Isolamento e caracterização de rato primário válvula células intersticiais: um novo modelo para estudar a calcificação da válvula aórtica

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de usuários do Instituto Roslin o Animal, e os animais foram mantidos em conformidade com diretrizes do Home Office (Reino Unido) para o cuidado e o uso de animais. Para o protocolo descrito abaixo, foram usados ratos Sprague Dawley de 5 – semana de idade, do sexo masculinos. 1. reagente receitas Prepare o meio de cultura usando de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) e mistura de nutrientes F-12 (DMEM/F12). Adicione 10% esterilizado inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) e gentamicina 1%. Prepare o meio de calcificação usando meio de cultura e 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi. Prepare-se 1 M de cloreto de cálcio (CaCl2) pesando fora 555 mg de CaCl2 e dissolvendo-o em 5 mL de água destilada para completar 5 mL de 1 M CaCl2. Filtre a solução através de um filtro de seringa 0,22 µm para esterilizar a solução. Prepare-se 1 M de fosfato de sódio por pesagem 710 mg anidro fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4) e 600 mg de fosfato de sódio monobásico anidro (NaH2PO4), dissolvendo cada um separadamente em 5 mL de água destilada água. Combine 3.870 µ l de Na2HPO4 e 1.130 µ l de NaH2PO4e filtro através de um filtro de seringa 0,22 µm para esterilizar a solução. Prepare o tampão de lavagem contendo gentamicina solução sal equilibrado (HBSS) e 1% de Hank. 2. preparação do exaustor de dissecação Realize todas as dissecções em uma campânula ventilada, previamente desinfectada com álcool 70% para garantir a esterilidade das amostras e reagentes. Esterilize instrumentos de dissecação por autoclave-los seguidos por imersão as dicas das ferramentas em um béquer contendo antes de etanol 70% de usar. Preparar o béquer contendo tampão de lavagem e mergulhe os instrumentos de dissecação em tampão de lavagem antes de entrar em contacto com o animal ou tecidos. Mantenha o tampão de lavagem no gelo em todos os momentos. 3. extração de rato primária das vítimas Nota: Para o protocolo descrito abaixo, foram usados ratos Sprague Dawley de 5 – semana de idade, do sexo masculinos. Abater os ratos (~ 100 g) por deslocamento cervical em conformidade com diretrizes de UK Home Office. Para dissecar o coração de cada rato, coloque o animal em decúbito dorsal em um tabuleiro de dissecação de vidro e desinfectar a pele por pulverização com etanol a 70%. Faça uma incisão de 4 cm na linha média do rato com o auxílio de tesouras de dissecação, para expor a cavidade abdominal e remova cuidadosamente a caixa torácica e os pulmões, para expor o coração. Remover o coração com um par de afiada, tesoura curva de primavera e armazenar o coração dissecado em tampão de lavagem frio de gelo até que todas as dissecções brutas dos ratos estão completas. Para microdissecar cada coração, transferência, este último em um prato de Petri coberto de tampão de lavagem. Guarnição do músculo cardíaco com uma tesoura reta Primavera (lâmina de 6 mm) para ficar com uma pequena área em torno da aorta ascendente e a raiz da aorta. Usando a mesma mola tesoura reta (lâmina de 6 mm), cuidadosamente aberto a aorta ascendente para o ventrículo esquerdo e expor os folhetos da válvula aórtica. Transferência da aorta aberta em uma placa de Petri estéril, fresco cheio de HBSS. Disse o folhetos da válvula aórtica, marcado pela sua única forma de ‘U’ na base da aorta, com um par de capsulotomia Vannas-tipo micro tesoura (lâmina de 3 mm). Armazene todos os folhetos em 1 mL de tampão de lavagem frio do gelo, em um tubo de microcentrifuga de 1,5 mL até todas as dissecções são completas. Uma vez que todos os folhetos foram colhidos, centrifugá-los a 100 x g por 1 min a 4 ° C para remover o tampão de lavagem. Execute as etapas subsequentes em uma capa de cultura celular para garantir a esterilização. Para remover os VECs, digerir os folhetos em 100 µ l 425 U/mL colagenase II por 5 min a 37 ° C. Perturbar a digestão pipetando delicadamente acima e para baixo usando a ponta da pipeta 200 µ l. Centrifugar 100 x g por 30 s para os folhetos de pelotas e descartar o sobrenadante cuidadosamente. Lave duas vezes com tampão de lavagem 500 µ l e re-pelota as células por centrifugação a 100 x g durante 30 s. Para colher as vítimas de folhetos, digerir com 100 µ l de 425 colagenase U/mL II para 2 h e depois solte as vítimas pipetando delicadamente acima e para baixo usando a ponta da pipeta 200 µ l. Dilua a colagenase II em 19 mL de meio de cultura e centrifugar a 670 x g por 5 min para as vítimas e restantes detritos de folheto da válvula de Pelotas. Descartar o sobrenadante e transferir folhetos e vítimas para placas/frascos de cultura em conformidade (tabela 1). Cultura das vítimas por 5-7 dias em meio de cultura, até confluência é alcançada a 37 ° C, na presença de 5% (dióxido de carbono) CO2, alterando o meio após 72 h. Para posterior utilização em experimentos em vitro , passagem até 5 vezes depois de confluencia atinge 100%. 