Células intersticiales de la válvula de aislamiento y caracterización de rata principal: un nuevo modelo para el estudio de calcificación de la válvula aórtica

Todos los experimentos en animales fueron aprobados por el Comité de usuarios del Instituto Roslin el Animal y los animales se mantuvieron con arreglo a las directrices del Home Office (Reino Unido) para el cuidado y uso de animales. Para el protocolo que se describe a continuación, se utilizaron ratas Sprague Dawley de 5 – semanas de edad, hombres. 1. reactivo recetas Preparar el medio de cultivo utilizando de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) y mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12). Agregar 10% esterilizado inactivadas por calor suero bovino fetal (FBS) y gentamicina 1%. Preparar el medio de calcificación con medio de cultivo y 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi. Preparar 1 M cloruro de calcio (CaCl2) peso de 555 mg de CaCl2 y disolver en 5 mL de agua destilada para hacer 5 mL de 1 M de CaCl2. Filtrar la solución a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm para esterilizar la solución. Preparar 1 M fosfato de sodio por peso de fosfato de sodio dibásico anhidro 710 mg (Na2HPO4) y 600 mg de fosfato de sodio monobásico anhidro (NaH2PO4), cada uno por separado en 5 mL de agua de disolución agua. Combinar 3.870 μl de Na2HPO4 y 1.130 μl de NaH2PO4y el filtro a través de un filtros 0.22 μm para esterilizar la solución. Preparar el tampón de lavado que contiene gentamicina solución sal balanceada (HBSS) y 1% de Hank. 2. preparación de la campana de la disección Llevar a cabo todas las disecciones de una campana ventilada, previamente desinfectado con etanol al 70% para asegurar la esterilidad de las muestras y reactivos. Esterilice en autoclave que ellos seguidos de sumergir las puntas de las herramientas en un vaso de precipitados que contiene 70% etanol antes de utilizar los instrumentos de disección. Preparar vasos de precipitados que contiene el tampón de lavado y remojo las herramientas de disección en tampón de lavado antes de entrar en contacto con el animal o los tejidos. Mantener el tampón de lavado en el hielo en todo momento. 3. extracción de VICs rata primaria Nota: Para el protocolo que se describe a continuación, se utilizaron ratas Sprague Dawley de 5 – semanas de edad, hombres. Sacrificar las ratas (~ 100 g) por dislocación cervical, según las directrices del Reino Unido Ministerio del interior. Para diseccionar el corazón de cada rata, coloque el animal decúbito supino en una mesa de disección de vidrio y desinfectar la piel rociando con etanol al 70%. Haga una incisión de 4 cm en la línea media de la rata con la ayuda de tijeras de disección, para exponer la cavidad abdominal y retire con cuidado la caja torácica y los pulmones, para exponer el corazón. Quitar el corazón con un par de afiladas tijeras curvadas del resorte y almacenar el corazón disecado en tampón de lavado frío de hielo hasta que se completen todas las disecciones brutas de las ratas. Para micro-diseccionar cada corazón, transferencia de este último en un plato de Petri cubiertas en tampón de lavado. Recortar el músculo cardiaco con un par de tijeras rectas de primavera (hoja de 6 mm) que quedará con una pequeña área alrededor de la aorta ascendente y la raíz aórtica. Usando el mismo resorte tijera recta (hoja de 6 mm), con cuidado corte la aorta ascendente hacia el ventrículo izquierdo y exponer valvas de la válvula aórtica. Transferencia la aorta abierta en una placa Petri nueva y estéril llena de HBSS. Diseccionar a los prospectos de la válvula aórtica, marcados por su única forma de ‘U’ en la base de la aorta, con un par de micro-Tijera capsulotomia Vannas-tipo (hoja de 3 mm). Guarde los folletos en 1 mL de tampón de lavado frío de hielo, en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL hasta completas todas las disecciones. Una vez todos folletos han sido cosechados, los centrifugar a 100 x g durante 1 min a 4 ° C para eliminar el tampón de lavado. Realice los pasos siguientes en una campana de cultura de célula para asegurar la esterilización. Para quitar las VECs, digerir los folletos en 100 μl 425 U/mL colagenasa II por 5 min a 37 ° C. Interrumpir la digestión mediante pipeteo suavemente arriba y abajo utilizando una pipeta de 200 μl. Centrifugar a 100 x g por 30 s y los folletos de la pelotilla, descartar el sobrenadante cuidadosamente. Lavar dos veces con 500 μl de tampón de lavado y re-sedimenten las células por centrifugación a 100 x g durante 30 s. Para cosechar al VICs de los folletos, digerir con 100 μl de 425 colagenasa U/mL II para 2 h y luego suelte al VICs transfiriendo suavemente arriba y abajo utilizando una pipeta de 200 μl. Diluir la colagenasa II en 19 mL de medio de cultivo y centrifugue a 670 x g durante 5 minutos para que sedimenten los VICs y restantes desechos de prospecto de la válvula. Deseche el sobrenadante y transferir folletos y VICs a placas/frascos de cultivo por consiguiente (tabla 1). Cultura el VICs durante 5-7 días en medio de cultivo, hasta llega a confluencia a 37 ° C, en presencia de 5% (gas carbónico) CO2, cambiando el medio después de 72 h. Para su posterior utilización en experimentos en vitro , paso hasta 5 veces una vez que confluency alcanza el 100%. 