Birincil fare malzemelerin yalıtım ve Vana interstisyel hücreleri: Aort Kapak kalsifikasyon eğitim için yeni bir Model
Summary
Bu iletişim kuralı yalıtım, kültür ve kalsifikasyon sıçan kaynaklı Vana interstisyel hücrelerin son derece fizyolojik vitro manken kireçlenmeler aort kapak hastalığı (CAVD) açıklanmaktadır. Bu fare modeli sömürü CAVD araştırma hücre ve moleküler mekanizmaları bu karmaşık patolojik süreç altında yatan Exploring kolaylaştırır.
Abstract
Kireç aort kapak hastalığı (CAVD) aort kapak broşürler ilerici kalınlaşma ile karakterizedir. Sık sık Hiperfosfatemi ve Hiperkalsemi muzdarip yaşlı ve son aşama böbrek hastalığı (ESRD) hastalarda, buldum bir durumdur. Şu anda, ilerlemesi durdurabilir hiçbir ilaç tedavileri vardır. Bu patolojik süreç altında yatan mekanizmaları belirsiz kalır. Aort kapak broşürü hücrelerle VECs arasında gözükeceksin Vana interstisyel (kurban) aort cusps dış yüzeylerinde Vana endotel hücrelerinin (VECs) ince bir tabaka oluşur. Bir fare modeli kullanın Ektopik kalsifikasyon in vivo Fizyopatolojik serum fosfat (PI) ve kalsiyum (Ca) düzeyleri Hiperfosfatemi ve Hiperkalsemi muzdarip hastaların temel vitro çalışma sağlar. VIC işaretleri ifade tarafından gösterildiği gibi saf sıçan VIC nüfus yalıtım açıklanan protokol detayları: Alfa-düz kas aktin (α-SMA) vimentin ve doku büyüme faktörü beta (TGFβ) 1 ve 2 ve küme farklılaşma (CD) 31, bir VEC yokluğu işaret. Bu kurban genişleterek, biyokimyasal, genetik ve görüntüleme çalışmaları çalışma ve CAVD destek anahtar arabulucu unravel gerçekleştirilebilir.
Introduction
Sağlıklı aort kapak için eşit mekanik stres dağıtım sırasında açılış ve kapanış Vana paylaştırıldı üç broşürler oluşur. Vana belgesi üç farklı katmanların tanımlanmış bir yapısı vardır: fibrosa, spongiosa ve ventricularis, hangi ev Vana interstisyel hücreleri (kurban) baskın hücre türü olarak. Bu üç katman Vana endotel hücreleri (VECs)1iki yatak arasında gözükeceksin.
Kurban, kireçlenmeler aort kapak kalsifikasyon (CAVD), Batı dünyasında en yaygın kalp kapak hastalığı ilerleme kritik bir rol oynamaktadır. CAVD aktif olarak valvular doku ve onun çevresindeki microenvironment tarafından yetkilendirilmekte ilerici bir koşulu olarak tanımlanıyor. Hücresel değişiklikler başlangıçta fibrotik kalınlaşma ve sonunda aort kapak broşürler geniş bir kalsifikasyon neden. Bu önemli aort stenozu yol açar ve sonuçta, sol ventrikül çıkış obstrüksiyonu2cerrahi kapak replasmanı tek uygun tedavi olarak bırakarak.
CAVD Patofizyoloji karmaşıktır, ancak fizyolojik kemik Qafqaz3benzer mekanizmalar paylaşır. Iken çalışmalar bir dizi Osteojenik trans-farklılaşma ve kalsifikasyon4,5geçmesi kurban yeteneğini göstermiştir, bu işlem destek mekanizmaları tam aydınlatılmamıştır, vurgulama henüz CAVD mümkün ve ilgili vitro modelinin çok önemli gereksinimini.
Laboratuvarlar bir dizi önceki iş başarıyla domuz ve sığır modellerden kurban izole ve koşullar6,7,8kalsifiye altında bu hücreler kültürlü. Bu modeller aort kapak büyük büyüklüğü nedeniyle, yalıtım hücrelerin Enzimatik sindirim yoluyla saf nüfus hücre oluşturmak için son derece etkili olmuştur. Ancak, bu modeller büyük hayvan türleri için moleküler araçlar sınırlı yer nedeniyle kısıtlayıcı olabilir. Buna ek olarak, kemirgen modelleri nispeten daha düşük maliyet, potansiyel genetik manipülasyon için ve kolayca kullanılabilir moleküler araçları geniş yelpazede nedeniyle avantajlı kalır. Ancak, kurban izolasyonu küçük hayvan modelleri yaygın olarak, hangi küçük doku örnekleri ile çalışırken karşılaşılan zorluklar, büyük olasılıkla bir sonucudur istihdam değil.
