3' 末端配列 A seq2 とライブラリの準備

1 ですセル成長および mRNA 分離 ~ 80% 合流でよくあたり 10 の 6 セル × 1 6 ウェル プレートの実験的設計に応じて細胞を成長。。 は、成長培地を削除し、セルで 1 回洗浄リン酸緩衝生理食塩水。直接 mRNA 分離キットから 1 mL の溶解バッファーを追加することによって、プレート上のセルを溶解させます。転送粘性 1 mL ピペット チップを 15 mL プラスチック チューブに溶解。ゴム製へらを使用してプレート表面から細胞材料を完全にデタッチします。 せんライセート含む粘性 DNA ライセート、もはや粘性までいくつか上下にピストンの動き活発で 23 G 注射針に接続されている 1 mL 注射器。注射針をチューブから溶解液を取り出すように底の中心にポイントします。 は、注射器を使用して 1.5 mL チューブにライセート転送します。20,000 × g で 5 分間、残骸を削除する 4 ° C をスピンします。プロトコルを通して DNA 低いバインド 1.5 mL バイアルを使用します。 遠心分離機の実行中は、換散バッファーの 500 μ L と磁気ラックに再懸濁オリゴ (dT) 25 磁気ビーズの 300 μ L を洗ってください。ラックに 2-3 回チューブをミックスします。ソリューションが明確だった後、バッファーを削除します。手順 1.4 から明確な上澄みを収集し、ビーズに追加します。再懸濁し、ホイールの回転で 10 分間のチューブを配置 は、磁気ラックにチューブを置きます。2 分追加 0.8 mL バッファー A 後 mRNA 分離キットから透明な液体を削除します。2-3 回、ラックに 180 ° 度の管の電源を入れます。この洗濯、手順 A. のバッファーをもう一度 手順 1.6 0.8 mL のバッファー B にビードを 2 回洗浄しなさい。 ビーズ、バインドされた mRNA を溶出する は、33 μ H 2 O を追加し、ビードを再停止しなさい。5 分加熱ブロック 75 ° C まで加熱します。チューブ、1 の s および場所をすぐにスピン磁気ラックにそれら。上清を新しいチューブに転送します。さらに使用するまで-80 ° c のサンプルを格納できます。 アルカリ加水分解、33 バッファー追加 66 μ μ L mRNA (ステップ 1.8) 混合し、加熱ブロック 95 ° C で 5 分間まったく熱します。すぐに氷のチューブをチル 分離 RNA、RNA のクリーンアップ キットレンズ 。 メモ: ボリュームを確認します。それは、100 μ L をする必要があります。 追加 350 μ L RLT バッファー キット 250 から μ L エタノール。列と 30 のスピンに負荷室温 (RT) で 8,000 の x g で s。キットから 500 μ L RPE バッファーで洗浄します。500 μ L 80% エタノールで洗浄します。列を乾燥する 20,000 × g で 5 分間スピンします。36 μ L H 2 O 列を追加、列を破棄し、溶出液を保存する 20,000 x g に 1 分のためにスピンします。 2. 5 ' リン酸化と DNase 処理終了 追加 5 μ L ポリヌクレオチド バッファー、5 μ L 10 mM ATP 1 μ L リボヌクレアーゼ阻害剤 1 μ L DNase と 2 μ L ポリヌクレオチド キナーゼサンプルし、, 37 ° C で 30 分必要に応じて 1.1 ボリュームを混合することによりプロトコルを通してマスター反応混合物の準備のため n × (n = サンプル数) の各コンポーネント。 バッファーを変更し、次の手順でポリ a 付加しないようにスピン列に ATP を削除します。 Prespin スピン – 735 x g で 1 分間に列は列を新しい 1.5 mL バイアルに転送し、列にキナーゼ反応を読み込みます。スピン 735 x g に 2 分の列列を破棄収集反応チューブを氷の場所や-80 デパート ° C 3。ブロック 3 ' 三リン酸コルジセピンで終わる 注: ブロック、3 が不可欠です ' 以降ライゲーション反応 3 で自分の concatemerization を避けるために RNA のフラグメントの端 '、(既にブロックされていない終了。3 の付加によって扱われる加水分解後の繰返し) リン酸 ' dATP (三リン酸コルジセピン) チェーン ターミネーター塩基ポリ a ポリメラーゼの助けを借りて。ここでは、0.5 mg/mL の濃度で表現され、 8 で説明されているように精製酵母ポリ a ポリメラーゼ (yPAP) が使用されました。酵母や 大腸菌 PAP 両方 3 を追加するためほぼ同じ活動がある ' dATP をし、商業的に購入することができます (資料の表を参照してください). 追加 13.5 μ L 5 倍濃縮多ポリメラーゼ反応バッファー、10 mM 3 の 2 μ L ' dATP、1 μ L RNase 阻害剤との反応に 1 μ L のポリ a ポリメラーゼ ステップ 2.2.1。