفزيوني (أو HL3)، وتصويرها في أقل من 15-20 دقيقة الرعاية ينبغي أيضا لإزالة قدر القصبة الهوائية قدر الإمكان من تشريح الدماغ قبل التصوير، نظراً لأنها يمكن أن تتداخل مع التصور للأسفار التجارة والنقل.

حين تكون الشروط المصبوغة لتقييم مورفولوجيا الخلايا العصبية الجسم ومستقبله الفطر الراسخة نسبيا24،61،67، إضفاء الطابع المحلي على بروتين معين من الفائدة في هذه الخلية قد تتطلب أنواع واسعة استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتحسين. على وجه الخصوص، ينبغي أن يكون الأمثل العديد من الخطوات الحاسمة، بما في ذلك التخفيف جسم وحظر تركيز العنصر المخزن المؤقت، والتثبيت، لتوليد نتائج آخر استنساخه وموثوق بها. أولاً، ينبغي تحديد تركيز الأمثل لجسم الأولية. على الرغم من أن الأجسام المضادة المتاحة تجارياً غالباً ما يكون إضعاف مقترح (وغالباً في البداية نبدأ باستخدام هذا التركيز)، ونادراً ما تحدد هذه القيم تجريبيا على أنسجة المورفولوجية . ولذلك، اختبار سلسلة من تخفيف جسم الابتدائي مجموعة فوق وتحت انطلاق اقتراح الشركة المصنعة غالباً ما ينتج في تلطيخ أكثر تحديداً. بينما تمييع جسم الابتدائي يمكن أن يكون لها تأثير كبير على تلطيخ الدقة والتحديد تحدد، هي المحتضنة أدمغة الوقت في جسم الأولية التي تحتوي على الحلول يمكن أن تختلف مع تأثير يذكر على النتيجة الإجمالية. على سبيل المثال، أننا لاحظنا نتائج مماثلة عندما تفرخ تشريح أدمغة مع جسم Fas2 جسم الابتدائي لمدة سنتين، ثلاثة، أو حتى أربعة أيام في 4 درجات مئوية. على الرغم من أن نوصي بليلتين على الأقل، لدينا أيضا المحتضنة العقول في حل جسم الأولية لليلة واحدة وحصل على تلطيخ استنساخه. الأهم من ذلك، يحد من مقدار الوقت هي المحتضنة العقول في جسم الثانوية إلى 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة (أو ليلة واحدة في 4 درجات مئوية) يساعد على حد غير محددة ملزمة للأجسام المضادة الثانوية لانسجة المخ.

ثانيا، قد يكون من الضروري استخدام الكواشف “حظر” إضافية للقضاء على خلفية غير المرغوب فيه إشارة. وتشمل خيارات زيادة تركيز خ ع ~ 10%، مضيفاً ألبومين المصل البقري 1-10% (BSA) إلى حظر والابتدائي/الثانوي حلول جسم أو الامتزاز قبل الأجسام الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع المورفولوجية الأجنة (انظر مرجع68، القسم 2.9، الخطوة 3).

في حين أننا قد كتبت البروتوكول أعلاه باستخدام PTN كالمخزن المؤقت المقترح لتثبيت كافة، المياه والصرف الصحي، وجسم حضانة الخطوات، تثبيت الأنسجة في مخازن أخرى (مثل حزب العمال التقدمي ويم، المدرجة في الجدول المواد) قد ينتج عن الاختلافات العميقة في قوة الإشارة. على سبيل المثال، أظهرت الدراسات السابقة أن ه Cyclin قابل للكشف في أقراص imaginal اليرقات عندما يتم إصلاح الأنسجة في التقليدية بارافورمالدهيد 4% المخفف في برنامج تلفزيوني، ولكن يظهر بشكل واضح عندما يتم إصلاح الأنسجة في المخزن المؤقت لحزب العمال التقدمي (كين موبيرغ، شخصية الاتصالات، ومرجع69). بالإضافة إلى التغييرات في المخزن المؤقت لتلطيخ المكونات، تغيير الوقت ودرجة الحرارة لتثبيت الأنسجة أيضا بدرجة كبيرة يمكن أن تؤثر على إيمونوفلوريسسينت ويمكن تحديده من الناحية العملية إذا لزم الأمر. عموما، وقت التثبيت ينبغي أن تكون طويلة بما يكفي للسماح ل crosslinking كافية من المكونات الخلوية والصيانة على المدى الطويل من مورفولوجيا الخلوية الشاملة بينما يجري محدودة ما يكفي لمنع crosslinking أكثر و “دفن” من البروتين [ابيتوبس]. ولذلك عند البداية تحسين ظروف المصبوغة لجسم الأولية مكتسبة حديثا، عادة ما تحد من وقت التثبيت لحوالي 20 دقيقة وغالباً ما سيتم إصلاح الأنسجة في درجات حرارة أكثر برودة.