Bu ayrıntılı iletişim kuralı sıçan kurban doğrudan yalıtım için kapsamlı bir yöntemi bildirir. Enzimatik sindirim, bir sıra tarafından Vana, dikkatli diseksiyon tarafından kurban izole ve deneysel teknikleri, hücre kültürü, kalsifikasyon ve gen ifadesi de dahil olmak üzere çok çeşitli olarak istihdam. Bu son derece alakalı vitro modeli CAVD, hiç şüphesiz bu patolojik süreci ile ilgili bilgilerimizi artırmak için önemli bir katkı sağlayacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu ayrıntılı Protokolü birincil fare kurban, sıçan kalp kapakları Enzimatik sindirim yoluyla bu hücrelerden yalıtım etkinleştirme edinimi için pratik bir yöntem açıklanır. Bizim yöntem daha fazla destekler ve aort kapak kalsifikasyon13çalışmaya daha önce raporlanmış sıçan vitro manken kullanımı uzanır. Kurban izolasyonu aort kapak komşu VECs bulaşma olasılığını sunar. Ancak, bizim ayirt veri ilk sindirim adım izole hücreler endotel hücre işaretçisi, CD31 için negatif işleme VECs kaldırmak için yeterli olduğunu doğrulayın. Ayrıca, α-SMA boyama kurbanlar, aktif fenotip kalsifikasyon12için gerekli olan doğruluyor.
VIC izolasyonların içinde daha önce bildirilmiştir büyük hayvan modelleri6,7,8. Ancak, bu tür aşağı akım çalışma yanı sıra dünya çapında laboratuarlarında sınırlı onların erişilebilirlik için sınırlı genetik ve moleküler araçları tarafından sınırlandırılmıştır. Buna ek olarak, bu tür araçlar hazır kemirgenler ve bu nedenle, yeteneğini daha büyük bir deneysel tasarım kapasitesi sıçan kaynaklı kurban sağlar izole etmek iyi kurulmuş. Genç sıçanlar kurban kullanımından da hücreleri nispeten daha büyük fareler, bu nedenle daha fazla hücre verim için daha az hayvan gerektiren proliferatif olduğu anlamına gelir. Fareler kolayca erişilebilir olmakla birlikte, ama fareler nedeniyle özellikle küçük Kalpler, yalıtım sahip birincil fare kurban daha uzun sürmesine olacağını ve önemli ölçüde daha fazla hayvan sıçan model olarak hücre verim aynı yalıtmak için gerekli olacaktır.
Açıklanan bu yaklaşımın önemli avantajı kurban geçici vahşi türü ve transgenik fareler, yanı sıra fare modelleri, kardiyovasküler hastalık ve Vana yaralanma ayrılmış olabilir olduğunu. Fare modeli kullanarak hayvanlar daha çok sayıda büyük ölçekli deneyler için bu nedenle hayvan kullanımını azaltmak için gerektirecektir, birincil fare kurban bu iyi karakterize bir kez bir hücre kültürünü üretmek için dönüştürülebilir.
CAVD ciddi klinik etkileri yaygın olarak kabul ederken, temel etken mekanizmaları henüz belirlenmesi gerekir. Buna ek olarak, önlemek ve potansiyel olarak aort kapak kalsifikasyon tedavi tedaviler mevcut değildir etkili ilaç mevcut. Kalsifiye koşullar altında kurban kültürünün bu nedenle CAVD son derece alakalı vitro modeli sağlar. Ca ve Pi düzeyleri Osteojenik gen işaretleri Msx2, Alplve Phospho1ifade eşlik eden bir artış ile izole sıçan kurban vitro kalsifikasyon neden göster. Yaygın olarak bu işaretleri Vasküler kalsifikasyon14,15,16patolojik süreci ile ilişkili olan kuruldu. Bizim veri bu nedenle orta kalsifiye içinde sıçan kurban kültürü ile aort kapak kalsifikasyon içinde vitroçalışma için uygun bir model olduğunu gösteriyor. Gerçekten de, bizim laboratuvar son çalışmalardan Ca aort kapak kalsifikasyon Annexin VI zenginleştirme VIC kaynaklı matris veziküller17aracılığıyla teşvik göstermek için bu modeli kullanılan.