ミックスと各反応を 30 分追加 32.5 μ L H 2 O の 37 ° C で 1 s. 加温のためのスピン。1.10.1 のステップのように RNA を浄化します。溶出が 14 μ L H 2 o ・ RNA 4。逆に 3 の結紮 ' 5 アダプター ' RNA のフラグメントの末尾 が 6 μ L 追加 3 μ l 10 x T4 RNA 結紮バッファー、3 μ l の 10 mM ATP にボリュームを減らすために 10 分間真空濃縮、反応。、15 μ L 0.1 mM 逆の補数 3 1 μ、1 μ L RNase 阻害剤 PEG­ 8000 ' アダプター " revRA3 " (材料表参照) 1 μ L 高濃度 RNA リガーゼ 1、ミックスと。 では、1,000 rpm で断続的な混合加熱ミキサー上で 16 時間 24 の ° C で反応を孵化させなさい。各反作用に 70 μ L H 2 O を加え、混ぜます。1.10.1 のステップのように RNA を浄化します。14 μ L H 2 o. サンプルを-80 ° C でこの時点で格納できる RNA を溶出します。 5。逆に転写 (RT) 場所 11 μ。 転送に 200 μ l の PCR 反応に、量を削減する 3 分の真空濃縮で溶出チューブ。1 μ L 0.05 mM RT プライマーを追加 " バイオ デュ dT25 "。PCR サーマルサイクラーの 70 ° C で 5 分間加熱し、5 分の RT のまま は、1 μ L の 10 mM dNTPs、4 μ L 5 x 逆転写酵素バッファー、1 μ L 0.1 M DTT、1 μ L RNase 阻害剤と 1 μ L 逆転写酵素を追加します。ミックスし、PCR サーマルサイクラーの 80 ° c 10 分 55 ° C まで、10 分の反応の熱します。氷の上や長期保管-80 ° C で維持します。 6。ウラシル DNA グリコシラーゼ酵素ミックス消化 ピペット 100 μ L 1.5 mL バイアルにストレプトアビジン ビーズ 800 μ L ビオチン結合バッファーで再懸濁し、磁気ラックに置き。2-3 回チューブを反転します。クリア時のバッファーを削除します。洗浄手順を繰り返します。200 μ L ビオチン結合バッファーのビードを再停止しなさい。 は、ビーズ ソリューションへの逆転写反応を追加し、ホイールの回転に 4 ° C で 20 分を孵化させなさい。2 倍のビオチン結合バッファーでビーズを踏む磁気ラック 6.1 および 2 x 10 のバッファーで洗浄。50 μ L の 10 のバッファーのビードを再懸濁します 2 μ L ウラシル DNA グリコシラーゼ酵素ミックスを追加して、断続的な混合ミキサーで 37 ° C で 1 時間インキュベートします。 追加 50 μ L H 2 O、リボヌクレアーゼ H の 11 μ L バッファー、1 μ L RNase H、反応します。磁気ラックに 20 分位チューブの 37 ° C で孵化させなさい、新しいチューブに劈開の cDNA を含有する液体を転送 劈開の cDNA を浄化します。 胸の谷間反応する PCR 精製キットの PB のバッファーの追加 550 μ L。10 μ L の 3 M 酢酸ナトリウム、pH が 5.2 pH を下げるために追加します。反応をロードします。最小限の溶出スピン列と 1 分 17,000 x g でスピン 列および 17,000 x g で 1 分間にスピンを追加 750 μ L バッファー PE を流れを破棄します。乾燥する 1 分 17,000 x g で列をスピンします。1.5 mL のバイアルに列を転送、16 μ L H 2 O および 17,000 x g で 1 分間でスピン 7 μ L のボリュームに集中する 8 分の真空濃縮で反応の場所を追加します。 7。5 の結紮 ' 5 アダプター ' cDNA の端 分離 cDNA T4 RNA リガーゼ 1 バッファー、3 μ L 10 mM ATP 15 μ L x 3 μ 10 を追加 PEG­-8000、1 μ L 50 μ M " revDA5 " オリゴ、、1 μ L 高濃度 T4 RNA リガーゼ 1。H 2 O 各反応に 24 ° C、20 h. 追加 70 μ L インキュベートします。サンプルは-20 ° C でこの時点で保存できます。 8。PCR 増幅のライブラリ、サイズ選択をパイロット パイロットの反応指数段階の増幅をライブラリに到達するサイクルの PCR の最適な数を決定します。 ピペット 25 μ L の DNA ポリメラーゼのミックス、20 μ L の ligation の反作用、2 μ L H 2 O、1.5 μ 10 μ M 前方 PCR プライマー (RP1)、1.5 μ 10 μ M 逆 PCR インデックス プライマー 200 μ L の PCR チューブにします。 