ينبغي إدراج عناصر تحكم متعددة في أي تجربة الفلورة للتحقيق في خصوصية أضداد، الابتدائي والثانوي وكذلك تأثير الخلفية المتسلسلات والوراثية على النمط الظاهري الملاحظ. للتأكد عما إذا كان جسم الأولية المستخدمة على وجه التحديد تسلم بروتين الفائدة، ينبغي إدراجها كعناصر تحكم الأنسجة من الذباب التي تفتقر إلى هذا البروتين و/أو الأنسجة overexpressing البروتين. كما يمكن تضمين إضافة البروتين الزائد مستضد المنقي لتحديد ما إذا كان جسم الابتدائي يتعرف الأخرى [ابيتوبس] في الدماغ يطير. أخيرا، أي إشارة الفلورسنت الحالية عندما يتم حذف الأجسام المضادة الأساسي يمثل مستوى الربط غير محددة بالأجسام المضادة الثانوية المحددة.

ينبغي أيضا إدراج عدة عناصر هامة لتقييم مساهمة الخلفية الجينية أو وجود المتسلسلات لكثافة المصبوغة أو مورفولوجيا الخلايا العصبية. على سبيل المثال، تتضمن الذباب استخدمت في التجربة ماركم في الشكل 5 المتسلسلات متعددة (هسفلب، UAS-CD8-التجارة والنقل، FRT82B، وحوض > GAL80، و OK107-GAL4)، ينبغي تحليل كل منها على حدة للآثار على هيئة فطر مورفولوجيا. في مورفولوجية هيئة الحد الأدنى للغاية، والفطر الذباب ينبغي تحليله الذي يحتوي على OK107-GAL4 و UAS-CD8-التجارة والنقل على حد سواء. كما قد يكون من الضروري لتقييم تأثير صدمة الحرارة وحزب العمل الفيجي recombinase إنتاج الفطر هيئة التنمية من خلال تحليل الذباب الذي يحتوي على هسفلب و FRT82B. على الرغم من أن يمكن أن توفر ماركم ثاقبة كبيرة عما إذا كان بروتين معين يتحكم في صورة مستقلة التوجيه محواري، العدد الضوابط اللازمة لجعل دقة هذا الاستنتاج يمكن أن يكون قيداً طفيفة لهذا الأسلوب. في تجارب أقل تعقيداً، ضوابط مماثلة تنطبق أيضا. على سبيل المثال، تأخذ تجربة حيث يتم استخدام نظام GAL4/UAS في تركيبة مع التحوير [رني] ضربة قاضية في التعبير عن البروتين من الاهتمام في جميع الخلايا العصبية. في هذه التجربة، سيكون حاضرا المتسلسلات اثنين على الأقل: سائق GAL4 الخلايا العصبية القومية، مثل elav-GAL4، والتحوير UAS-[رني] . ينبغي التحقيق في مورفولوجيا الخلايا العصبية جسم الفطر في الذباب الذي يحتوي على كل من هذه المتسلسلات وحدها بالإضافة إلى الشرط التجريبي حيث تأوي الذباب كلا المتسلسلات في الطيران نفسه.