Rat kurban ve onların verimli karakterizasyonu kullanmanın yararları rağmen hala bazı sınırlamalar var. İlk olarak, VIC nüfus içinde sıçan vanalar boyutu çok küçük, ve bu nedenle birçok hayvan geniş vitro çalışmalar yeterli cep numaralarını oluşturması için gereklidir. Ancak, bu girişim ön çalışmalar gibi son zamanlarda bizim tarafımızdan18bildirdi ve daha sonra birincil kültürler için istihdam doğrulamak ve bu bulgular genişletmek ölümsüzleştirdi Vana interstisyel hücre hatlarında, tarafından bu sınırlamayı aşmak mümkündür.
Özet olarak, başarılı yalıtım, kültür ve kalsifikasyon birincil sıçan kurban, daha sonra çeşitli biyokimyasal testleri yanı sıra protein analizleri ve RNA analizleri kullanarak değerlendirildi açıklanan yöntemi açıklar. Bu model hangi CAVD vitroaraştırmak güvenilir ve uygun bir sistem sunuyor ve moleküler mekanizmaları yıkıcı bu hastalık için sorumlu soruşturma için değerli bir araç sağlar.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kullanılan CD31 antikor Dr Karen Tan, Edinburgh Üniversitesi cömert bir hediye etmişti. Bu çalışmada Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC) bir Enstitüsü Stratejik programı hibe (BB/J004316/1; şeklinde fon tarafından desteklenmiştir BBS/E/D/20221657) (VEM ve CF), bir Enstitüsü kariyer yolu bursu BB/F023928/1 (VEM) ve öğrencilik bir BBSRC durumda öğrencilik BB/K011618/1 (LC) yoluyla finansman.
Materials
| Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave before use. |
| Spring curved (14 cm) | World Precision Instruments | 14112 | Autoclave before use. |
| Spring straight (8 mm blade) | World Precision Instruments | 15905 | Autoclave before use. |
| SuperFine Vannas scissors (3 mm blade, 8 cm) | World Precision Instruments | 501778 | Autoclave before use. |
| Dumont #5 tweezers (11 cm) | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave before use. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Filter before adding to culture medium. |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710049 | |
| Absolute ethanol | Thermo Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in distilled water. |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher Scientific | H1150PB17 | Dilute to 0.6M with distilled water. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | UN1823 | Dilute to 0.1M with distilled water. |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
| Superscript II kit | Thermo Fisher Scientific | 18064014 | |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | P/N58875 | |
| Taq Polymerase kit | Thermo Fisher Scientific | 18038026 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Thermo Fisher Scientific | AM9863 | Dilute to 1x with distlled water, before use. |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500 | 2% in 1x Tris/Borate/EDTA(TBE). |
| Lysis buffer (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | 89900 | |
| T75 flask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
| T175 flask | Thermo Fisher Scientific | 159920 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher Scientific | AB0990 | |
| Rat Msx2 primer | Qiagen | QT01084090 | |
| Rat Alpl primer | Qiagen | QT00190680 | |
| Rat Enpp1 primer | Qiagen | QT00181426 | |
| RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | |
| 6-well plates | Sigma | CLS3516 | |
| T25 flask | Sigma | CLS430639 | |
| Monobasic phosphate | Sigma | S5011 | |
| Dibasic phosphate | Sigma | S5136 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma | 5030 | Dilute to 0.1% with 0.1M NaOH. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS. |
| Triton X100 | Sigma | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3059 | |
| Alizarin red S | Sigma | A5533 | Make up to 2% with distilled water, and adjust to pH 4.2. |
| TGFβ-1 primer pair: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
| TGFβ-2 primer pair: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
| Monoclonal Anti-β-Actin−Peroxidase antibody produced in mouse | Sigma | A3854 | 1/50000 dilution in 5% BSA in tris-buffered saline + 0.1% Tween (TBS/T). |
| Mouse anti-vimentin antibody | Sigma | v6389 | 1/900 dilution in antibody dilution buffer (1x phosphate buffered saline (PBS), 1% bovine serum albumin (BSA), 0.3% Triton X-100). |
| Mouse IgG | Sigma | I5381 | Diluted to the same stock concentration as mouse anti-vimentin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit IgG | GeneTex | GTX35035 | Diluted to the same stock concentration as rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | 1/200 dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | 1/50 dilution in 5% BSA inTBS/T. |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Dako | P0448 | 1/3000 dilution in in 5% BSA in TBS/T. |
| Collagenase II | Worthington | 41512862 | Adjust to 425 U/mL with distilled water, and then filter. |
| SYBR green mastermix | Primerdesign | PrecisionPLUS-MX-SY | |
| Calcium assay kit | Randox | CA590 | |
| DC protein assay kit | Bio-Rad | 5000111 | |
| ECL reagent | GE Healthcare | RPN2109 | |
| Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906837 | |
| Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
| PCR ladder | Bioline | BIO-33057 | |
| Loading dye for gel electrophoresis | New England Biolabs | B7025S | |
| Syringe filters (0.22 μm) | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Coverslips | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3100 | |
| Hematocytometer | Marienfeld Superior | 640030 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera set up for Alizarin red images: | |||
| Camera | Nikon D800 | ||
| Lens | Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED |
References
- Dweck, M. R., Boon, N. a., Newby, D. E. Calcific aortic stenosis: a disease of the valve and the myocardium. J Am Coll Cardiol. 60 (19), 1854-1863 (2012).