は、次のプログラムで、サーマルサイクラーを実行: 95 ° C、20 の 20 のサイクルが続く 3 分 s 98 ° C、20 s 67 ° C と 30 s 72 ° c. を集める 7 μ 因数 cycler から直接 6、8、10、12、14、16、18 のサイクル後。バッファー (50% のグリセロール、0.05% キシレンシアノール) x 1 μ 10 を追加します。注: 場合はバーコードを結合するときに多重化を使用してサプライヤーの推奨事項に従ってください。 、1:10、緑の蛍光染料の 00 希釈を含む 1 x TBE バッファーに 2% の agarose のゲルの小さなスロット別々 の製品。 ロード因数 2% の agarose のゲル、ゲルのドキュメンテーション システムの 100 ボルト 15 分 PCR の製品の可視化移行のためのゲルを実行します。 パイロットの反応 ( 図 2) のボリューム 2 倍に大規模な PCR の反作用のためのパイロットの反応指数関数的増幅の先頭サイクル数を使用して。 大規模な PCR の反作用の集中、PCR 精製キットの最初の反応を脱塩し、1 x TBE バッファー内の 2% アガロースゲル上ワイド スロット上の製品を分離します。 200-350 nt DNA を含むゲルのスライスをカット製品。最大 30 分間常温カオトロ ピック バッファーのゲルを溶かします。ゲル抽出キットとゲルのスライスから DNA を抽出します。A 豊富な DNA 9 のバインディングでバイアスを防ぐために 50 ° C に加熱しないでください。 シーケンスの 送信します 。 注: 通常、50 サイクル シングル読み取り (SR50) は十分です (例えば、については https://www.illumina.com/technology/next-generation-sequencing.html を参照). 9。データ処理 注: gitlab リポジトリ (https://git.scicore.unibas.ch/zavolan_public/A-seq2-processing) で使用可能なソフトウェア (fastq 形式) での結果のシーケンス データが処理されます。分析には 4 つの主な手順が含まれています: (1) ダウンロード git リポジトリ、仮想環境のインストール (2) (3) 特定のパラメーターの設定構成ファイルと (4) で起動による分析 ‘ snakemake ’ 10. ステップ 4 で実行全体の分析 1 つだけコマンドが必要です。分析の詳細なステップバイ ステップの説明は、gitlab リポジトリ内の README ファイルで見つけることができます、簡単な説明は以下。すべての個別の処理ステップが公開されているツールは、いずれかの外部ソースからの実行あるいは社内準備します。計算のパイプラインは、snakemake パッケージの利用できる 10 anaconda ベース 11 python 3 仮想環境に依存します。それは Unix ライクなオペレーティング システムを持つマシン上で実行し、インストールされている CentOS 6.5 オペレーティング システムと Linux 環境で 40 GB 使用可能な RAM 試験しました。ソフトウェアの依存関係は、仮想環境内で自動的に制御されます。次の公に利用可能なソフトウェア ツールが必要でありそれにより環境と共にインストール: snakemake (v3.9.1) 10, fastx ツールキット (v0.0.14) 12 星 (v2.5.2a) 13、cutadapt (v1.12) 14, samtools (v1.3.1) 14 , 15, bedtools (v2.26.0) 16 , 17. Cdna を読み取りからデータ前処理 注: シーケンスの深さは実行の間に異なる場合があり、楽器によって 1 つのサンプルからのデータを複数のシーケンスのファイルに分割できます。この場合は、次の手順で使用されている 1 つの入力ファイルに 1 つのサンプルに対応するファイルを連結します。 Fastq から fasta 形式にファイルを変換します。 (読み取りの位置 5、6、7 で 3 thymidines) の正しい構造を持つエキスを読み取ります 。 メモ: 上記実験的プロトコルに従って準備が正しく読み取りが必要構造 (5 から ' 終わり): 4 ヌクレオチド バーコード – 3 thymidines – 逆に成績証明書 3 の補数 ' 終わり。 は、シーケンスの説明の行で開始四量体に関する情報を格納します 。 注: 後における増幅デジタルアーティファクトの補正を容易にするユニークな分子識別子 (UMI) として、テトラマー。 読んでから最初の 7 つのヌクレオチドを削除 ' s 5 ' 終了します。 と同じ読み取りの 1 つだけのコピーを保つことによって増幅アイテム挿入のシーケンスと海を修正します。 3 の部分を削除する ' エンド アダプター シーケンスとその逆の補数シーケンスに一致します。