وأخيراً، لتحديد ما إذا كان بروتين الفائدة هو المعرب عنها في فطر الجسم من الخلايا العصبية من الضروري عادة العقول وصمة عار المشارك مع الأجسام المضادة إلى Fas2. وبدلاً من ذلك، يمكن أيضا أعرب البروتينات الفلورية مثل التجارة والنقل، وطلب تقديم العروض، أو الغشاء ملزمة CD8-التجارة والنقل باستخدام نظام GAL4/UAS وتستخدم بالاقتران مع الأجسام المضادة للاعتراف بالبروتين للفائدة. منذ Fas2 لا يعترف إلا بمحاور عصبية فاسسيكولاتيد التي تشكل هيئة فطر α و β الفصوص، تم استخدام يحركها GAL4 بغشاء زمني CD8-بروتينات فلورية خضراء مفيدة بشكل خاص لوضع علامات على هيئة فطر الخلايا العصبية.

عيوب في التوجيه محواري غالباً ما لا 100 ٪ الاختراق والعقول حتى من نفس النمط الوراثي قد تظهر بعض التغيرات. ولذلك، عند تحليل حديثا ولدت الآليلات متحولة عن عيوب في جسم الفطر أو اﻻستطﻻعية مستقبله، ينبغي أن تستخدم مزيجاً من الآليلات المختلفة والنهج. تستخدم معظم الدراسات في الأدب عدة نهج مختلفة للتحقيق في ما إذا كان بروتين يلعب دوراً خلية مستقلة في السيطرة على التوجيه محواري: أنا) تحليل اﻻستطﻻعية وجود عيوب في متماثل الذباب فارغة (يفضل استخدام نو مختلفةالآليلات ليرة لبنانية)، الثاني) تحليل اﻻستطﻻعية وجود عيوب في الذباب نقص البروتين للفائدة فقط في الخلايا العصبية (عادة عن طريق [رني])، ثالثا) ماركم تحليل العيوب اﻻستطﻻعية، ورابعاً) إنقاذ التجارب حيث الجينات إعادة المعرب عنها في الخلايا العصبية من متماثل فارغة (null) الذباب. ومن الناحية المثالية، يجب أن يتم تحليل أدمغة عدة عشرات في النمط الوراثي لعيوب في مورفولوجيا الخلايا العصبية.

على الرغم من أن وصف البروتوكول هنا يركز أساسا على الترجمة إيمونوفلوريسسينت للبروتينات داخل الأنسجة الثابتة، يجري تطوير العديد من التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية لانسجة المخ يعيش الصورة. حالما يتم تشريح أدمغة (عادة في خلية ثقافة وسائل الإعلام)، ثم تكون مثقف لعدة أيام عند 25 درجة مئوية. ويجري هذه السابقين فيفو تثقيف الأساليب من أجل التحقيق في مجموعة متنوعة واسعة من العمليات البيولوجية، مثل نشاط البروتين التي تشجع التجديد إكسون عقب إصابة70،71، داخل الخلايا مما يشير إلى ديناميات72، وتنمية الخلايا العصبية73.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن نشكر باك تشانغوي واليسيا فريلاس مورتيمر للتدريس في البداية SMK تقنية تشريح الدماغ. كما نشكر أعضاء فريق مختبر كين موبيرغ، لا سيما “جولات كريس”، للغاية قراءة المخطوطة. الأجسام المضادة للاعتراف Fas2 (4 1) وتشاوبتين (24B10) تم الحصول عليها من البنك هيبريدوما الدراسات الإنمائية. 24B10 جسم أودع دشب واسطة Benzer سيمور ونانسي كوليي24،،من6061، أودع جسم 4 1 دشب واسطة كوري جودمان 22،،من2356. وتم الحصول على الأرصدة يطير من مركز الأسهم بلومينغتون. نود أيضا أن نشكر أوهايو البحوث الزراعية ومركز تصوير مسيك مركز التنمية (أواردك) لاستخدام المجهر [كنفوكل] صورة العقل المدبر في الشكل 4A ومعتمد SMK باء بمنحه من NICHD (HD084241 R15 1-01A1).