4. indução de calcificação das vítimas de rato Nota: Para todos os experimentos, conte células com um hemocytometer. Execute todas as célula primária de semeação e de passagem em capas esterilizadas para evitar a contaminação. Para preparar rato primário das vítimas em vitro experiências de calcificação, propagar as células em uma densidade de 150.000 células/poço em placas 6-boas. Manter-se em meio de cultura até confluência ≥ 90% (tipicamente 72 h). Tratar as vítimas com calcificação versus meio de controle e incubar a 37 ° C, na presença de 5% CO2, para um adicional 72 h. Para estudar o rato primário calcificado VICs para posteriores análises a jusante, retire o meio de calcificação/controle e lave as monocamadas com tampão de lavagem para remover íons de Ca e Pi vinculados. 5. rato VIC caracterização Para imunocoloração monitorar para marcadores fenotípicos tais como vimentina e α-SMA, o rato vítimas em uma densidade de 150.000 células/poço no poço 6-placas de sementes contendo lamínulas (células vão crescer na superfície das lamínulas) e deixe crescer até a confluência de 50%. Aspire o meio de cultura e corrigir as monocamadas de células com paraformaldeído 4% (PFA) durante 10 minutos antes de lavá-los 3 vezes com solução salina tamponada fosfato (PBS), por 5 min cada tempo.Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado. Incubar a monocamada de células com bloqueio e permeabilização de buffer (1X PBS, 5% de soro normal da mesma espécie que o anticorpo secundário, 0,3% Triton X-100) por 1h à temperatura ambiente. Incubar as monocamadas de células com anticorpos do rato do anti-α-SMA antivimentina e coelho que diluído em tampão de diluição de anticorpo (albumina de soro bovino 1% + 0,3% Triton X-100 em PBS) durante a noite a 4 ° C, agitando suavemente sobre um roqueiro.Nota: Controlos negativos consistiam em não conjugada mouse IgG e IgG, usando as mesmas diluições como as amostras de teste de coelho. No dia seguinte, lave os anticorpos primários 3 vezes com PBS, por 5 min cada tempo. Incube as monocamadas de células com anticorpos secundarios conjugados fluoróforo por 1h à temperatura ambiente, agitando suavemente sobre um roqueiro. Lavar 3 vezes com PBS e tweeze suavemente para fora as lamelas (que contêm o rato VICs) com um par de pinças e coloque sobre uma lamela contendo 4′ 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Deixe os slides para curar pelo menos 24 h a 4 ° C antes de Visualizar com um microscópio de fluorescência. Para a análise ocidental do borrão, propagar o rato vítimas em uma densidade de 150.000 células/poço no poço 6-placas e deixar crescer em meio de cultura até 100% confluentes. Use 8 µ g de proteína para executar um Western blot para medir a expressão do CD31 e descartar qualquer contaminação de VEC.Nota: Um protocolo padrão ocidental do borrão foi seguido conforme descrito anteriormente,9. Para estudos de gene, extrair o ácido ribonucleico (RNA), usando um kit comercial, seguindo as orientações do fabricante. Obter o cDNA usando a transcrição reversa para medir a expressão dos genes-alvo utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) e PCR em tempo real (RT-PCR, também conhecida como qPCR) com detecção de fluoróforo verde, utilizando Gapdh como o gene de referência, como anteriormente descreveu a10. Use o seguinte programa para análise PCR: 1 ciclo de 94 ° C por 3 min, 30 ciclos de 94 ° C por 30 s, 63 ° C por 30 s, 72 ° C por 35 s e finalmente 1 ciclo de 72 ° C por 5 min. Use o seguinte programa para análise de qPCR: 1 ciclo de 95 ° C por 10 min, 40 ciclos de 95 ° C por 15 s, 60 ° C por 1 min e um ciclo adicional de 95 ° C por 1 min, a 55 ° C por 30 s e 95 ° C por 30 s. Execute uma eletroforese em gel para analisar os produtos de PCR usando um gel de agarose 2% em tampão Tris/borato/EDTA (TBE). 6. rato VIC calcificação estudos Por alizarina Red S e estudos bioquímicos de calcificação, siga a propagação e a calcificação diretrizes descritas na seção 4. Mancha as monocamadas de células com solução a 5% de vermelho de alizarina S, agite-o suavemente em uma coqueteleira, por 20 min. Posteriormente, lave 3 vezes com água destilada, por 5 min cada tempo. Adquira imagens de cada poço. Para quantificar a deposição de Ca, utilize um kit de ensaio Ca bioquímico. Lixiviação de íons Ca2 + usando 0,6 M o ácido clorídrico (HCl) por 24 h a 4 ° C, com agitação suave. Colher o sobrenadante e medida a concentração de Ca usando um ensaio de Ca kit (veja a Tabela de materiais) seguindo as orientações do fabricante. Calcule a concentração de cálcio como uma fração da proteína celular total. Desnature proteínas celulares desde as monocamadas de células com 0,1 M de hidróxido de sódio (NaOH) + 0,1% sulfato dodecyl de sódio (SDS). Determine a concentração de proteína total usando um detergente compatível (DC) proteína ensaio seguindo as orientações do fabricante.