のみ、最小長さの読み取りを続行 (既定: 15 nt). 注: 元の mRNA フラグメントと、3 サイクル シーケンス数の長さに応じて '、読み取りの終了は 3 の部分を含めることができます ' アダプターは、この手順で削除されます。 次の条件を満たすすべての読み取りを抽出: 最大 2 不明なヌクレオチド (' N ')、として、最大 80% と読むない A. 最後のヌクレオチドこれらの読み取り、解析で使用される十分な品質であることと見なされます。 読み取りをスプライシングの読み取りを処理し、BAM 形式で出力ファイルを生成するツールをゲノムにマップします。 スターの場合は、読み取りする必要がありますマップするゲノムのインデックス ファイルを作成します。人間のゲノムのこのステップは 35 GB のメモリ (RAM) を必要があります。 は、読み取りをゲノムにマップします 。 注: (星固有の注意事項) ソフト クリップは 3 のマッピングを強制するために無効になって ' それぞれの終わりを読んでこれはヌクレオチド胸の谷間サイトのすぐ上流。 BAM をベッド ファイルに変換します。読み取りは、複数の場所にマップする場合これら最低の編集距離だけを維持します 。 注: 特定の場所でマップを読むのコピー数はスコアとして使用されます。複数の場所にマップされる読み取り、読み取りのマップ先の場所の 1/数と等しい重量の各場所で分数カウントされます。 可能性が高い順序の誤りによって異なる 崩壊を読み取ります。同じ場所に 2 つの異なる読み取りマップする場合 (マッピングの開始と終了位置が同じ) と同じ海を共有、PCR 重複としてそれらを考慮して 1 つしか保存します。 推論すべての個々 の mRNA 3 ' 処理サイトを終了します 。 注: 個々 の読みは 3 で証拠を提供する ' その最後の 4 つのヌクレオチドがエラーなしゲノムにマップされるときに終了します。先の位置、3 ' 読み取りのマップの端、胸の谷間のサイトとして格納されます。 検出 3 ' 内部プライミングから由来するかもしれないサイトを終了します。10 ゲノムで胸の谷間サイトの下流に nt を満たすとき内部のプライミング加工品としてサイトを定義する次の条件の 1 つ: として六つ以上が含まれています、6 年連続を含むまたは次テトラマーのいずれかから始まります: AAAA, AGAA, 佐賀, AAAG. 3 の個々 のテーブルを生成 ' ベッド形式の処理サイトを終了します。 識別がポリ a サイト クラスターを個別調整 。 注: ここで説明する手順に従って前の発行 5 で導入された手順に従います。 個々 の 3 を集めることによって開始 ' 研究のすべてのサンプルで得られた処理サイトを終了します。 9 の地域で知られている多信号 7 に注釈を付ける各個別 3 周りヌクレオチド ' エンド処理サイト。 識別多サイト各サンプルの背景の上次のように表されます。 は、現在のサンプル内の元の式でサイトを並べ替えます。上から下、ゲノムのあらかじめ定義された距離内にある場合より高いランク付けされたサイトとランクの低いサイトを関連付けるサイトのリストを走査 (既定: 25 nt アップまたはダウン ストリーム) 上位サイトから 。 注: 上位サイトに関連付けられたすべての低ランキングのサイト定義式はこれらのサイトのすべてを文書化する読み取りの数クラスター。 式でこれらのクラスターを並べ替えるし、最高から最低式に式しきい値 c で注釈付きポリ a を持つクラスターの割合信号定義済みしきい値 (下のドロップを決定するクラスターのリストを走査既定値: 90%). サイトのカットオフ以下の任意のクラスターからを破棄します。 クラスター近接 3 ' のサンプルの間で得られるサイトを終了します 。 注: 並べ替え 3 ' 終了のサンプルをサポートの数し、正規化の合計によってサイトをまず処理カウントを読む (あたりの読み取り数百万 (RPM)) のサンプルの間で。上から順に、上位サイトへの間隔で定義済みの上限よりも大きくない場合、低ランクのサイトをより高いランク サイトに関連付けるリスト内の移動 (デフォルト: 12 nt)。いずれかの構成する 3 ' エンド サイト注釈付き多信号と重複または多信号の直接内部のプライミングを検出する詳細な検査に対応するクラスターをマークする下流。 マージ多サイト クラスター 。 注: クラスターが推定内部プライミング候補としてマークされると、それが 2 つのクラスターを共有、多信号に応じて下流クラスターにマージまたはクラスターで最もダウン ストリーム サイト最低に位置する多信号がある場合は保持上流の距離 (既定: 15 nt)。場合に密接に間隔をあけられたクラスターを結合する最後に、: 同じ多込むを共有 (i) または (ii) 結果のクラスターのスパンが最大値を超えない (既定: 25 nt). すべての 3 からカウントを読む正規化総ベッド ファイル形式でクラスターを保存 ' スコアと各クラスター内のサイトを終了します。