Materials

Microdissection forceps/tweezers Ted Pella 505-NM
Sylgard dishes Living Systems Instrumentation DD-50-S-BLK Available from amazon.com
Fas2 Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 1D4
Chaoptin Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 24B10
GFP Antibody Aves Lab GFP-1010
Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody ThermoFisher A-11001
Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody ThermoFisher A-11039
Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody ThermoFisher A-21236
20% paraformaldehyde Electron Microscope Services RT15713
VectaShield Vector Labs H-1000
SuperFrost Plus Slides ThermoFisher 99-910-01
Coverslips ThermoFisher 12-553-454
Na Phosphate Buffer monobasic Sigma S3139
Na phosphate Buffer dibasic Sigma S3264
Triton X 100 Sigma X100-100ml
fingernail polish Electron Microscope Services (EMS) 72180
stereomicroscope Leica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate) VWR 89090-482
nutator/rocker Fisher 22-363-152 or 88-861-041
35mm dish Genesee Scientific 32-103
Sylgard Fisher 50-366-794
Kimwipe Fisher 06-666
Name Company Catalog Number Comments
Potential Fixation Buffers
PTN Buffer 0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed
PLP buffer 2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O
PEM buffer 0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA
Name Company Catalog Number Comments
Fly Stocks available from Bloomington
elav (c155)-GAL4 BL458 Pan-neuronal GAL4 driver
w*;;;OK107-GAL4 BL 854 GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)
y(1), w(67c23); c739-GAL4 BL 7362 GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP BL 64305 GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP
w*; 201Y-GAL4 BL 4440 GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)
y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP BL 64296 GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub>Gal80/CyO BL 5145 MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP BL5146 MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub>GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4 BL 44408 MARCM stock for flipping 3rd chromosome
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub>GAL80;OK107-GAL4 BL44406 MARCM stock for flipping 2nd chromosome
w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4 BL 44407 MARCM stock for flipping X chromosome
y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO BL 5137 GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)
y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP BL 5139 MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO BL 28832 MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome
w*; FRTG13, Tub>GAL80 BL 5140 MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome
y(1), w*;; FRT82B, Tub>GAL80 BL 5135 MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reichert, H. Evolutionary conservation of mechanisms for neural regionalization, proliferation and interconnection in brain development. Biol Lett. 5 (1), 112-116 (2009).
  2. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat Rev Neurosci. 11 (7), 514-522 (2010).
  3. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
  4. Oortveld, M. A., et al. Human intellectual disability genes form conserved functional modules in Drosophila. PLoS Genet. 9 (10), 1003911 (2013).
  5. Sanchez-Soriano, N., Tear, G., Whitington, P., Prokop, A. Drosophila as a genetic and cellular model for studies on axonal growth. Neural Dev. 2, 9 (2007).
  6. Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
  7. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  8. Harris, R., Sabatelli, L. M., Seeger, M. A. Guidance cues at the Drosophila CNS midline: identification and characterization of two Drosophila Netrin/UNC-6 homologs. Neuron. 17 (2), 217-228 (1996).
  9. Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
  10. Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H. Molecular and cellular mechanisms of lamina-specific axon targeting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (3), 001743 (2010).
  11. Hattori, D., et al. Dscam diversity is essential for neuronal wiring and self-recognition. Nature. 449 (7159), 223-227 (2007).