4. inducción de la calcificación de rata VICs Nota: Para todos los experimentos, contar las células con un hemocitómetro. Realizar toda célula primaria siembra y pases en versión esterilizada para evitar la contaminación. Para preparar primaria rata VICs en vitro experimentos de calcificación, sembrar las células a una densidad de 150.000 células/pozo en placas de 6 pocillos. Mantener en medio de cultivo hasta confluencia ≥ 90% (por lo general de 72 h). Tratar al VICs con calcificación versus medio control e incubar a 37 ° C, en presencia de 5% CO2, para un adicional 72 h. Para estudiar la rata primaria calcificada VICs para posterior análisis aguas abajo, el medio de control calcificación Lave y monocapas con tampón de lavado para eliminar los iones de Ca y Pi no limite. 5. rata VIC caracterización Para que la inmunotinción monitorizar marcadores fenotípicos como el vimentin y el α-SMA, la semilla la rata VICs en una densidad de 150.000 células/pozo en placas de 6 pocillos que contienen cubreobjetos (las células se crecen en la superficie de la cubierta) y dejar crecer hasta el 50% de confluencia. Aspirar el medio de cultivo y se fijan las monocapas de células con paraformaldehído al 4% (PFA) durante 10 min antes de lavarlos 3 veces con tampón fosfato salino (PBS), durante 5 minutos cada vez.PRECAUCIÓN: PFA es tóxica y debe manipularse con cuidado. Incubar la monocapa de células con buffer de permeabilización y el bloqueo (PBS 1 x, 5% de suero normal de la misma especie que el anticuerpo secundario, 0.3% Tritón X-100) por 1 h a temperatura ambiente. Incubar las monocapas de células con anticuerpos de ratón anti-vimentina y conejo anti-α-SMA diluidos en tampón de dilución del anticuerpo (seroalbúmina bovina al 1% + 0.3% Tritón X-100 en PBS) durante la noche a 4 ° C, agitando suavemente en un eje de balancín.Nota: Controles negativos consisten en no ratón IgG y conejo IgG, usando las mismas diluciones que las muestras de prueba. Al día siguiente, lave los anticuerpos primarios 3 veces con PBS durante 5 minutos cada vez. Incubar las monocapas de células con anticuerpos secundarios conjugados fluoróforo por 1 h a temperatura ambiente, agitando suavemente en un eje de balancín. Lavar 3 veces con PBS y tweeze suavemente hacia fuera el cubreobjetos (que contienen rata VICs) con un par de pinzas y coloque sobre un cubreobjetos que contiene 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Dejo las diapositivas que curar durante por lo menos 24 h a 4 ° C antes de visualizarse con un microscopio de fluorescencia. Para el análisis de Western blot, la semilla la rata VICs en una densidad de 150.000 células/pozo en placas de 6 pocillos y dejan crecer en medio de cultivo hasta 100% confluente. Use 8 μg de proteína para ejecutar un Western blot para medir la expresión de CD31 y descartar cualquier contaminación de VEC.Nota: Un protocolo estándar de Western blot fue seguido como se describe previamente9. Estudios de genética, extracto de ácido ribonucleico (ARN) usando un kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante. Obtener cDNA mediante transcripción reversa para medir la expresión de genes de la blanco usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y PCR en tiempo real (RT-PCR; también conocido como qPCR) con detección de fluoróforo verde, uso de Gapdh como el gene de la referencia, anteriormente Describe10. Utilizar el siguiente programa para análisis de PCR: 1 ciclo de 94 º C por 3 min, 30 ciclos de 94 ° C por 30 s, 63 ° C por 30 s, 72 ° C por 35 s y finalmente 1 ciclo de 72 ° C durante 5 minutos. Utilizar el siguiente programa para el análisis de qPCR: 1 ciclo de 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 1 minuto y un ciclo adicional de 95 ° C por 1 min, 55 ° C para 30 s y 95 ° C para 30 s. Ejecute una electroforesis en gel para analizar los productos PCR utilizando un gel de agarosa al 2% en buffer borato/Tris/EDTA (TBE). 6. rata VIC calcificación estudios Para rojo de alizarina S y estudios bioquímicos de la calcificación, siga sembrando y la calcificación descrita en la sección 4. Mancha de las monocapas de células con solución al 5% rojo de alizarina S, mecerse suavemente en una coctelera, por 20 min. Posteriormente Lave 3 veces con agua destilada, durante 5 minutos cada vez. Adquirir imágenes de cada pozo. Para cuantificar la deposición de Ca, utilice un kit de análisis bioquímico de Ca. Lixiviación de iones de Ca2 + con 0,6 M de ácido clorhídrico (HCl) por 24 h a 4 ° C, con agitación suave. Recoger el sobrenadante y medir la concentración de Ca usando un análisis de la Ca del kit (véase Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante. Calcular la concentración de calcio como una fracción de proteína celular total. Desnaturalizar las proteínas celulares de las monocapas de células con hidróxido de sodio de 0,1 M (NaOH) + sulfato dodecyl de sodio 0.1% (SDS). Determinar la concentración de proteína total usando un detergente compatible (DC) proteína análisis siguiendo las instrucciones del fabricante.