Medição In Vivo alterações em neurotransmissores extracelulares durante naturalmente recompensando comportamentos em Hamsters sírios femininos

A capacidade de medir a liberação de neurotransmissores em animais comportamento acordados permite que os pesquisadores de vincular comportamentos específicos com padrões espaciais e temporais da neurotransmissão-uma poderosa ferramenta para investigar os mecanismos e circuitos subjacentes a ambos naturais e comportamentos operante em tempo real. Historicamente, o microdialysis tem sido empregado para medir substâncias eletricamente reativas e não reactivas no meio extracelular do cérebro¹. Esta técnica usa um fluxo contínuo de uma solução aquosa de composição iônica semelhante ao fluido extracelular, através de uma sonda de microdialysis composta de uma haste pequena com uma dica de uma membrana de fibra oca semipermeable². Após a inserção da sonda, neurotransmissores ou outros analitos de interesse podem atravessar a membrana semipermeável por difusão passiva, antes de ser coletados em intervalos para posterior análise por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), um técnica de química analítica, comumente utilizada para separar, identificar e quantificar os componentes em uma mistura heterogênea de³.

Embora microdialysis é uma técnica sensível que pode ser usada para medir praticamente qualquer substância de interesse, a resolução temporal é baixa, com taxas de amostragem máxima da ordem de dezenas de minutos^1,2minutos. A invenção de varredura rápida voltametria cíclica (FSCV), uma técnica que se baseia no potencial redox de espécies eletroativos, pode elucidar perto instantâneas concentrações do analito de interesse no fluido extracelular. Em breve (ver Robinson et al ⁴ para uma extensa revisão), um eletrodo é aplicado para levantar e abaixar a tensão de forma de onda triangular em um rápido tempo de escala⁴. Quando a tensão está no intervalo correto, o composto de interesse repetidamente é oxidado e reduzido. Esta oxidação e redução resulta em um movimento de elétrons que cria uma pequena corrente alternada. Varredura de taxas terá lugar na escala de subsegundos com oxidação e redução de compostos ocorrem em microssegundos. Subtraindo-se o plano de fundo atual criado pela sonda de corrente resultante, pode-se gerar uma tensão vs atual trama original para cada composto. Desde que a escala de tempo das oscilações da tensão é conhecida, esses dados podem ser usados para calcular uma parcela da corrente em função do tempo. Assim, a concentração relativa do composto pode ser determinada, enquanto o número de elétrons transferidos em cada oxidação e reação de redução é conhecida⁴.

Esta especificidade química e alta resolução temporal fazem FSCV uma técnica poderosa para a detecção de alteração química concentrações na vivo. No entanto, apesar dessas vantagens múltiplas, esta técnica requer vastos conhecimentos técnicos e equipamentos caros e instalação. Além disso, nonelectroactive neurotransmissores (e.g., glutamato) não podem ser medidos usando esta técnica. Felizmente, os avanços tecnológicos no campo da eletroquímica⁵, bem como a comercialização destas invenções, introduziu uma abordagem relativamente simples para medir os neurotransmissores não-eletroativos em animais comportamento acordados sem comprometer a técnica de precisão, um temporal conhecida como tecnologia biosensor enzimática. Esta técnica usa conversão enzimática do neurotransmissor nonelectroactive de interesse em dois substratos, um dos quais é eletroativos de peróxido de hidrogênio que é detectado como uma oxidação amperométrico atual gerada por um potencial aplicado⁵ . Biosensor comercialmente disponíveis sondas seletivamente (ver Figura 1) medem analitos de interesse, competitivamente, reduzindo a contribuição de interferentes endógenos. No caso de glutamato, a contribuição do ácido ascórbico interferent comuns (AA) é reduzida competitivamente à corrente medida pelo co localizando oxidase de AA na superfície do sensor, conversão de AA para não-eletroativos enzimática ativa dihydroascorbate e água. Além disso, uma camada de polímero Nafion carregada negativamente presente sob a camada de enzima exclui compostos aniônicos endógenos.