  12. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  13. Reynaud, E., et al. Guidance of Drosophila Mushroom Body Axons Depends upon DRL-Wnt Receptor Cleavage in the Brain Dorsomedial Lineage Precursors. Cell Rep. 11 (8), 1293-1304 (2015).
  14. Reuter, J. E., et al. A mosaic genetic screen for genes necessary for Drosophila mushroom body neuronal morphogenesis. Development. 130 (6), 1203-1213 (2003).
  15. Ng, J. Wnt/PCP proteins regulate stereotyped axon branch extension in Drosophila. Development. 139 (1), 165-177 (2012).
  16. Lai, Y. W., et al. Drosophila microRNA-34 Impairs Axon Pruning of Mushroom Body gamma Neurons by Downregulating the Expression of Ecdysone Receptor. Sci Rep. 6, 39141 (2016).
  17. Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
  18. Borst, A., Helmstaedter, M. Common circuit design in fly and mammalian motion vision. Nat Neurosci. 18 (8), 1067-1076 (2015).
  19. Clandinin, T. R., Zipursky, S. L. Making connections in the fly visual system. Neuron. 35 (5), 827-841 (2002).
  20. Schurmann, F. W. Fine structure of synaptic sites and circuits in mushroom bodies of insect brains. Arthropod Struct Dev. 45 (5), 399-421 (2016).
  21. Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat Rev Neurosci. 4 (4), 266-275 (2003).
  22. Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klambt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
  23. Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
  24. Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7929-7933 (1982).
  25. Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B., Benzer, S. Neuronal development in the Drosophila retina: monoclonal antibodies as molecular probes. Cell. 36 (1), 15-26 (1984).
  26. Wan, L., Dockendorff, T. C., Jongens, T. A., Dreyfuss, G. Characterization of dFMR1, a Drosophila melanogaster homolog of the fragile X mental retardation protein. Mol Cell Biol. 20 (22), 8536-8547 (2000).
  27. Androschuk, A., Al-Jabri, B., Bolduc, F. V. From Learning to Memory: What Flies Can Tell Us about Intellectual Disability Treatment. Front Psychiatry. 6, 85 (2015).
  28. Bolduc, F. V., Tully, T. Fruit flies and intellectual disability. Fly (Austin). 3 (1), 91-104 (2009).
  29. van der Voet, M., Nijhof, B., Oortveld, M. A., Schenck, A. Drosophila models of early onset cognitive disorders and their clinical applications. Neurosci Biobehav Rev. 46, 326-342 (2014).
  30. Pak, C., et al. Mutation of the conserved polyadenosine RNA binding protein, ZC3H14/dNab2, impairs neural function in Drosophila and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12390-12395 (2011).
  31. Gatto, C. L., Broadie, K. Drosophila modeling of heritable neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 21 (6), 834-841 (2011).
  32. van Alphen, B., van Swinderen, B. Drosophila strategies to study psychiatric disorders. Brain Res Bull. 92, 1-11 (2013).
  33. Kelly, S. M., et al. A conserved role for the zinc finger polyadenosine RNA binding protein, ZC3H14, in control of poly(A) tail length. RNA. 20 (5), 681-688 (2014).
  34. Kelly, S. M., et al. The Drosophila ortholog of the Zc3h14 RNA binding protein acts within neurons to pattern axon projection in the developing brain. Dev Neurobiol. 76 (1), 93-106 (2016).
  35. Michel, C. I., Kraft, R., Restifo, L. L. Defective neuronal development in the mushroom bodies of Drosophila fragile X mental retardation 1 mutants. J Neurosci. 24 (25), 5798-5809 (2004).
  36. Yamamoto, D., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat Rev Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
  37. Busto, G. U., Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L. Olfactory learning in Drosophila. Physiology (Bethesda). 25 (6), 338-346 (2010).
  38. Ueno, T., et al. Identification of a dopamine pathway that regulates sleep and arousal in Drosophila. Nat Neurosci. 15 (11), 1516-1523 (2012).
  39. Vogelstein, J. T., et al. Discovery of brainwide neural-behavioral maps via multiscale unsupervised structure learning. Science. 344 (6182), 386-392 (2014).
  40. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  41. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  42. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
  43. Hodge, J. J. Ion channels to inactivate neurons in Drosophila. Front Mol Neurosci. 2, 13 (2009).