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111, 3316-3326 (2005).
- Mohler, E. R., Gannon, F., Reynolds, C., Zimmerman, R., Keane, M. G., Kaplan, F. S. Bone formation and inflammation in cardiac valves. Circulation. 103 (11), 1522-1528 (2001).
- Monzack, E. L., Masters, K. S. Can valvular interstitial cells become true osteoblasts? A side-by-side comparison. J Heart Valve Dis. 20 (4), 449-463 (2011).
- Osman, L., Yacoub, M. H., Latif, N., Amrani, M., Chester, A. H. Role of human valve interstitial cells in valve calcification and their response to atorvastatin. Circulation. 114 (Suppl 1), (2006).
- Gu, X., Masters, K. S. Role of the Rho pathway in regulating valvular interstitial cell phenotype and nodule formation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (2), H448-H458 (2011).
- Rodriguez, K. J., Masters, K. S. Regulation of valvular interstitial cell calcification by components of the extracellular matrix. J Biomed Mater Res A. 90 (4), 1043-1053 (2009).
- Rattazzi, M., Iop, L., et al. Clones of interstitial cells from bovine aortic valve exhibit different calcifying potential when exposed to endotoxin and phosphate. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (12), 2165-2172 (2008).
- Zhu, D., Hadoke, P. W. F., et al. Ablation of the androgen receptor from vascular smooth muscle cells demonstrates a role for testosterone in vascular calcification. Sci Rep. 6 (April), 24807 (2016).
- Zhu, D., Mackenzie, N. C. W., Millan, J. L., Farquharson, C., Macrae, V. E. Upregulation of IGF2 expression during vascular calcification. J Mol Endocrinol. 52 (2), 77-85 (2014).
- Latif, N., Quillon, A., et al. Modulation of human valve interstitial cell phenotype and function using a fibroblast growth factor 2 formulation. PLoS ONE. 10 (6), (2015).
- Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. Am J Pathol. 171 (5), 1407-1418 (2007).
- Katwa, L. C., Ratajska, A., et al. Angiotensin converting enzyme and kininase-II-like activities in cultured valvular interstitial cells of the rat heart. Cardiovasc Res. 29 (1), 57-64 (1995).
- Shao, J. S., Cheng, S. L., Pingsterhaus, J. M., Charlton-Kachigian, N., Loewy, A. P., Towler, D. A. Msx2 promotes cardiovascular calcification by activating paracrine Wnt signals. J Clin Invest. 115, 1210-1220 (2005).
- Mackenzie, N. C. W., Zhu, D., Longley, L., Patterson, C. S., Kommareddy, S., MacRae, V. E. MOVAS-1 cell line: a new in vitro model of vascular calcification. Int J Mol Med. 27, 663-668 (2011).
- Kiffer-Moreira, T., Yadav, M. C., et al. Pharmacological inhibition of PHOSPHO1 suppresses vascular smooth muscle cell calcification. J Bone Miner Res. 28, 81-91 (2013).
- Cui, L., Rashdan, N. A., et al. End stage renal disease-induced hypercalcemia may promote aortic valve calcification via Annexin VI enrichment of valve interstitial cell derived-matrix vesicles. J Cell Physio. , (2017).
- Tsang, H., et al. Exploiting novel valve interstitial cell lines to study calcific aortic valve disease. Mol Med Rep. , (2017).