Esta mesma configuração experimental biosensor pode medir eletroativos neurotransmissores como FSCV, mas em vez disso, ele emprega um potencial fixo gravação⁶. Em contraste com a tensão oscilante aplicada em FSCV, na gravação de um potencial fixo a tensão é mantida no redox potencial para o analito de interesse. Embora seja menos quimicamente seletiva do que FSCV como vários neurotransmissores podem ter o mesmo potencial, de redox em áreas do cérebro que esmagadoramente inclinação para um neurotransmissor, a natureza da curva-chave desta abordagem supera a falta de química especificidade.

A capacidade de medir tanto eletroativos e nonelectroactive lançamento do neurotransmissor em tempo quase real e vinculá-lo a eventos comportamentais específicos fornece uma oportunidade para examinar a liberação de neurotransmissor convergentes. Este manuscrito detalha o uso deste sistema para interrogar a neurotransmissão tanto dopamina e glutamato em resposta a recompensa natural em hamsters comportamento acordados. O objetivo deste trabalho é a detalhar o processo de medição esta liberação de neurotransmissor durante o comportamento sexual em hamsters femininos, com o objetivo de demonstrar a sua viabilidade para examinar outros comportamentos e paradigmas experimentais.

Os hamsters são um modelo ideal para uso em gravações de eletroquímicas
Historicamente, os modelos de ratos e camundongos têm sido empregados no estudo do comportamento sexual. Estas espécies de roedores se envolver em uma sequência de imperatividade dinâmica, envolvendo inúmeros comportamentos de solicitação feminino que incluem lupulagem, arremessam e orelha mexer para atrair o macho de perseguir e, finalmente, montar o feminino⁷. A montagem pelo macho (com ou sem penetração vaginal) dura apenas alguns segundos, durante o qual a fêmea se engaja na sua postura de comportamento sexual (denominada lordose) também só por alguns segundos antes de retomar comportamentos ativo solicitação. Este padrão de comportamento, composto por altos níveis de atividade intercalados com breves períodos de imobilidade, é problemático para medir a neurotransmissão em comportamento de animais. Primeiro, pode haver artefatos de movimento em amperométrico gravações que estão relacionadas com a atividade neural. Em segundo lugar, a locomoção é associada com a liberação de neurotransmissores particulares em certas regiões do cérebro. Por exemplo, liberação de dopamina tem sido acoplada a atividade locomotora do striatum dorsal e ventral^8,9, uma descoberta que formou a base para medições microdialysis de dopamina após psicoestimulantes Administração¹⁰. Porque os comportamentos de solicitação fêmea-típico em mosroedores de t envolvem altos níveis de atividade locomotora e são representados pela maior parte de um teste de comportamento sexual de 10 minutos, isso dificulta a alterações na neurotransmissão, atribuímos aos componentes explícitos de comportamento sexual que coletivamente durar apenas minutos.

Para analisar o perfil neuroquímico do comportamento sexual feminino, este laboratório procurou uma espécie em que há atividade locomotora mínima que acompanha o comportamento sexual. A sequência copulador no hamster sírio (Mesocricetus auratus) é ideal para gravações neuroquímicas devido à falta de comportamentos de solicitação normalmente visto em ratos e camundongos¹¹. Como consequência, os hamsters fêmeas entrará e manter a postura de lordose para mais de 9 minutos a 10 minutos de sessão¹²de teste. Com a falta de estranhos movimentos de locomoção pelo sexo feminino, na vivo gravações eletroquímicas que podem ser associadas a componentes de interações sexuais com o macho podem ser obtidas.

Copuladores lutas em hamsters
Após a introdução de um animal de estímulo masculino na câmara de teste, o macho irá inicialmente envolver anogenitais investigação (AI) da fêmea antes de montá-la (Figura 2). Em ordem para montar o macho, a fêmea deve assumir uma postura sexual receptiva, conhecida como lordose, no qual ela arcos de volta e desvia a cauda para que o macho de montagem pode ganhar acesso do pênis para a vagina dela. O macho vai montar a fêmea, abraçando seu traseiro com as duas patas (Figura 2B) e começar a empurrar na tentativa de ganhar penetração peniana (Figura 2C). O macho irá montar a fêmea (sem inserção), bem como intromit um número de vezes antes de finalmente conseguir a ejaculação. Esta sequência de montagens e intromissões levando a ejaculação é denominada um tal”imperatividade”. Os machos terá várias lutas copulativo dentro de uma única sessão.