  44. Neumuller, R. A., Perrimon, N. Where gene discovery turns into systems biology: genome-scale RNAi screens in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (4), 471-478 (2011).
  45. Ni, J. Q., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
  46. Seelig, J. D., et al. Two-photon calcium imaging from head-fixed Drosophila during optomotor walking behavior. Nat Methods. 7 (7), 535-540 (2010).
  47. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
  48. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
  49. Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. (52), (2011).
  50. Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (12), 1472-1474 (2011).
  51. Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J Vis Exp. (118), (2016).
  52. Liu, Y., Liao, S., Veenstra, J. A., Nassel, D. R. Drosophila insulin-like peptide 1 (DILP1) is transiently expressed during non-feeding stages and reproductive dormancy. Sci Rep. 6, 26620 (2016).
  53. Shafer, O. T., Helfrich-Forster, C., Renn, S. C., Taghert, P. H. Reevaluation of Drosophila melanogaster’s neuronal circadian pacemakers reveals new neuronal classes. J Comp Neurol. 498 (2), 180-193 (2006).
  54. Rieger, D., Shafer, O. T., Tomioka, K., Helfrich-Forster, C. Functional analysis of circadian pacemaker neurons in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 26 (9), 2531-2543 (2006).
  55. Hillebrand, J., et al. The Me31B DEAD-Box Helicase Localizes to Postsynaptic Foci and Regulates Expression of a CaMKII Reporter mRNA in Dendrites of Drosophila Olfactory Projection Neurons. Front Neural Circuits. 4, 121 (2010).
  56. Goodman, C. S., Davis, G. W., Zito, K. The many faces of fasciclin II: Genetic analysis reveals multiple roles for a cell adhesion molecule during the generation of neuronal specificity. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 479-491 (1997).
  57. Fushima, K., Tsujimura, H. Precise control of fasciclin II expression is required for adult mushroom body development in Drosophila. Dev Growth Differ. 49 (3), 215-227 (2007).
  58. Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
  59. Hadjieconomou, D., Timofeev, K., Salecker, I. A step-by-step guide to visual circuit assembly in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 76-84 (2011).
  60. Van Vactor, D. Adhesion and signaling in axonal fasciculation. Curr Opin Neurobiol. 8 (1), 80-86 (1998).
  61. Reinke, R., Krantz, D. E., Yen, D., Zipursky, S. L. Chaoptin, a cell surface glycoprotein required for Drosophila photoreceptor cell morphogenesis, contains a repeat motif found in yeast and human. Cell. 52 (2), 291-301 (1988).
  62. Tahayato, A., et al. Otd/Crx, a dual regulator for the specification of ommatidia subtypes in the Drosophila retina. Dev Cell. 5 (3), 391-402 (2003).
  63. Cook, T., Desplan, C. Photoreceptor subtype specification: from flies to humans. Semin Cell Dev Biol. 12 (6), 509-518 (2001).
  64. Hakeda-Suzuki, S., et al. Goal collaborates with Flamingo in conferring synaptic-layer specificity in the visual system. Nat Neurosci. 14 (3), 314-323 (2011).
  65. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
  66. Venken, K. J., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  67. Crittenden, J. R., Skoulakis, E. M., Han, K. A., Kalderon, D., Davis, R. L. Tripartite mushroom body architecture revealed by antigenic markers. Learn Mem. 5 (1-2), 38-51 (1998).
  68. Muller, H. A. Immunolabeling of embryos. Methods Mol Biol. 420, 207-218 (2008).
  69. Baker, N. E., Li, K., Quiquand, M., Ruggiero, R., Wang, L. H. Eye development. Methods. 68 (1), 252-259 (2014).
  70. Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
  71. Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 575-597 (2012).
  72. Tomchik, S. M., Davis, R. L. Dynamics of learning-related cAMP signaling and stimulus integration in the Drosophila olfactory pathway. Neuron. 64 (4), 510-521 (2009).
  73. Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).

Tags

Drosophila MelanogasterBrain DissectionImmunofluorescenceGFPDevelopmental BiologyNeuroscienceProtein LocalizationNeuronal ConnectivityBrain DevelopmentMorphological DefectsExoskeletonAnesthetized FliesPTNProboscisRetinaOptic LobeTrachea

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains. J. Vis. Exp. (129), e56174, doi:10.3791/56174 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image